專利名稱：一株鏈霉菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及鏈霉菌NK49及其用于生產具有抗菌活性的氨基酸均聚物￡ -聚賴氨酸的用途和方法。
背景技術：
e -聚賴氨酸(e -Poly-L-Lysine, e -PL)是一種由25-30個L-賴氨酸單體通過
e -氨基和a -羧基脫水縮合形成的同型單體聚合物多肽，其結構式為
NH2
H--HnzXvZNvZaNcO--OII
_J ne-聚賴氨酸常常由放線菌產生，對于革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和真菌具有廣譜的抑菌活性，并且能夠承食品加工過程中的熱處理，可隨食品原料一同處理并加工。e -聚賴氨酸已經被FDA批準可作為食品防腐。e -聚賴氨酸安全性高、水溶性強、在人體內可分解為人體必需的氨基酸賴氨酸，是一種營養型防腐劑。我國e-聚賴氨酸的生產能力和水平較低，不能滿足人們日益增長生活水平的需要。究其原因在于缺少e-聚賴氨酸合成能力強的具有知識產權的微生物菌種。因此，開展微生物法合成e-PL的研究，分離新的合成能力高的菌株，優化e -聚賴氨酸發酵和分離與精制的方法，具有重要的理論意義和廣闊的應用前景。
發明內容
本發明的目的之一是提供一株具有較強e-聚賴氨酸生產能力的鏈霉菌Streptomyces sp.NK49。本發明用于生產e-聚賴氨酸的鏈霉菌NK49，分離自遼寧省沈陽地區地的農田土壤。菌株的16SrDNA序列分析利用16SrDNA通用引物，得到16SrDNA序列長度為1491bp ;其16SrDNA序列在GenBank中進行同源性比對后發現，該菌株與鏈霉菌屬具有100%同源性,結果顯示該菌株屬于鏈霉菌屬,命名為鏈霉菌Streptomyces sp.。鏈霉菌Sti^ptomyces sp. NK49的形態特征為在貝納特斜面上生長時初期呈凸起裝半球形白色菌落，形成的菌絲將菌落牢牢固定在培養基上，不易挑起，菌落生長初期呈白色，且具有放射狀褶皺，后期孢子逐漸成熟，菌落表面被灰黑色孢子覆蓋。菌體光鏡下呈絲狀，分生孢子絲呈螺旋狀，孢子橢圓形。該菌株于2012年3月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為=CGMCC No 5932。
鏈霉菌Streptomyces sp. NK49發酵培養特征為在利用碳水化合物進行發酵過
程中會產酸。
菌種的保藏條件為將孢子利用脫脂牛奶保護后真空干燥長期保藏，或制備砂土管對孢子進行保藏；該菌平時保藏于貝納特斜面上，便于直接應用。本發明的第二個目的是提供鏈霉菌Streptomyces sp.NK49用于生產e _聚賴氨酸的發酵培養方法。為實現這一目的，本發明采取以下技術方案和操作步驟(I)將保存于貝納特斜面上的鏈霉菌Streptomyces sp. NK49,挑取一環孢子接種在高氏一號培養基中作為種子進行活化培養20_36h ；(2)將種子液以5-15%的接種量接種至以淀粉水解糖或淀粉水解糖與甘油為碳源的合成培養基中，搖瓶發酵培養48-96h ；(3)發酵結束后，發酵液6000 IOOOOrpm離心處理10 20min去除菌體，收集上清，利用5M NaOH溶液將上清調整pH至8，過濾祛除沉淀的雜蛋白；(4)利用弱酸型陽離子交換樹脂吸附去除了雜蛋白的上清液中的e -聚賴氨酸分子，蒸餾水洗滌；利用0. 1-0. 7mol/L的稀鹽酸洗脫吸附的產物，洗脫液利用5M NaOH溶液將pH調整到中性；(5)將中性的洗脫液進行透析，去除小分子雜質，冷凍干燥，得到e -聚賴氨酸固體粉末；(6)利用HPLC對產物水解液進行測定，利用1HNMR和13CNMR對產物進行結構分析，利用MODI-TOF MS對產物聚合度和分子量進行測定。與現有￡-聚賴氨酸生產菌株相比較，本菌株合成聚賴氨酸能力較強、生長周期較短，且能利用淀粉糖或其水解糖，具有規模進一步利用的潛力。賴氨酸產品的潛力。
