專利名稱：在絲狀真菌中表達人重鏈抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及人免疫球蛋白重鏈蛋白質及其片段在絲狀真菌中的表達。
背景技術：
抗體作為治療劑的用途成而為焦點已有數十年了。與此同時，許多關注聚焦于抗體的產生。如今，在哺乳動物細胞中表達治療性抗體，這既困難又昂貴。因為微生物具有巨大的表達潛能并且易于操縱，所以已經有很多嘗試在微生物中表達抗體。
然而，已證明在這些生物中表達抗體是困難的，特別是因為抗體由兩種蛋白質(重鏈和輕鏈)組成。最近發現駱駝科(Camelidae)表達一種只由重鏈蛋白質組成的抗體類型。但是，這種的類型抗體具有同正常抗體相同程度的親和力。這是因為重鏈上的可變區比較大。已經證明這類抗體中的一些可以在酵母或霉菌中表達，如見WO 94/25591。
除了其中一個可變區稍微大一些以外，駱駝科的重鏈蛋白質與人重鏈蛋白質十分同源。
為了解決人抗體在非哺乳動物表達系統中有效表達這一難題，我們尋找了其它適宜的生物，該生物可以表達人抗體，從而產生只含有修飾重鏈的功能性抗體。
發明概述我們驚奇地發現可以通過在絲狀真菌(例如曲霉屬(Aspergillus))中僅表達人抗體重鏈來得到功能性人抗體或人抗體片段。此外，可以在絲狀真菌(例如曲霉屬)中有效表達功能性修飾的重鏈人抗體或人重鏈蛋白質的片段，并且可通過在通常與輕鏈相聯系的區域引入適當的突變來解決人重鏈蛋白質的低溶解性問題。
本發明涉及產生功能性人免疫球蛋白的方法，其中表達缺乏任何輕鏈的人重鏈免疫球蛋白，該方法包括步驟a)用編碼修飾的人重鏈免疫球蛋白的重組構建體轉化絲狀宿主細胞，其中修飾包括參與聯系輕鏈的重鏈蛋白質區域的一個或多個突變；b)在促進表達所述修飾的人重鏈免疫球蛋白的條件下培養所述絲狀宿主細胞；并且c)回收所述修飾的人重鏈免疫球蛋白。
定義在討論本發明的詳細實施方案之前，提供了涉及本發明主要方面的特定術語的定義。
功能性免疫球蛋白術語“功能性免疫球蛋白”定義為一種免疫球蛋白，盡管它只包含重鏈蛋白質或其部分，但它保留著能夠與靶抗原結合和/或激活免疫系統的功能。
修飾的免疫球蛋白術語“修飾的免疫球蛋白”其中替代、缺失或添加/插入一個或多個氨基酸的免疫球蛋白。具體而言，修飾包括在正常的人免疫球蛋白中參與重鏈和輕鏈相聯系的氨基酸，這種聯系被認為影響免疫球蛋白的可溶性。在另一個實施方案中，修飾包括在正常的人免疫球蛋白中參與重鏈和抗原相接觸的氨基酸，該種修飾影響免疫球蛋白的特異性。
功能等效術語“功能等效殘基”定義為參與所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈相聯系的氨基酸殘基。
突變術語“突變”定義為替代、缺失或插入。
發明詳述本發明的的之一是提供在絲狀真菌中產生修飾的人抗體的有效方法，在該方法中只有重鏈蛋白質被表達，并且抗體仍保留功能活性。
在本發明的一個實施方案中，通過將編碼修飾的免疫球蛋白的DNA序列插入到適當的表達載體，并將所述重組載體導入絲狀真菌宿主細胞，產生了修飾的人重鏈免疫球蛋白或其片段，此片段可能是如重鏈蛋白質的可變區。然后在促進人免疫球蛋白重鏈表達的條件下培養絲狀真菌宿主細胞。接著，應用本領域眾所周知的方法回收并純化產生免疫球蛋白。
在一個特定的實施方案中，人重鏈免疫球蛋白或修飾的人重鏈免疫球蛋白至少包含可變區和Fc受體識別的Fc區。
在進一步的實施方案中，人重鏈免疫球蛋白或修飾的人重鏈免疫球蛋白至少包含可變區。
在進一步的實施方案中，可變區包含SEQ ID NO 1所示的肽序列。
在進一步的實施方案中，可變區由SEQ ID NO 1所示的肽序列組成。
引入到修飾的人重鏈免疫球蛋白的修飾包括重鏈蛋白質中參與聯系輕鏈的區域的突變。
在一個特定的實施方案中，所述修飾導致修飾人重鏈免疫球蛋白的溶解性提高(Reichmann(1996)Journal of molecular Biology 259卷957-969頁)。
因此在進一步的實施方案中，人免疫球蛋白的完整重鏈可變結構域或其至少包括可變區或者至少包括可變區和Fc區的片段的修飾包括重鏈人免疫球蛋白中參與聯系輕鏈的區域的突變。
在可變區中涉及到上面提到的重鏈和輕鏈相聯系的可能的殘基在下面以及使用人免疫球蛋白重鏈可變區結構域的實例——赫賽汀(Herceptin)，(在WO01/15730A1中公開)中有所例舉，并且涉及SEQ ID NO.1中所示的肽序列的如下位置V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109。
人免疫球蛋白(及赫賽汀)中的重鏈可變結構域(SEQ ID NO.1)evqlvesggglvqpggslrlscaasgftftdytmdwvrqapgkglewvadvnpnsggsiynqrfkgrftlsvdrskntlylqmnslraedtavyycarnlgpsfyfdywgqgtlvtvss。
SEQ ID NO.1所示的肽序列由人免疫球蛋白(及赫賽汀)的重鏈可變結構域組成，但是至于其它的人重鏈可變區，參與所述聯系的殘基可能具有不同的位置，只要殘基是功能等效物。
在本發明還有的實施方案中，本發明的修飾包括重鏈蛋白質中涉及與輕鏈相聯系的區域的突變，所述突變包括SEQ ID NO 1中V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109任一殘基的突變，所述序列代表人免疫球蛋白(及赫賽汀)的重鏈可變結構域或者在其它人重鏈免疫球蛋白中以功能等效殘基的突變種。
通過用本領域已知的計算機程序，例如使用默認設置的Blast(BLASTP 2.1.2(參考文獻Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Schaffer，Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller和DavidJ.Lipman(1997)，“缺口BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白質數據庫搜索程序”，Nucleic Acids Res.253389-3402.))或者使用默認設置的FastaP(3.3t08版本，W.R.Pearson & D.J.Lipman PNAS(1988)852444-2448)，進行同源性搜索和比對，可以在其它重鏈可變結構域中鑒別上述位點。
默認設置指示如下blastall參數-p程序名稱[字符串]-d數據庫[字符串]默認值＝nr-i查詢文件[輸入]默認值＝stdin-e期望閾值(E)[實數]默認值＝10.0-m比對結果視圖選項0＝配對方式，1＝顯示同一性的查詢錨定，2＝沒有同一性的查詢錨定，3＝顯示同一性的平面查詢錨定(flat query-anchored)，4＝沒有同一性的平面查詢錨定，5＝沒有同一性和鈍末端的查詢錨定，
6＝沒有同一性和鈍末端的平面查詢錨定，7＝XML Blast輸出[整數]默認值＝0-o BLAST報告輸出文件[輸出]可選默認值＝stdout-F過濾查詢序列(DUST使用blastn，SEG使用其它)[字符串]默認值＝T-G打開空位的代價(零調用默認值行為)[整數]默認值＝0-E延長空位的代價(零調用默認值行為)[整數]默認值＝0-X接受空位比對的X跌落值(bits)(零調用默認值行為)[整數]默認值＝0-I在定義中顯示Gl′s[T/F]默認值＝F-q核苷酸錯配的罰分(只用于blastn)[整數]默認值＝-3-r核苷酸錯配的加分(只用于blastn)[整數]默認值＝i-v對于(V)單行描述顯示的數據庫序列的數目[整數]默認值＝500-b對于(B)比對顯示的數據庫序列的數目[整數]默認值＝250-f擴展采樣數的閾值，如果為零則是默認值[整數]默認值＝0-g執行接受空位的比對(對于tblastx不可用)[T/F]默認值＝T-Q查詢使用的遺傳密碼[整數]
默認值＝1-D DB遺傳密碼(只對tblast[nx])[整數]默認值＝1-a可用處理器的數目[整數]默認值＝1-O SeqAlign文件[輸出]可選-J信任查詢定義[T/F]默認值＝F-M矩陣[字符串]默認值＝BLOSUM62-W字大小，為零時使用默認值[整數]默認值＝0-z數據庫的有效長度(對于真實大小使用零)[實數]默認值＝0-K從保留的區域最佳匹配點的數目(默認值為關，如果使用推薦值為100)[整數]默認值＝0-P對于0為多次采樣點1-遍，對于1為單次采樣點1-遍，對于2為2-遍[整數]默認值＝0-Y搜索空間的有效長度(對于真實大小使用零)[實數]默認值＝0-S搜索數據庫時的查詢鏈(對于blast[nx]和tblastx).3是兩條鏈，1是top鏈，2是bottom鏈[整數]默認值＝3-T產生HTML輸出[T/F]默認值＝F-I為了列出GI′s對數據庫進行限制性搜索[字符串]可選
-U使用小寫字體過濾FASTA序列[T/F]可選默認值＝F-y使用bit的對于blast擴展的跌落值(X)(0.0調用默認值行為)[實數]默認值＝0.0-Z對于最終接受空位比對的跌落值X(bit)[整數]默認值＝0上面給出的涉及SEQ ID NO.1的殘基和位置是野生型殘基。
在另一個實施方案中，修飾包括增加與抗原結合特異性和結合親和力的氨基酸。此種修飾包括在正常的人免疫球蛋白中參與重鏈和抗原接觸的氨基酸。所述氨基酸包括Seq ID No.1中27-35、50-57和99-108位置所包含的殘基，該序列代表人免疫球蛋白(及赫賽汀)重鏈可變結構域或者其它人重鏈免疫球蛋白的功能等效位置。通過標準的噬菌體展示技術(Wandersee NJ；Sillah NM；Watkins NA；Scott JP；Ouwehand WH；Hillery CA Blood，第98卷(11第1部分)484a頁(2001)Azzazy HME；Highsmith Jr WE Clinical Biochemistry，35(6)卷425-445頁(2002)，(165篇參考文獻))可以鑒定這些修飾，由此可以對特異性和結合親和力進行測試。
因此，在本發明還有的實施方案中涉及根據發明的方法，其中修飾包括在涉及與抗原接觸的人可變重鏈免疫球蛋白區域中的突變，所述突變包括SEQ ID NO 1中27-35、50-57和99-108位置任一殘基的突變，所述序列代表人免疫球蛋白(及赫賽汀)的重鏈可變結構域或者其它人重鏈免疫球蛋白中的功能等效殘基的突變。
核酸構建體本發明還涉及含有與一個或多個控制序列有效連接的本發明核苷酸序列的核酸構建體，所述控制序列在與控制序列兼容的條件下指導編碼序列在適當的宿主細胞內表達。
可以以多種方式操作編碼本發明多肽的核苷酸序列，以便提供多肽的表達。插入載體前的核苷酸序列的操作可能是需要的或者是必要的，這取決于表達載體。利用重組DNA方法來修飾核苷酸序列的技術是本領域眾所周知的。
控制序列可以是適當的啟動子序列，即可以被宿主細胞識別用于表達核苷酸序列的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在所選擇的宿主細胞內表現出轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變、截短和雜合啟動子，并且可以從編碼細胞外或者細胞內的與宿主細胞同源或者異源的的多肽的基因得到。
用于指導本發明核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞內轉錄的適當啟動子的實例有從米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩定α-淀粉酶、黑曲霉或者泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶和尖鐮孢(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)基因得到的啟動子，以及NA2-tpi啟動子(從黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構酶得到的雜合啟動子)和它們的突變、截短和雜合啟動子。
對于絲狀真菌宿主細胞，優選的終止子是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因得到的終止子。
控制序列還可以是適宜的前導序列、對宿主細胞進行翻譯而言重要的mRNA非翻譯區。前導序列與編碼多肽的核苷酸序列的5′末端有效連接。在所選擇的宿主細胞內具有功能的任何前導序列均可用于本發明。
用于絲狀真菌宿主細胞的優選的前導序列是從米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶基因得到的前導序列。
控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，即與核苷酸序列的3′末端有效連接并且轉錄后作為向轉錄的mRNA添加聚腺苷酸殘基的信號而被宿主細胞識別的序列。在所選擇的宿主細胞內具有功能的任何聚腺苷酸化序列均可用于本發明。
用于絲狀真菌宿主細胞的優選的聚核苷酸化序列是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶基因得到的序列。
控制序列還可以是信號肽編碼區，其編碼的氨基酸序列與多肽的氨基末端連接并且指導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。在核苷酸序列的編碼序列的5′末端可以天然的含有信號肽編碼區，該信號肽編碼區于翻譯閱讀框內與編碼所分泌多肽的編碼區片段天然連接。另外，編碼序列的5′末端可以含有對于編碼序列而言為外來的信號肽編碼區。在編碼區天然不含有信號肽編碼區時，可能需要外來的信號肽編碼區。另外，外來的信號肽編碼區可簡單地替換天然的信號肽編碼區以增強多肽的分泌。然而，能夠指導表達的多肽進入所選擇宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區可以用于本發明。
對于絲狀真菌宿主細胞，有效的信號肽編碼序列是來自于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、孤獨腐質霉(Humicola insolens)纖維素酶和柔毛腐質霉(Humicola lanuginosa)脂酶基因的信號肽編碼序列。
加入使多肽表達的調節與宿主細胞的生長相關的調節序列也是需要的。調節系統的實例是那些應答于化學或物理刺激(包括調節化合物的出現)，而引起基因表達開或關的調節系統。原核系統中的調節系統包括lac、tac和trp操縱基因系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或者GAL1系統。在絲狀真菌中，TAKA α-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子可以用來作為調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的調節序列。在真核系統中，它們包括在氨甲喋呤存在時能夠擴增的二氫葉酸還原酶基因和重金屬存在時能夠擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調節序列有效連接。
表達載體本發明還涉及包含發明的核酸構建體的重組表達載體。上述多種核苷酸和控制序列可連接在一起產生重組表達載體，其可以包括一個或多個便利的限制性酶切位點，以便允許編碼多肽的核苷酸序列在此種位點進行插入或替代。另外，本發明的核苷酸序列可以通過將該核酸序列或者含有該序列的核酸構建體插入到用于表達的恰當載體中來表達。在構建表達載體時，編碼序列定位于載體，以致于編碼序列與用于表達的恰當控制序列有效連接。重組表達載體可以是能夠方便地進行重組DNA操作并且能夠引起核苷酸序列表達的任何載體(例如質粒或者病毒)。載體的選擇通常依賴于載體和欲導入載體的宿主細胞的兼容性。載體可以是線性的或者閉合環狀質粒。
載體可以是自主復制載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復制不依賴于染色體的復制，例如質粒、染色體外遺傳因子、微型染色體或者人工染色體。
載體可含有保證自我復制的任何手段。另外，載體可以是導入宿主細胞原整合進入基因組并且與整合進入的染色體一起復制的載體。
此外，可以使用單一載體或質粒、或共同含有欲被導入宿主細胞基因組的全部DNA的兩個或多個載體或質粒，或使用轉座子。
本發明的載體優選含有便于選擇轉化細胞的一個或多個選擇標記。選擇標記是其產物能夠提供殺生物劑或病毒抗性、重金屬抗性、從原養型到自養型等等的基因。
在絲狀真菌宿主細胞中使用的選擇標記包括(但不限于)，amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，以及它們的等效物。
在曲霉屬細胞中優先使用的是構巢曲霉或者米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發明的載體優選含有允許載體穩定整合到宿主細胞基因組中的元件或者允許載體在細胞內不依賴基因組而自主復制的元件。
為了整合進入宿主細胞基因組，載體可依賴于編碼多肽的核苷酸序列或者載體中用于通過同源重組或者非同源重組將載體穩定整合進入基因組的任何其它元件。另外，載體可以包含用于通過同原重組指導整合進入宿主細胞基因組的附加核苷酸序列。附加核苷酸序列使載體能夠在染色體上的精確位置整合進入宿主細胞基因組。為了提高在精確位置整合的可能性，整合元件應優選含有足夠數量的核苷酸，例如100至1,500個堿基對，優選400至1,500個堿基對，并且最優選800至1,500個堿基對，它們與相應的靶序列高度同源以便增強同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼的或者編碼的核苷酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組的方式整合進入宿主細胞的基因組。
宿主細胞本發明還涉及含有本發明核酸構建體的重組宿主細胞，該細胞有利于多肽的重組產生。將含有本發明核苷酸序列的載體導入宿主細胞，以便載體以作為先前描述的染色體整合體或者自主復制的染色體外載體而得以維持。
在一個優選的實施方案中，宿主細胞是真菌細胞。如此處所使用“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等在《Ainsworth and Bisby′s Dictionaryof The Fungi》，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK，中所定義)，以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等1995，同前，171頁，所引用)和所有的有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等1995，同前)。
在另一個更加優選的實施方案中，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(如Hawksworth等1995，同前)細分的所有絲狀形式。絲狀真菌以由殼多糖、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖和其它復合多糖組成的菌絲體壁為特征。通過菌絲延長進行營養生長并且碳的分解代謝是專性需氧的。相反，諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)之類的酵母的營養生長是通過單細胞菌體的出芽完成并且碳的分解代謝可通過發酵進行。
在甚至更加優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是(但不限于)枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、脈孢菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium或者木霉屬(Trichoderma)種類的細胞。
在最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構巢曲霉、黑曲霉或者米曲霉細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖鐮孢、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色鐮胞(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或者Fusarium venenatum的細胞。在一個甚至最優選的實施方案中，絲狀真菌母細胞是Fusariumvenenatum(Nirenberg sp.nov.)細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是孤獨腐質霉、柔毛腐質霉、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、產紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichodrma harzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或者綠色木霉(Trichoderma viride)的細胞。
真菌細胞可以通過包括原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁回收的過程以本質上已知的方式進行轉化。轉化曲霉屬細胞的適宜的操作在EP238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 811470-1474中有所描述。轉化鐮刀菌屬物種的適宜的方法在Malardier等，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787中有所描述。可以使用Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.，編，“Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology”，《Methods in Enzymology》，194卷，182-187頁，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journalof Bacteriology 153163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 751920中描述的操作轉化酵母。