具體實施例方式在下面的實施例中所用菌種均為鏈霉菌Streptomyces sp. NK49,實施例中所用各種培養基及溶液、試劑配方如下(I) 土壤稀釋液(/L) =NaH2PO4 2H20 12. 17g，蛋白胨 60g，SDS 0. 5g ；(2)初篩培養基平板(SGB平板)SG平板中添加0. 002%的亞甲基藍。(3) Dragendoff試劑溶液I與溶液2各取5ml置于IOOml棕色容量瓶中，蒸餾水定容至100ml,配制完成后使用有效期為半年；其中，溶液I :0. 8g五水硝酸秘溶于40ml蒸餾水和IOml冰乙酸的混合液中；溶液2 :8. Og碘化鉀溶于20ml蒸餾水中。(4)貝納特斜面培養基(/L):葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉lg，瓊脂15g，pH 7. 0 ；121°C 滅菌 20min。(5)高氏一號培養基(/L):可溶性淀粉 20，KNO3 1，MgSO4 7H20 0. 5，NaCl 0. 5，K2HPO4 0. 5，Fe2(SO4)3 0. 01, pH 7. 4，121°C滅菌 20min。(6)淀粉水解糖合成培養基(/L) (NH4)2SO4 IOg,淀粉糖50g，酵母粉5g，KH2PO4
I.36g, K2HPO4 3H20 0. 8g, MgSO4 7H20 0. 5g, ZnSO4 7H20 0. 04g, FeSO4 7H20 0. 03g, NaOH調節 pH 至 7. 0,115°C滅菌 30min。(7)淀粉水解糖和甘油混合碳源發酵培養基(/L) : (NH4)2SO4 10g，甘油25g，淀粉糖 25g,酵母粉 5g, KH2PO4 I. 36g, K2HPO4 3H20 0. 8g, MgSO4 7H200. 5g, ZnSO4 7H20 0. 04g,FeSO4 7H20 0. 03g, NaOH 調節 pH 至 7. 0，115°C滅菌 30min。實施例I、分離鑒定鏈霉菌Streptomyces sp. NK49實驗材料來自于遼寧省沈陽地區農田土壤，具體步驟如下將取來的新鮮土樣放置于陰涼干燥處3天，后使用15%碳酸鈣混合均勻，再次置于陰涼處自然通風干燥8天。取干燥過篩后的土樣Ig與9ml用于稀釋土壤的稀釋液振蕩混勻，取上清梯度稀釋，分別將稀釋100倍和1000倍的上清液涂布于添加了 50mg/L K2Cr2O7的高氏一號培養基平板用于e -聚賴氨酸生產菌種的分離；培養7天后挑選表面干燥致密的放線菌菌落，平板劃線到不含K2Cr2O7高氏一號培養基平板純化菌落，后挑取獨立菌落，接種于SG液體培養基試管中，37°C恒溫培養7天，再將團狀菌落，挑取接于SGB培養基平板上，培養5天后陽性菌落就會在SGB平板上出現顏料排斥圈；再取陽性反應的菌株原有的SG培養基，上清中滴入Dragendoff試劑進行復篩，以確定生產e -聚賴氨酸的菌株。經過16SrDNA基因序列分析，并參考伯杰氏手冊之后，鑒定該菌株為鏈霉菌，命名為鏈霉菌Streptomyces sp. NK49,該菌株 16SrDNAGenBank 注冊號為JQ768941。進一步構建該菌株的進化樹，如圖I鏈霉菌Streptomyces sp. NK49進化樹所示。實施例2、淀粉水解糖作為單一碳源的搖瓶法培養將保存于貝納特斜面上的鏈霉菌Streptomyces sp. NK49上挑取一環孢子接種到含IOOml種子培養基高氏一號培養基的500ml錐形瓶中，30°C，180rpm活化培養，活化24h ；將活化種子培養物以10%接種量接種至高氏一號培養基中(搖瓶發酵時采用500ml錐形瓶，裝液量為100ml)作為種子液30°C，180rpm培養24h ;將種子液以15%的接種量分別接種于10瓶淀粉水解糖合成培養基中(搖瓶發酵時采用500ml錐形瓶，裝液量為100ml)進行發酵30°C, 180rpm培養80h ;發酵結束后,培養物進行離心8000rpm離心處理20min,棄去菌體，收集上清；將上清利用D152弱酸型的陽離子交換樹脂進行產物吸附，將e -聚賴氨酸分子吸附在樹脂上；棄去吸附過后的上清，利用蒸餾水洗滌樹脂，洗去未吸附的雜志；利用