生產方法本發明還涉及生產本發明多肽的方法，包括(a)培養菌株，其野生型形式能夠產生多肽；和(b)回收多肽。優選地，菌株是曲霉屬，并且更加優選的是米曲霉和黑曲霉。
本發明還涉及生產本發明多肽的方法，包括(a)在有助于產生多肽的條件下培養宿主細胞；和(b)回收多肽。
在本發明的生產方法中，使用本領域已知的方法將細胞在適于生產多肽的營養培養基中培養。例如，細胞可以通過在實驗室或者工業發酵罐中，在適宜的培養基上以及允許多肽表達和/或分離的條件下進行搖瓶培養、小規模或者大規模發酵(包括連續、批式、補料分批式或者固態發酵)。使用本領域已知的操作，在含有碳源和氮源和無機鹽的適宜的營養培養基中進行培養。適宜的培養基可以從商品供應商得到或者根據公布的組合物(例如American Type Culture Collection的目錄中所分布的)進行配制。如果多肽分泌到營養培養基中，則可從培養基中直接回收多肽。如果多肽是非分泌的，可以從細胞裂解液中回收多肽。
可使用本領域已知的對多肽特異的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括使用特異的抗體、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，可使用酶測定法測定此處所述多肽的活性。
可使用本領域已知的方法回收產生的多肽。例如可通過包括(但不限于)離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發或者沉淀的常規操作從營養培養基中回收多肽。
可通過本領域已知的多種操作，包括(但不限于)層析(例如離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦和大小排阻層析)、電泳過程(例如制備型等電聚焦電泳)、差異溶解性(如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE，或者抽提(例如見《蛋白質純化》，J.-C.Janson和Lars Ryden編，VCHPublishers，New York，1989)對多肽進行純化。
應用可以以本領域已知的方法配制按照本發明生產的抗體治療制劑。
制劑可以含有對于治療的特定適應癥所必需的不只一種活性化合物。例如，可能需要提供另一種類型的抗體和/或組合物可以含有細胞毒性劑、細胞因子或生長抑制劑。
用于體內施用的制劑必須是無菌的。通過如無菌濾膜過濾可容易地實現這一點。
抗體的另一個應用是由抗體結合部分和酶組成的嵌合蛋白。以這種方式，催化的生物分子可以設計成具有兩個結合特性，一個是酶的、另一個是抗體的結合特性。這可導致產生具有優越活性的酶。
實施例實施例1曲霉屬菌株Jal355的構建BECh2描述于WO 00/39322，WO 00/39322而它進一步參考了專利WO 98/12300(描述JaL228)。
pJaL173描述于WO 98/12300pJaL335描述于WO 98/12300為了除去米曲霉屬菌株Bech2中位于堿性蛋白酶基因內的缺陷的pyrG基因，進行下面的操作分離pyrG-米曲霉菌株——ToC1418
篩選米曲霉屬菌株Bech2對5-氟-乳清酸(FOA)的抗性，以鑒定自發的pyrG突變體。一個菌株(ToC1418)被鑒定為pyrG-。ToC1418是尿嘧啶核苷依賴的，因此可以用野生型pyrG基因轉化并且可以通過在缺乏尿嘧啶核苷條件下的生長能力選擇轉化體。
pyrG+的米曲霉菌株——JaL352的構建通過測序確定位于堿性蛋白酶基因內的缺陷pyrG基因中的突變。通過使用引物104025和104026的PCR方法制備米曲霉屬菌株Bech2的染色體DNA。
104025(SEQ ID NO.2)5′-CCTGAATTCACGCGCGCCAACATGTCTTCCAAGTC，和104026(SEQ ID NO.3)5′-GTTCTCGAGCTACTTATTGCGCACCAACACG擴增出含有缺陷pyrG基因的編碼區的933bp片段。將933bp的片段進行純化并用下列引物進行測序引物104025、引物104026、引物104027(Seq ID No.4)5′-ACCATGGCGGCACTCTGC，引物104028(Seq ID No.5)5′-GAGCCGTAGGGGAAGTCC，引物108089(Seq ID No.6)5′-CTTCAGACTGAACCTCGCC和引物108091(Seq ID No.7)5′-GACTCGGTCCGTACATTGCC。
測序表明一個額外的堿基G插入到pyrG編碼區的第514位(從pyrG基因起始密碼子的A開始算起)，以此產生了移碼突變。
為了使位于堿性蛋白酶中的缺陷pyrG基因變成野生型pyrG基因，使用標準的操作，用150皮摩爾的寡核苷酸5′-CCTACGGCTCCGAGAGAGGCCTTTTGATCCTTGCGGAG-3′(SEQ ID NO.8)轉化米曲霉pyrG-菌株ToC1418。寡核苷酸的5′末端可以有利地被磷酸化。寡核苷酸恢復了pyrG的閱讀框，但是同時引入了一個沉默突變，因此產生了StuI限制性內切酶位點。然后通過在尿嘧啶核苷缺乏條件下生長的能力選擇轉化體。在重新分離之后，制備了8個轉化體的染色體DNA。為了證實其變化，通過使用引物135944(Seq ID No.9)
5′-GAGTTAGTAGTTGGACATCC和引物108089的PCR擴增了785bp的片段，該片段覆蓋了目的區域。將785bp的片段進行純化并用引物108089和135944進行測序。將具有預期改變的一個菌株命名為JaL352。
分離pyrG-的米曲霉菌株——JaL355為了除去位于堿性蛋白酶基因內的pyrG基因，用pJaL173的5.6kb的BamHI片段通過標準操作轉化JaL352，所述片段攜帶米曲霉堿性蛋白酶基因的5′和3′側翼序列。在非選擇平板上再生原生質體，并收集孢子。為了鑒定pyrG突變體，對大約109個孢子篩查了對FOA的抗性。當從14個FOA抗性轉化體中重新分離染色體DNA后。用BalI消化染色體DNA，并用使用1kb32P-標記的pJaL173 BalI DNA片段作為探針的進行DNA印跡分析，該標記的片段含有米曲霉堿性蛋白酶基因的部分5′和3′側翼。通過4.8kb BalI帶的消失和1kb BalI帶的出現來鑒定目的菌株。用來源于pJaL335、含有米曲霉pyrG基因的3.5kb32P-標記的DNA Hind III片段對同一張濾膜進行探測，導致4.8kb BalI帶在目的菌株消失。將來源于這些轉化體的一個菌株命名為JaL355。
實施例2構建用于表達的質粒為了促進位于表達質粒上的目的基因的表達，有必要降低用于選擇的標記基因(此處以pyrG基因為例)的表達。通過在正常選擇壓力下培養具有表達質粒的宿主細胞，該表達質粒含有已經降低表達的選擇基因，導致對具有增加質粒拷貝數量的宿主細胞的選擇，從而使選擇基因的總表達水平達到存活所必需。然而，更高的質粒拷貝數量也導致目的基因的增強的表達。
降低選擇基因表達水平的一種方式是通過使用轉錄較弱的啟動子或者降低mRNA的功能半壽期來降低mRNA水平。另一種方式是降低mRNA的翻譯效率。此種作法的一種方式是突變Kozak區(Kozak M Gene，234(2)卷187-208頁(1999))。這是一個僅僅位于起始密碼子(ATG)上游的對于翻譯起始而言重要的區域。
質粒pENI2155在pyrG基因上游含有差的kozak區，其構建如下使用質粒pENI1861(其構建在下面描述)作為模板并使用PWO聚合酶(按照制造商推薦的條件)，進行兩次PCR反應，在一次反應中使用引物141200J1和270999J9，在另一次反應中使用引物141200J2和290999J8141200J1(SEQ ID NO10)5′ATCGGTTTTATGTCTTCCAAGTCGCAATTG141200J2(SEQ ID NO11)5′CTTGGAAGACATAAAACCGATGGAGGGGTAGCG290999J8(SEQ ID NO12)5′TCTGTGAGGCCTATGGATCTCAGAAC270999J9(SEQ ID NO13)5′GATGCTGCATGCACAACTGCACCTCAG使用QIAGENTM旋轉柱從1％瓊脂糖凝膠中純化PCR片段。使用該兩個片段作為模板并使用引物270999J8和270999J9進行第二輪PCR反應。如所述將這次反應的PCR片段從1％瓊脂糖凝膠中純化出來，用限制性內切酶StuI和SphI對片段和載體pENI1849(含有脂酶基因作為表達報告基因)進行切割，用常規的方法從1％瓊脂糖凝膠中純化產生的片段。
將純化的片段連接并轉化進入大腸桿菌(E.coli)菌株DH10B。將一個轉化體的質粒DNA分離出來并且進行測序以證實導入了突變的Kozak區GGTTTTATG(而不是野生型GCCAACATG)。將該質粒命名為pENI2155。
用質粒pENI1849(對照野生型質粒)和pENI2155(pyrG基因上游突變的Kozak區)轉化曲霉屬細胞。用大約1微克pENI1849和pENI2155轉化米曲霉Jal355(如WO 98/01470中所述，JaL355是米曲霉A1560的衍生物，其中pyrG基因已經失活；轉化操作步驟如WO 00/24883中所述)。將轉化體在37℃培養4天。
將來自pENI2155轉化的24個轉化體和pENI1849轉化的12個轉化體接種于含有1×Vogel培養基和2％麥芽糖(《Methods in Enzymology》，17卷，84頁)的96孔微滴定板中。在34℃生長4天之后，用對硝基苯戊酸(pnp-valerate)作為脂酶底物來測定培養液中的脂酶活性。
從每個孔中取出10微升培養基等分試樣加入到200微升含有0.018％對硝基苯戊酸，0.1％TritonXTM-100，10mM CaCl2，50mM Tris pH7.5的脂酶底物的微滴定板中。使用標準的酶學操作步驟(例如EnzymeKinetics，Paul C.Engel，著者，1981，Chapman and Hall Ltd)用動力學酶標儀(Molecular Device Corp.，Sunnyvale CA)以分光光度法在跨越5分鐘的時期內以15秒的間隔測定脂酶活性。簡言之，在底物周轉的起始階段測定產物的形成并且將其定義為從5分鐘內每15秒的405nm吸光值計算出來的曲線的斜率。相對表現出最高脂酶活性的轉化體標準化任意的脂酶活性單位。對于每組的30個轉化體，計算出其平均值和標準差。給定任意的單位，平均脂酶活性和相對標準差為1849轉化體65±142155轉化體120±22顯然2155轉化體內的脂酶表達幾乎加倍了，其中突變的Kozak區已經被導入到選擇基因pyrG的前面。
為了在表達質粒中具有領域內曲霉屬啟動子和若干用于克隆的單一限制性酶切位點，制備了質粒pENI1861。使用質粒pMT2188(pMT2188的構建在下面描述)作為模板和下面的引物得到了PCR片段(大約620bp)051199J1(SEQ ID NO14)5′-CCTCTAGATCTCGAGCTCGGTCACCGGTGGCCTCCGCGGCCGCTGGATCCCCAGTTGTG1298TAKA(SEQ ID NO15)5′-GCAAGCGCGCGCAATACATGGTGTTTTGATCAT將此片段用BssHII和BglII切割，并且克隆到同樣用BssHII和BglII切割的pENI1849中。通過測序證實克隆。
為了減小質粒的大小因而提高轉化效率，構建了質粒pENI1849，以便將pyrG基因截短至pyrG表達所必需的序列。使用pENI1299(描述于WO 00/24883圖2和實施例1)作為模板和下面的引物得到了PCR片段(大約1800bp)270999J8(SEQ ID NO12)和270999J9(SEQ ID NO13)將此PCR片段用限制性內切酶StuI和SphI進行切割并且克隆到也被StuI和SphI進行切割的pENI1298(描述于WO00/24883
圖1和實施例1)中；通過測序證實克隆。
質粒pMT2188基于曲霉屬表達質粒pCaHj483(描述于WO98/00529)，質粒pCaHj483含有基于與構巢曲霉丙糖磷酸異構酶非翻譯前導序列融合的黑曲霉中性淀粉酶II啟動子(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶終止子(Tamg)的表達盒。在pCaHj483上還存在來源于構巢曲霉的曲霉屬選擇標記amdS，該選擇標記使宿主能夠以乙酰胺作為唯一氮源生長。這些元件被克隆到大腸桿菌載體pUC19(New England Biolabs)上。用能夠補償大腸桿菌中pyrF突變的釀酒酵母URA3標記替換能夠在大腸桿菌中選擇pUC19的氨芐青霉素抗性標記，替換方式如下用下面的引物從pCaHj483上PCR擴增pUC19的復制起點142779(SEQ ID NO16)5′-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC142780(SEQ ID NO17)5′-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC引物142780在PCR片段中引入了BbuI位點。使用ExpandTMPCR系統(Roche Molecular Biohcemicals，Basel，Switserland)按照制造商的說明書進行此次和隨后的PCR擴增。
使用下面的引物從普通釀酒酵母克隆載體pYES2(Invitrogen公司，Carlsbad，Ca，USA)擴增了URA3基因。
140288(SEQ ID NO18)5′-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT142778(SEQ ID NO19)5′-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT引物140288在PCR片段中引入了EcoRI位點。將該兩個片段混合，并用引物142780和140288在拼接處通過重疊法(Horton等(1989)Gene，77，61-68)進行擴增，從而將該兩個PCR片段融合起來。
用EcoRI和BbuI消化得到的片段，并且將其連接到用同樣的酶消化的pCaHj 483大片段上。連接混合物用于轉化用Mandel和Higa法(Mandel，M.和A.Higa(1970)J.Mol.Biol.45，154)制備的pyrF大腸桿菌菌株DB6507(ATCC 35673)感受態。用添加1g/l酪蛋白氨基酸、500μg/l硫胺素和10mg/l卡那霉素的固體M9培養基(Sambrook等(1989)《Molecularcloning，a laboratory manual》，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)選擇轉化體。
來源于所選擇的轉化體的質粒稱為pCaHj527。用單一的PCR方法對存在于pCaHj527上的Pna2/tpi啟動子進行定點誘變。使用誘變引物141223將134-144位核苷酸從GTACTAAAACC改變為CCGTTAAATTT。使用誘變引物141222將423-436位核苷酸從ATGCAATTTAAACT改變為CGGCAATTTAACGG。產生的質粒稱為pMT2188。
141223(SEQ ID NO20)5′-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC141222(SEQ ID NO21)5′-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC降低OMP脫羧酶的活性和穩定性為了提高目的基因從質粒中的表達，如已經在實施例1中所提及的，可能需要降低選擇基因(例如pyrG基因)編碼蛋白質的穩定性和/或活性。
降低選擇基因所編碼的蛋白質的穩定性的一種方式是向蛋白質添加一“降解決定子”基序(Dohmen R.J.，Wu P.，Varshavsky A.，(1994)Science263卷1273-1276頁)。另一種方式是根據與同源蛋白質進行比對或者根據蛋白質的模擬結構(如果可得的話)來鑒定結構上重要的保守氨基酸殘基。然后可突變這些氨基酸以降低酶的穩定性和/或活性。
使用蛋白質序列swissprot_dcop_aspng(質粒pENI2155上的pyrG基因編碼的OMP脫羧酶)與下列數據庫條目Swissprot_dcop_sapor、geneseqp_r05224、geneseqp_y99702、tremblnew_aag34761、swissprot_dcop_phybl、remtermbl_aab01165、remtembl_aab16845和sptrembl_q9uvz5進行蛋白質比對。
使用程序ClustalW(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W通過序列加權、位置特異缺口懲罰和權矩陣選擇提高遞增多重序列比對的敏感性.Nucleic Acids Research，224673-4680)進行比對。
根據這些比對和相關的枯草桿菌(Bacillus subtilis)OMP脫羧酶的結構(Appleby t.，Kinsland C.，Begley T.P.，Ealick S.E..(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷2005-2010頁)鑒定出下列保守的殘基為潛在的結構上重要、并且可以作為突變的適宜靶位點的殘基P50、F91、F96、N101、T102、G128、G222、D223、G239。構建了許多誘變引物并且用T4多核苷酸激酶(New England Biolabs)進行磷酸化。
P50-260301j1(SEQ ID NO22)5′-ACAGGACTCGGTNCGTACATTGCCGTGF91-260301j2(SEQ ID NO23)5′-AATTTCCTCATCTNCGAAGATCGCAAGF96-260301j3(SEQ ID NO24)5′-GAAGATCGCAAGTNCATCGATATCGGAN101，T102-260301j4(SEQ ID NO25)5′-ATCGATATCGGANACANCGTCCAAAAGCAGG128-260301j5(SEQ ID NO26)5′-AGTATTCTGCCCGNTGAGGGTATCGTCG222，D223-260301j6(SEQ ID NO27)5′-CTCTCCTCGAAGGNTNACAAGCTGGGACAGG239-230301j7(SEQ ID NO28)5′-GCTGTTGGACGCGNTGCCGACTTTATT使用pENI2155作為模板進行了七次單獨的PCR/連接反應(如SawanoA.，Miyawaki A.(2000)Nucleic Acid Research 28卷e78所述)，從七個文庫中各取出1微升用來轉化大腸桿菌菌株DH10B。從每個文庫得到了大約1000個大腸桿菌克隆。從各文庫制備DNA制品并且合并DNA(命名為pBIB16)。
使用標準的操作步驟，以每100微升原生質體1微克pBIB16DNA和10微克鯡魚精DNA(載體DNA)的量轉化曲霉屬菌株MT2425(pyrG-菌株，當在選擇平板上生長時能夠長出小的轉化體克隆)將轉化后的原生質體涂布在選擇平板上(2％麥芽糖(誘導小的形態和脂酶表達)、10mM NaNO3、1.2M山梨醇、2％細菌瓊脂和標準鹽溶液)。
在生長5天后，向曲霉屬轉化克隆上鋪上一覆蓋層(含有0.004％亮綠、2.5％橄欖油、1％瓊脂、50mM TRIS pH7.5，用混合器(UltrathoraxTMT25B型，IKA Labortechnic，Germany)處理1分鐘。將平板在室溫下孵育過夜。
將對橄欖油具有最高活性的20個克隆培養在96孔微滴定板中的200微升YPM中。在34℃生長4天后，如上所述，使用對硝基苯戊酸來測定培養液中的脂酶活性。
將脂酶測定中具有最高活性的6個轉化體培養在5ml YPM中。分離DNA并轉化進大腸桿菌菌株DH10B，然后回收(rescuing)質粒(也描述于WO 00/24883中)。鑒定出兩個pyrG變體1)F96S；將質粒稱作pENI2343，和2)T102N；將質粒稱作pENI2344。
使用標準的操作步驟，將大約2微克的每種質粒pENI2155、pENI2343和pENI2344轉化稱作Jal355的米曲霉pyrG-突變體和稱作Mbin115的黑曲霉pyrG-突變體。
將轉化后的原生質體涂布在選擇平板上(2％麥芽糖、10mM NaNO3、1.2M山梨醇、2％細菌瓊脂、鹽溶液)。生長4天之后，可見pENI2343Jal355轉化體孢子形成很差，并且對于用pENI 2343轉化的MBIN115則未見轉化體。
將每種質粒轉化的6個獨立的轉化體接種于96孔微滴定板中的200微升1×Vogel，2％麥芽糖中。在34℃生長4天后，測定培養液中的脂酶活性。結果以相對脂酶單位和相對標準差的形式示于下表，并且結果是獨立克隆活性的平均值。
相對于孔中的真菌生物量，pENI2343轉化體中的脂酶表達十分高，這非常少(少于其它轉化體的1/10)。當將pENI2155轉化體與pENI2344轉化體進行比較時，可見對于Jal355轉化體脂酶表達大約增加1.5倍，在Mbin115轉化體中增加大約11倍。
因此pyrG T102N突變導致脂酶表達增加，這是由于選擇基因pyrG編碼的不穩定的、較低活性的OMP脫羧酶而選擇出來的，脂酶表達增加可能是由于質粒拷貝數的增加。
為了評估質粒的穩定性，建立評估含有穩定附加型復制質粒(含有pyrG選擇基因)孢子百分數的篩選。
構建了兩個DNA文庫。第一個文庫已被克隆進入了一個含有作為選擇基因的野生型pyrG基因的質粒，而第二個文庫已被克隆進入了一個含有突變的Kozak區和T102N突變的突變型pyrG基因的質粒。
從每個文庫的制備了孢子懸液并且將其鋪于平板上(2％麥芽糖、10mM NaNO3、1.2M山梨醇、2％細菌瓊脂、鹽、含或不含20mM尿嘧啶核苷)。平板在37℃生長3天。結果示于下面的表中。
當使用突變的(Kozak/T102N)pyrG基因時，很明顯含有質粒的孢子占有更大部分。