0.2mol/L的稀鹽酸洗脫吸附的產物，洗脫液利用6M的NaOH溶液將pH調節到中性；取洗脫液，冷凍干燥濃縮，濃縮液利用透過量IOOODa的透析袋進行處理，祛除無機鹽離子，透析液凍干后得到e -聚賴氨酸固體產物。e -聚賴氨酸產量為0. 8-1. 9g/L。進一步利用1NMI^13C NMR進行結構檢測，采用MODI-TOF MS對產物聚合度和分子量進行測定。如圖2產物的MODI-TOF MS檢測結果圖。實施例3、以淀粉水解糖和甘油作為混合碳源的搖瓶法培養(I)將保存于貝納特斜面上的鏈霉菌Streptomyces sp. NK49上挑取一環孢子接種到含IOOml種子培養基高氏一號培養基的500ml錐形瓶中，30°C，180rpm活化培養，活化24h;將活化種子培養物以10%接種量接種至高氏一號培養基中(搖瓶發酵時采用500ml錐形瓶，裝液量為100ml)作為種子液30°C，180rpm培養24h ;將種子液以15%的接種量分別接種于10瓶淀粉水解糖與甘油合成培養基中(搖瓶發酵時采用500ml錐形瓶，裝液量為100ml)作為種子液30 °C, 180rpm培養96h ;發酵結束后，培養物進行離心8000rpm離心處理20min，棄去菌體，收集上清；將上清利用D152弱酸型的陽離子交換樹脂進行產物吸附，將e -聚賴氨酸分子吸附在樹脂上；棄去吸附過后的上清，利用蒸餾水洗滌樹脂，洗去未吸 附的雜志；利用0. 2mol/L的稀鹽酸洗脫吸附的產物，洗脫液利用6M的NaOH溶液將pH調節到中性； 取洗脫液，冷凍干燥濃縮，濃縮液利用透過量IOOODa的透析袋進行處理，祛除無機鹽離子，透析液凍干后得到e -聚賴氨酸固體產物。e -聚賴氨酸產量為0. 8-2. 4g/L。
權利要求
1.鏈霉菌Streptomyces sp. NK49 CGMCC No. 5932 ；
2.鏈霉菌Streptomycessp. NK49用于生產e _聚賴氨酸的發酵培養方法,包括如下操作步驟 (1)將保存于貝納特斜面上的鏈霉菌Streptomycessp. NK49,挑取一環孢子接種在高氏一號培養基中作為種子進行活化培養20-36h ； (2)將種子液以5-15%的接種量接種至以淀粉水解糖或淀粉水解糖與甘油為碳源的合成培養基中，搖瓶發酵培養48-96h ； (3)發酵結束后，發酵液6000 IOOOOrpm離心處理10 20min去除菌體，收集上清，利用5MNa0H溶液將上清調整pH至8，過濾祛除沉淀的雜蛋白； (4)利用弱酸型陽離子交換樹脂吸附去除了雜蛋白的上清液中的e-聚賴氨酸分子，蒸餾水洗滌；利用0. 1-0. 7mol/L的稀鹽酸洗脫吸附的產物，洗脫液利用5M NaOH溶液將pH調整到中性； (5)將中性的洗脫液進行透析，去除小分子雜質，冷凍干燥，得到e-聚賴氨酸固體粉末； (6)利用HPLC對產物水解液進行測定，利用1HNMR和13CNMR對產物進行結構分析，利用MODI-TOF MS對產物聚合度和分子量進行測定。
全文摘要
本發明公開了一株鏈霉菌Streptomyces sp.NK-49及其應用，即利用該菌生產ε-聚賴氨酸的發酵培養和產物分離純化的方法。該方法包括以下步驟首先將保存于貝納特斜面上的鏈霉菌Streptomyces sp.NK49，挑取一環孢子接種在高氏一號培養基中作為種子進行活化培養20-36h；將種子液以5-15％的接種量接種至以淀粉水解糖或淀粉水解糖與甘油為碳源的合成培養基中，搖瓶發酵培養48-96h；發酵結束后，發酵液6000～10000rpm離心處理10～20min去除菌體，收集上清，利用5M NaOH溶液將上清調整pH至8，過濾祛除沉淀的雜蛋白；利用弱酸型陽離子交換樹脂吸附去除了雜蛋白的上清液中的ε-聚賴氨酸分子，蒸餾水洗滌；利用0.1-0.7mol/L的稀鹽酸洗脫吸附的產物，洗脫液利用5M NaOH溶液將pH調整到中性；將中性的洗脫液進行透析，去除小分子雜質，冷凍干燥，得到ε-聚賴氨酸固體粉末；本發明中分離到的鏈霉菌Streptomyces sp.NK49，具有工業化生產ε-聚賴氨酸的潛力。
文檔編號C12N1/20GK102618465SQ20121008168
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月26日 優先權日2012年3月26日
發明者宋存江, 李毅翔, 楊超, 王曉萌, 王淑芳, 耿偉濤, 謝晨庚, 趙若竹 申請人:南開大學