pENI2151的構建將pENI1902和pENI1861用Hind III酶切，并且用堿性磷酸酶處理pENI1902。
從1％的凝膠中純化來自pENI1861的2408bp片段并且連接到從1％的凝膠中純化的pENI1902載體上，從而產生了pENI2151。
pENI2207(具有弱的pyrG上游kozak區)的構建將pENI2151和pENI2155用StuI和SphI酶切。
從1％的凝膠中純化來自pENI2155的2004bp的片段用并且連接到從1％的凝膠中純化的酶切pENI2151上，從而產生了pENI2207。
pENI2229(在接頭中具有額外的限制酶切位點)的構建以pENI2151為模板使用寡核苷酸2120201J1和1298-TAKA進行PCR。
用BssH II和Bgl II酶切PCR片段(650bp)和pENI2207。從1％凝膠中純化載體和PCR片段并連接，從而產生pENI2229。
1298-TAKA(SEQ ID NO.15)5′-GCAAGCGCGCGCAATACATGGTGTTTTGATCAT210201J1(SEQ ID NO.29)5′-GCCTCTAGATCTCCCGGGCGCGCCGGCACATGTACCAGGTCTTAAGCTCGAGCTCGGTCACCGGTGGCC具有弱kozak和受損pyrG基因的pENI2376的構建用SphI和StuI酶切質粒pENI2344并且從1％的瓊脂糖凝膠中分離含有pyrG基因的DNA片段(2004bp)。
用SphI和StuI酶切質粒pENI2229并且從1％瓊脂糖凝膠中分離載體片段。
將pENI2229的載體片段和來自pENI2344的含有pyrG的片段連接起來，從而產生pENI2376。
pENI2516的構建用Hind III酶切質粒pENI2376并且將6472bp的主要載體片段進行連接，從而產生了pENI2516。
實施例3赫賽汀是一種用于治療乳腺癌的人抗體。它是十分昂貴的產品，在具有很高表達潛能的絲狀真菌生產相似的產品會更便宜。
根據赫賽汀的人重鏈片段的氨基酸序列構建基因，該基因具有與曲霉中發現的高表達基因具有相同的密碼子習慣。
為了能夠合成編碼赫賽汀重鏈可變區的基因，根據上述DNA序列合成示于圖1的引物。引物的相對位置示于圖1。
pENI2716的構建將引物230402j3(10pmol)、230402j4(2pmol)、230402j7(10pmol)和230402j8(2pmol)在20μl的總體積中混合，并且使用TGO聚合酶和緩沖液(Roche)進行PCR反應(94℃5分鐘，(94℃30秒，50℃30秒，72℃1分鐘)25個循環，72℃2分鐘)。
230402j3(SEQ ID NO 30)5′-ACCTTCACCGACTACACGATGGACTGGGTCCGGCAGGCGCCGGGCAAGGGCCTGGAGTG230402j4(SEQ ID NO 31)5′-CCGGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCGCGGACGTGAACCCGAACTCCGGCGGGTCGATCTACAACCAGCGCT230402j7(SEQ ID NO 32)5′-AGACGGCGGTGTCCTCCGCCCGGAGGGAGTTCATCTGCAGGTACAGCGTGTTCTTCGACC230402j8(SEQ ID NO 33)5′-GTACAGCGTGTTCTTCGACCGGTCGACCGAGAGCGTGAACCGGCCCTTGAAGCGCTGGTTGTAGATCGAC將產生的PCR片段(見圖1)克隆到pCR4TOPO平端(blunt)載體中(Invitrogen，如產品所推薦)，并且轉化進入TOP10大腸桿菌細胞中。從大腸桿菌轉化體中制備DNA并測序。具有編碼赫賽汀重鏈可變區片段的正確序列的質粒命名為pENI2716。
pENI2769的構建將引物230402J1(10pmol)、230402j2(2pmol)、230402j5(10pmol)和230402j6(2pmol)和質粒pENI 2716在20μl的總體積中混合，并且使用TGO聚合酶和緩沖液(Roche)進行PCR反應(94℃5分鐘，(94℃30秒，50℃30秒，72℃1分鐘)25個循環，72℃2分鐘)。
230402J1(SEQ ID NO 34)5′-GAGGTCCAGCTCGTCGAGTCCGGCGGCGGCCTCGTGCAGCCGGGGGGCTCGCTGCGGCTC230402j2(SEQ ID NO 35)5′-CGGGGGGCTCGCTGCGGCTCTCCTGCGCCGCGTCGGGCTTCACCTTCACCGACTACACGA230402j5(SEQ ID NO 36)5′-ATCGAGCCGCGGCTACGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCCTGGCCCCAGTAGTCGAAGTAGAACGACGGGCC230402j6(SEQ ID NO 37)5′-TCGAAGTAGAACGACGGGCCGAGGTTCCGGGCGCAGTAGTAGACGGCGGTGTCCTCCGCC將產生的PCR片段(見圖1)克隆到pCR4TOPO平端載體中(Invitrogen，如產品所推薦)，并且轉化進入TOP10大腸桿菌細胞中。從大腸桿菌轉化體中制備DNA并測序。具有編碼赫賽汀重鏈可變區全長的正確序列的質粒命名為pENI2769。
實施例4用于表達赫賽汀重鏈可變區的表達載體pENI-Herceptin1和pENI-Herceptin2的構建使用引物230402j1和230402j5以及模板(pENI2769)，并使用TGO聚合酶和緩沖液(Roche)進行PCR反應(94℃5分鐘，(94℃30秒，50℃30秒，72℃1分鐘)25個循環，72℃2分鐘)。所得到的PCR片段編碼赫賽汀的重鏈可變區。
大型亞灰樹花菌(Meripilus giganteus)纖維素結合結構域的PCR使用引物090103j1和230402J9以及從DSM(DSM9971)儲存的菌株中分離的質粒并使用TGO聚合酶和緩沖液(Roche)進行PCR反應(94℃5分鐘，(94℃30秒，50℃30秒，72℃1分鐘)25個循環，72℃2分鐘)。DSM 9971是釀酒酵母，它含有已經克隆到表達質粒pYES2.0(Invitrogen)中的內切葡聚糖酶。在所述質粒中還含有大型亞灰樹花菌纖維素結合結構域。所述酵母根據國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure)儲存于德意志微生物保藏中心(Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH.，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig Federal Republic ofGermany)(DSM)。
儲存日期11.05.95Depositor′s refNN49008DSM名稱釀酒酵母DSM No.9971產生的PCR片段含有TAKA-啟動子和大型亞灰樹花菌纖維素結合結構域，它能夠在曲霉屬中良好地表達。
230402J9(SEQ ID NO 38)5′-GACTCGACGAGCTGGACCTCCGAGCCAGGGCACGCGGACGG090103j1(SEQ ID NO 39)5′-GTAGACGGATCCACCATGAAGGCGATCCTCTCTCTCGC將使用090103j1/230402j9和230402j1/230402j5產生的PCR片段混合，使用TGO聚合酶和緩沖液(Roche)以及引物090103j1和230402j5進行新的PCR反應(94℃5分鐘，(94℃30秒，50℃30秒，72℃1分鐘)25個循環，72℃2分鐘)。為了保證赫賽汀重鏈可變區能夠很好地表達，將編碼能夠很好表達的大型亞灰樹花菌纖維素結合結構域與赫賽汀重鏈可變區融合。
為了在曲霉庫中表達，將產生的PCR片段用BamHI和SacII酶切，并且克隆到已用BamHI和SacII酶切的表達載體pENI2376上，因而產生pENI-Herceptin1。
為了能夠在曲霉屬中進行表達，將產生的PCR片段用BamHI和SacII酶切，并且克隆到已用BamHI和SacII酶切的表達載體pENI2516上，因而產生pENI-Herceptin2。
將pENI-herceptin2轉化進入如實施例2中提到的曲霉屬菌株Jal355中。將20個曲霉屬轉化體接種于96孔微滴定板中的200微升YPM中。在34℃生長4天后，用20微升培養液進行16％SDS-PAGE電泳。以16％SDS-PAGE中的條帶鑒定表達赫賽汀重鏈可變區的轉化體。
實施例5從pENI-herceptin2表達赫賽汀重鏈可變區的曲霉屬轉化體的發酵將具有最好地表達赫賽汀的曲霉屬轉化體培養于含有100ml G2-gly(酵母提取物18g/L，87％甘油24g/L，Pluronic PE-61000.1ml/L)的搖瓶里，并在30℃、275轉每分的速度搖動生長過夜。第二天，將2ml培養液接種到含有100ml MDU-2B(麥芽糖45g/L，硫酸鎂1g/L，氯化鈉1g/L，硫酸鉀2g/L，酵母提取物7g/L，痕量金屬(KU6)0.5ml/L，Pluronic PE 61000.1ml/L)+1％脲的搖瓶里。接種了10個搖瓶并且在30℃、275轉每分的速度搖動生長72小時。痕量金屬ZnCl26.8g/L，CuSO4.5H2O 2.5g/L，NiCl2.6H2O 0.24g/L，FeSO4.7H2O 13.9g/L，MnSO4.H2O 8.45g/L，檸檬酸C6H8O7.H2O 3g/L。
實施例6構建具有編碼處于赫賽汀重鏈可變區上游之Thermomyces lanuginosa脂酶信號肽的序列的表達載體pENI-herceptin3使用引物081102J5和211102j1以及模板(pENI2769)并使用TGO聚合酶和緩沖液(Roche)進行PCR反應(94℃5分鐘，(94℃30秒，50℃30秒，72℃ 1分鐘)25個循環，72℃ 2分鐘)。產生的PCR片段編碼赫賽汀重鏈可變區。
081102J5(SEQ ID NO 40)5′-GCCTTGGCTAGCCCTATTCGTCGAGAGGTCCAGCTCGTCGAGTCC211102j1(SEQ ID NO 41)5′-CACGAGCTCGAGCCGCGGCTACGAGGA將產生的PCR片段和質粒pENI1163(WO 99/42566)用Nhe I和Xho I酶切。從1.5％的瓊脂糖凝膠中純化PCR片段和載體質粒(pENI1163)，連接并轉化進入大腸桿菌菌株DH10B。將產生的質粒(pENI-herceptin3)轉化進入曲霉屬菌株Bech2(見上)，并且如上所述篩查赫賽汀重鏈可變區的表達。
實施例7構建具有編碼處于赫賽汀重鏈可變區上游之Thermomyces lanuginosa脂酶信號肽和下游脂酶編碼基因的序列的表達載體pENI-herceptin4使用引物081102J5和030103j1以及模板(pENI2769)并使用TGO聚合酶和緩沖液(Roche)進行PCR反應(94℃ 5分鐘，(94℃ 30秒，50℃30秒，72℃ 1分鐘)25個循環，72℃ 2分鐘)。產生的PCR片段編碼赫賽汀重鏈可變區。
081102J5(SEQ ID NO 42)5′-GCCTTGGCTAGCCCTATTCGTCGAGAGGTCCAGCTCGTCGAGTCC030103j1(SEQ ID NO 43)5′-GTCAGCGCTAGCCGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC將產生的PCR片段和質粒pENI1163(WO 99/42566)用Nhe I酶切。從1.5％的瓊脂糖凝膠中純化PCR片段和載體質粒(pENI1163)，連接并轉化進入大腸桿菌菌株DH10B。將產生的質粒(pENI-herceptin4)測序并轉化進入曲霉屬菌株Bech2(見上)，并且通過測定脂酶活性(見專利WO 00/24883A1)篩選赫賽汀重鏈可變區的表達。
實施例8用于在曲霉菌屬中進行文庫篩選的pENI-herceptin5的構建使用引物1298-taka(見上)和991213j5以及模板(pENI-herceptin4)并使用TGO聚合酶和緩沖液(Roche)進行PCR反應(94℃ 5分鐘，(94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 1分鐘)25個循環，72℃ 2分鐘)。產生的PCR片段編碼以翻譯融合體克隆到脂酶上游的赫賽汀重鏈可變區。
991213j5(SEQ ID NO 44)5′-CCTCTSGATCTCGAGCTCGGTCACCGGTGGCCTCCGCGGCCGCTGCGCCAGGTGTCAGTCACCCTC將產生的PCR片段和質粒pENI2376(WO 99/42566)用BamHI和SacII酶切。從1.5％的瓊脂糖凝膠中純化PCR片段和載體質粒(pENI2376)，連接并轉化進入大腸桿菌菌株DH10B。將產生的質粒(pENI-herceptin5)測序并轉化進入曲霉屬菌株jal355(見上)，并且通過測定脂酶活性(見專利WO 00/24883A1)篩選赫賽汀重鏈可變區的表達。
實施例9篩選從pENI-herceptin5表達的重鏈可變區增加的溶解性和產量為了提高重鏈可變區的表達和溶解性，顯然可以對參與重鏈和輕鏈相互聯系的氨基酸殘基進行突變。潛在的任何氨基酸的變化都可能通過輕微改變整體蛋白質結構而實現這一點。氨基酸殘基應該優選地突變成親水的殘基，例如K、R、H、D、E、G、N、Q、C、S、T或者Y。在給定的實施例中突變的位點優選是V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109。
為了增加表達和溶解性，進行了下面的篩選。設計了下面的磷酸化引物，其中X代表天然存在的氨基酸并且氨基酸位置參考SEQ ID NO 1。
301202j1 V37X，Q39X(SEQ ID NO 45)5′-ACGATGGACTGGNNSCGGNNSGCGCCGGGCAAG301202j2 G44X，L45X，W47X(SEQ ID NO 46)5′-GCGCCGGGCAAGNNSNNSGAGNNSGTCGCGGACGTG301202j3 Y95X(SEQ ID NO 47)5′-ACCGCGGTCTACNNSTGCGCCCGGAAC301202j4 W109X(SEQ ID NO 48)5′-ACTTCGACTACNNSGGCCAGGGCACC7887(SEQ ID NO 49)5′-GAA TGA CTT GGT TGA GTA CTC ACC AGT CAC(因此將在氨芐青霉素抗性基因發現的用于酶切的Mlu I位點改變成ScaI位點)。
使用pENI-herceptin5作為模板，突變寡核苷酸301202j1、301202j2、301202j3、301202j4和寡核苷酸7887作為選擇寡核苷酸，和商品化試劑盒在大腸桿菌中構建了文庫。可按照產品說明書使用Chameleon雙鏈定點誘變試劑盒(Stratagene)。
將產生的大腸桿菌文庫轉化曲霉屬菌株Jal355(如專利WO 00/24883A1中所提及的)。
使用標準的操作步驟(參考如WO 98/01470中所述的)，將文庫轉化進入JaL355。然后將細胞于37℃培養于Cove平板上。
培養3天后，出現轉化體，轉化率為104-105/μg DNA。
將5000個獨立的轉化體接種于386孔每孔含有40μl 1×Vogel，2％麥芽糖的基本培養基的微量滴定盤(例如《Methods in Enzymology》，第17卷84頁)。
在34℃培養3天后，測定微量滴定盤中培養液中的脂酶活性。將來自每孔的5μl培養基等分試樣加入到含有40μl的0.018％對硝基苯丁酸脂酶底物、0.1％Triton X-100、10mM CaCl2、50mM Tris pH7.5的微滴定孔中。使用標準的酶學操作步驟(例如《Enzyme Kinetics》，Paul C.Engel編，1981，Chapman and Hall Ltd)用動力學酶標儀(Victor 2，Wallac)在5分鐘的時期內每隔15秒用分光光度法測定活性。簡言之，在底物周轉的起始階段中測定產物的形成并且將其定義為從5分鐘內每15秒的405nm吸光值計算出的曲線的斜率。分離出脂酶表達水平最高的50株。增高的脂酶表達可以用來指示重鏈可變區的表達和溶解性的增加。該50株的培養液進一步用來進行SDS-PAGE分析以鑒定最好的表達。
實施例10篩查從pENI-herceptinl表達的重鏈可變區提高的溶解性和產量為了提高重鏈可變區的表達和溶解性，顯然可以對參與重鏈和輕鏈相聯系的氨基酸殘基進行突變。潛在的任何氨基酸的變化都可能通過輕微改變整體蛋白質結構而實現這一點。氨基酸殘基應該優選地突變成親水的殘基，例如K、R、H、D、E、G、N、Q、C、S、T或者Y。在給定的實施例中突變的位點優選是V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109。
為了增加表達和溶解性，進行了下面的篩選。設計了下面的磷酸化引物(與上面的實施例9中一樣)301202j1 V37X，Q39X(SEQ ID NO 45)5′-ACGATGGACTGGNNSCGGNNSGCGCCGGGCAAG301202j2 G44X，L45X，W47X(SEQ ID NO 46)
5′-GCGCCGGGCAAGNNSNNSGAGNNSGTCGCGGACGTG301202j3 Y95X(SEQ ID NO 47)5′-ACCGCGGTCTACNNSTGCGCCCGGAAC301202j4 W109X(SEQ ID NO 48)5′-ACTTCGACTACNNSGGCCAGGGCACC7887(SEQ ID NO 49)5′-GAA TGA CTT GGT TGA GTA CTC ACC AGT CAC(因此將在氨芐青霉素抗性基因中發現的用于酶切的Mlu I位點改變成Sca I位點)。
使用質粒pENI-herceptin1作為模板，突變寡核苷酸301202j1、301202j2、301202j3、301202j4和引物7887作為選擇引物，和商品化試劑盒在大腸桿菌中構建了文庫。可按照產品說明書使用Chameleon雙鏈定點誘變試劑盒(Stratagene)。
將產生的大腸桿菌文庫轉化曲霉屬菌株Jal355(如專利WO 00/24883A1中所提及，見上)如專利WO 01/98484A1中所提及的，篩選最后的轉化體。
實施例11pENI3318的構建pENI2155和pHerceptin4均用BamHI和SgrA I酶切。
從瓊脂糖凝肢中分離pENI2155載體片段和pHerceptin4的1300bp片段，并連接，由此產生了pENI3318。
實施例12篩選從pENI3318表達的重鏈可變區提高的溶解性性和產量為了提高重鏈可變區的表達和溶解性，突變了參與重鏈和輕鏈相聯系的氨基酸殘基。潛在的任何氨基酸的變化都可能通過輕微改變整體蛋白質結構而實現。氨基酸殘基應該優選突變成親水的殘基，例如K、R、H、D、E、G、N、Q、C、S、T或者Y。在給定的實施例中突變的位點優選是V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109。
為了增加表達和溶解性，進行了下面的篩選。設計了下面的磷酸化引物，其中X代表天然存在的氨基酸并且氨基酸位置參考SEQ ID NO 1。
301202j1 V37X，Q39X(SEQ ID NO 45)5′-ACGATGGACTGGNNSCGGNNSGCGCCGGGCAAG301202j2 G44X，L45X，W47X(SEQ ID NO 46)5′-GCGCCGGGCAAGNNSNNSGAGNNSGTCGCGGACGTG301202j3 Y95X(SEQ ID NO 47)5′-ACCGCGGTCTACNNSTGCGCCCGGAAC301202j4 W109X(SEQ ID NO 48)5′-ACTTCGACTACNNSGGCCAGGGCACC19670(SEQ ID NO 50)5′-CCCCATCCTTTAACTATAGCG060302J1(SEQ ID NO 51)5′-AGAGCTTAAAGTATGTCCCTTG使用pENI3318作為模板和突變寡核苷酸301202j1、301202j2、301202j3、301202j4和寡核苷酸19670，并使用Phusion(Finnzymes)按產品所推薦的進行PCR。
從瓊脂糖凝膠中分離片段(900bp-1100bp)。使用純化的片段和pENI3318作為模板，使用寡核苷酸060302j1和Phusion進行新的PCR。將產生的PCR片段用BamHI和SgrAI酶切并且與用同樣的酶切割的pENI2155連接。
使用電轉化將連接物轉化進入XL10-gold，得到4500個大腸桿菌克隆，并且只有載體的對照連接物轉化后沒有出現克隆。
將產生的大腸桿菌文庫轉化進入曲霉屬菌株Jal355中(如專利WO00/24883A1中所提及)。
使用標準的操作步驟(參考如WO 98/01470中所述的)，將文庫轉化進入Jal355。然后將細胞于37℃培養于Cove平板上。
培養3天后，出現轉化體，轉化率為104-105/μg DNA。
將400個獨立的轉化體接種于每孔含有200μl YPM的96孔微量滴定盤中。接種3份用親本質粒pENI 3316轉化的曲霉作為對照。
在34℃培養3天后，對微量滴定盤中的培養液進行脂酶活性的測定。將每孔中的5μl培養基等分試樣加入含有200μl 0.018％對硝基苯丁酸脂酶底物、0.1％Triton X-100、10mM CaCl2、50mM Tris pH7.5的微滴定孔中。使用標準的酶學操作步驟(例如《Enzyme Kinetics》，Paul C.Engel編，1981，Chapman and Hall Ltd)用動力學酶標儀在5分鐘的時期內每隔15秒以分光光度法測定活性。簡言之，在底物周轉的起始階段中測定產物的形成并且將其定義為從5分鐘內每15秒的405nm吸光值計算出的曲線的斜率。分離出脂酶表達水平最高的34株。在pENI3318曲霉屬轉化體中未見脂酶的表達。提高的脂酶表達可以用來指示重鏈可變區的表達和溶解性的增加。從每一個轉化體中分離出質粒并且鑒定了突變。
實施例13篩選從pENI3318表達的重鏈可變區提高的溶解性和產量為了提高重鏈可變區的表達和溶解性，突變了參與重鏈和輕鏈相聯的氨基酸殘基。潛在的任何氨基酸的變化都可能通過輕微改變整體蛋白質結構而實現這一點。氨基酸殘基應該優選突變成親水的殘基，例如K、R、H、D、E、G、N、Q、C、S、T或者Y。在給定的實施例中突變的位點優選是V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109。
為了增加表達和溶解性，進行了下面的篩選。設計了下面的磷酸化引物，其中X代表天然存在的氨基酸并且氨基酸位置參考SEQ ID NO 1。
301202j1 V37X，Q39X(SEQ ID NO 45)5′-ACGATGGACTGGNNSCGGNNSGCGCCGGGCAAG301202j2 G44X，L45X，W47X(SEQ ID NO 46)
5′-GCGCCGGGCAAGNNSNNSGAGNNSGTCGCGGACGTG301202j3 Y95X(SEQ ID NO 47)5′-ACCGCGGTCTACNNSTGCGCCCGGAAC301202j4 W109X(SEQ ID NO 48)5′-ACTTCGACTACNNSGGCCAGGGCACC7887(SEQ ID NO 49)5′-GAA TGA CTT GGT TGA GTA CTC ACC AGT CAC(因此將在氨芐青霉素抗性基因中發現的用于酶切的Mlu I位點改變成Sca I位點)。
使用pENI3318作為模板，突變寡核苷酸301202j1、301202j2、301202j3、301202j4和寡核苷酸7887并且使用下面提到的操作步驟在大腸桿菌中構建了文庫。
將最后的大腸桿菌文庫轉化曲霉屬菌株Jal355(如專利WO 00/24883A1中所提及)。
使用標準的操作步驟(參考如WO 98/01470中所述的)，將文庫轉化進入Jal355。然后將細胞于37℃培養于Cove平板上。
培養3天后，出現轉化體，轉化率為104-105/μg DNA。
將40個獨立的轉化體接種于每孔含有200μl YPM的96孔微量滴定盤中。接種3份用親本質粒pENI3318轉化的曲霉作為對照。
在34℃培養3天后，對微量滴定盤中的培養液進行脂酶活性的測定。將每孔中的5μl培養基等分試樣加入含有200μl 0.018％對硝基苯丁酸脂酶底物、0.1％Triton X-100、10mM CaCl2、50mM Tris pH7.5的微滴定孔中。使用標準的酶學操作步驟(例如Enzyme Kinetics，Paul C.Engel，著者，1981，Chapman and Hall Ltd)用動力學酶標儀在5分鐘的時期內每隔15秒以分光光度法測定活性。簡言之，在底物周轉的起始階段測定產物的形成并且將其定義為從5分鐘內每15秒的405nm吸光值計算出的曲線的斜率。分離出脂酶表達水平最高的8株。提高的脂酶表達可以用來指示重鏈可變區的表達和溶解性的增加。在pENI3318曲霉屬轉化體中未見脂酶的表達。進行SDS-page并證實提高的表達。從每一個轉化體中分離出質粒并且鑒定了突變。發現了下面的突變——所有的突變都比野生型的產量要高V37S，D，GQ39C，W，SL45GW47G，R，LY95L，FW109K。
使用Proof start聚合酶(Qiagen，202205)和Taq耐熱連接酶(Biolabs208L)的誘變方法混合5μl連接酶緩沖液和5μl Proofstart緩沖液。加入10μl dNTP(2.5mM)，2.5μl連接酶和2.5μl Proof start聚合酶。轉移2.5μl至每一個PCR反應管中(放置于冰上)。加入100ng模板DNA。加入20pmol各引物。
用滅菌水補足10μl的總體積。
過夜進行PCR反應98℃1分鐘，(96℃ 1分鐘，50℃ 1分鐘，65℃ 15分鐘)30次。向PCR反應中加入1μl Dpn1并且輕輕混勻。在37℃孵育2小時。轉化進入DH10b(化學感受態)。加入200μl LB并且在eppendorf管中于37℃生長1小時。鋪板于LB+AMP的平板上并且在培養于37℃。對生長出的克隆進行DNA制備。
序列表<110>諾和酶股份有限公司<120>在絲狀真菌中表達人重鏈抗體<130>10307.204-WO<160>51<170>Patent版本3.2<210>1<211>119<212>PRT<213>人<220>
<221>結構域<222>(1)..(119)<223>人免疫球蛋白重鏈可變結構域、Herceptin<400>1Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>2<211>35<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物104025<400>2cctgaattca cgcgcgccaa catgtcttcc aagtc 35<210>3<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物104026<400>3gttctcgagc tacttattgc gcaccaacac g 31<210>4<211>18<212>DNA<213>人工
<220>
<223>引物104027<400>4accatggcgg cactctgc 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物104028<400>5gagccgtagg ggaagtcc 18<210>6<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物108089<400>6cttcagactg aacctcgcc 19<210>7<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物108091<400>7gactcggtcc gtacattgcc20
<210>8<211>38<212>DNA<213>人工<220>
<223>Primer<400>8cctacggctc cgagagaggc cttttgatcc ttgcggag38<210>9<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物135944<400>9gagttagtag ttggacatcc20<210>10<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物141200J1<400>10atcggtttta tgtcttccaa gtcgcaattg 30<210>11<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物141200J2
<400>11cttggaagac ataaaaccga tggaggggta gcg 33<210>12<211>26<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物270999J8<400>12tctgtgaggc ctatggatct cagaac 26<210>13<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物270999J9<400>13gatgctgcat gcacaactgc acctcag27<210>14<211>59<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物051199J1<400>14cctctagatc tcgagctcgg tcaccggtgg cctccgcggc cgctggatcc ccagttgtg 59<210>15<211>33<212>DNA<213>人工
<220>
<223>引物1298TAKA<400>15gcaagcgcgc gcaatacatg gtgttttgat cat 33<210>16<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物142779<400>16ttgaattgaa aatagattga tttaaaactt c 31<210>17<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物142780<400>17ttgcatgcgt aatcatggtc atagc 25<210>18<211>26<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物14288<400>18ttgaattcat gggtaataac tgatat 26
<210>19<211>32<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物142778<400>19aaatcaatct attttcaatt caattcatca tt 32<210>20<211>45<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物141223<400>20ggatgctgtt gactccggaa atttaacggt ttggtcttgc atccc45<210>21<211>44<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物141222<400>21ggtattgtcc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgc 44<210>22<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物P50-260301j1
<220>
<221>混雜特征<222>(13)..(13)<223>n is a、c、g或t<400>22acaggactcg gtncgtacat tgccgtg27<210>23<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物F91-260301j2<220>
<221>混雜特征<222>(14)..(14)<223>n is a、c、g或t<400>23aatttcctca tctncgaaga tcgcaag27<210>24<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>Prime F96-260301j3<220>
<221>混雜特征<222>(14)..(14)<223>n is a、c、g或t<400>24gaagatcgca agtncatcga tatcgga27
<210>25<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物N101，T102-260301j4<220>
<221>混雜特征<222>(13)..(13)<223>n is a、c、g或t<220>
<221>混雜特征<222>(17)..(17)<223>n is a、c、g或t<400>25atcgatatcg ganacancgt ccaaaagcag 30<210>26<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物G128-260301j5<220>
<221>混雜特征<222>(14)..(14)<223>n is a、c、g或t<400>26agtattctgc ccgntgaggg tatcgtc27<210>27
<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物G222、D223-260301j6<220>
<221>混雜特征<222>(14)..(14)<223>n is a、c、g或t<220>
<221>混雜特征<222>(16)..(16)<223>n is a、c、g或t<400>27ctctcctcga aggntnacaa gctgggacag 30<210>28<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物G239-230301j7<220>
<221>混雜特征<222>(14)..(14)<223>n is a、c、g或t<400>28gctgttggac gcgntgccga ctttatt27<210>29<211>69<212>DNA<213>人工
<220>
<223>引物210201J1<400>29gcctctagat ctcccgggcg cgccggcaca tgtaccaggt cttaagctcg agctcggtca 60ccggtggcc 69<210>30<211>59<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物230402j3<400>30accttcaccg actacacgat ggactgggtc cggcaggcgc cgggcaaggg cctggagtg 59<210>31<211>70<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物230402j4<400>31ccgggcaagg gcctggagtg ggtcgcggac gtgaacccga actccggcgg gtcgatctac 60aaccagcgct 70<210>32<211>60<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物230402j7
<400>32agacggcggt gtcctccgcc cggagggagt tcatctgcag gtacagcgtg ttcttcgacc 60<210>33<211>70<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物230402j8<400>33gtacagcgtg ttcttcgacc ggtcgaccga gagcgtgaac cggcccttga agcgctggtt 60gtagatcgac 70<210>34<211>60<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物230402J1<400>34gaggtccagc tcgtcgagtc cggcggcggc ctcgtgcagc cggggggctc gctgcggctc 60<210>35<211>60<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物230402j2<400>35cggggggctc gctgcggctc tcctgcgccg cgtcgggctt caccttcacc gactacacga 60<210>36<211>72
<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物230402j5<400>36atcgagccgc ggctacgagg agacggtgac cagggtgccc tggccccagt agtcgaagta 60gaacgacggg cc 72<210>37<211>60<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物230402j6<400>37tcgaagtaga acgacgggcc gaggttccgg gcgcagtagt agacggcggt gtcctccgcc 60<210>38<211>41<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物230402J9<400>38gactcgacga gctggacctc cgagccaggg cacgcggacg g 41<210>39<211>38<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物090103j1
<400>39gtagacggat ccaccatgaa ggcgatcctc tctctcgc38<210>40<211>45<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物081102J5<400>40gccttggcta gccctattcg tcgagaggtc cagctcgtcg agtcc45<210>41<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物211102j1<400>41cacgagctcg agccgcggct acgagga27<210>42<211>45<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物081102J5<400>42gccttggcta gccctattcg tcgagaggtc cagctcgtcg agtcc45<210>43<211>36<212>DNA<213>人工
<220>
<223>引物030103j1<400>43gtcagcgcta gccgaggaga cggtgaccag ggtgcc 36<210>44<211>66<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物991213j5<400>44cctctsgatc tcgagctcgg tcaccggtgg cctccgcggc cgctgcgcca ggtgtcagtc60accctc 66<210>45<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物301202j1 V37X、Q39X<220>
<221>混雜特征<222>(13)..(14)<223>n is a、c、g或t<220>
<221>混雜特征<222>(19)..(20)<223>n is a、c、g或t<400>45acgatggact ggnnscggnn sgcgccgggc aag 33
<210>46<211>36<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物301202j2 G44X、L45X、W47X<220>
<221>混雜特征<222>(13)..(14)<223>n is a、c、g或t<220>
<221>混雜特征<222>(16)..(17)<223>n is a、c、g或t<220>
<221>混雜特征<222>(22)..(23)<223>n is a、c、g或t<400>46gcgccgggca agnnsnnsga gnnsgtcgcg gacgtg 36<210>47<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物301202j3 Y95X<220>
<221>混雜特征<222>(13)..(14)<223>n is a、c、g或t<400>47
accgcggtct acnnstgcgc ccggaac27<210>48<211>26<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物301202j4 W109X<220>
<221>混雜特征<222>(12)..(13)<223>n is a、c、g或t<400>48acttcgacta cnnsggccag ggcacc 26<210>49<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物7887<400>49gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 30<210>50<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物19670<400>50ccccatcctt taactatagc g 21
<210>51<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物060302J1<400>51agagcttaaa gtatgtccct tg 2權利要求
1.產生功能性人免疫球蛋白的方法，其中表達了缺乏任何輕鏈的人重鏈免疫球蛋白，該方法包括步驟a)用編碼修飾的人重鏈免疫球蛋白的重組構建體轉化絲狀宿主細胞，其中修飾包括參與聯系輕鏈的重鏈蛋白質區域的一個或多個突變；b)在促進所述修飾的人重鏈免疫球蛋白表達的條件下培養所述絲狀宿主細胞；和c)回收所述修飾的人重鏈免疫球蛋白。
2.根據權利要求1的方法，其中絲狀宿主是曲霉宿主。
3.根據權利要求1的方法，其中人重鏈免疫球蛋白至少包含可變區和被Fc受體識別的Fc區。
4.根據權利要求1的方法，其中人重鏈免疫球蛋白至少包含可變區。
5.根據權利要求1的方法，其中修飾包含在重鏈蛋白質參與聯系輕鏈區域的突變，所述突變包括在SEQ ID NO 1中V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109殘基的任一突變，該序列代表人免疫球蛋白的重鏈可變區、赫賽汀或其它的人重鏈免疫球蛋白的功能等效殘基突變。
6.根據權利要求1-5中任一項的方法，其中修飾進一步包括重鏈免疫球蛋白中涉及與抗原接觸的區域的突變。
7.根據權利要求6的方法，其中修飾包括在人可變重鏈免疫球蛋白中與抗原相接觸的區域內的突變，所述突變包括SEQ ID NO 1中位置27-35、50-57和99-108內殘基的任何突變，所述序列代表人免疫球蛋白的重鏈可變區，赫賽汀，或其它的人重鏈免疫球蛋白的功能等效殘基突變。
全文摘要
本發明涉及產生功能性人免疫球蛋白的方法，其中表達了缺乏任何輕鏈的人重鏈免疫球蛋白，該方法包括步驟a)用編碼修飾的人重鏈免疫球蛋白的重組構建體轉化絲狀宿主細胞，其中修飾包括參與聯系輕鏈的重鏈蛋白質區域的一個或多個突變；b)在促進所述修飾的人重鏈免疫球蛋白表達的條件下培養所述絲狀宿主細胞；和c)回收所述修飾的人重鏈免疫球蛋白。
文檔編號C07K16/32GK1756767SQ200480006111
公開日2006年4月5日 申請日期2004年2月6日 優先權日2003年2月6日
發明者J·維恩 申請人:諾和酶股份有限公司