高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑及其裂解方法、用途的制作方法

專利名稱：高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑及其裂解方法、用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術領域的裂菌制劑的制備方法，具體涉及一種高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑及其裂解方法、用途。
背景技術：
大腸桿菌主要寄生在人和動物的腸道內，大多數是腸道的正常菌群，但在特定的條件下可成為致病菌，致腸道內致病和腸道外致病，表現為腹瀉、出血性腸炎、敗血癥、禽類的氣囊炎、關節滑膜炎和肉芽腫等。其中腸道內致病的典型血清型代表是0157，它是腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)的一個主要血清型，是食源性人獸共患病原菌，它可通過污染的食品而引起人的食物中毒，嚴重的可致人死亡，因此研制殺滅大腸桿菌的高效制劑在公共衛生方面具有重要的意義。目前能夠殺滅細菌的主要包括多種消毒劑、防腐劑、抗生素、抗代謝物等。然而，隨著這些藥物的廣泛應用，不但產生了大量的藥物殘留，細菌的多重耐藥、高劑量耐藥等也越來越嚴重，且細菌的耐藥菌株的傳播進一步加劇，從而增加了對環境和人類的威脅。因此科學家們一直在探索新的殺滅細菌的制劑。噬菌體是侵害細菌的病毒，不但能夠介導宿主菌生物學特性的改變，還能夠影響宿主菌的繁殖周期，決定宿主菌的溶原和裂解狀態。裂解性噬菌體中裂解酶具有特異性水解宿主細菌細胞壁，破壞細菌細胞壁的完整性，從而殺滅細菌。噬菌體編碼的裂解酶像噬菌體一樣只能攻擊特定的細菌，具有較高的特異性。而且裂解酶作用于細菌的速度極快，以致于細菌不會對該酶產生抗性，且噬菌體的裂解酶有比噬菌體更為廣泛的抗菌譜，因此從噬菌體裂解酶的角度來篩選殺滅細菌的制劑，是目前抗菌制劑中的新方向。迄今噬菌體裂解酶的研究主要集中在對革蘭氏陽性菌的裂菌作用，例如鏈球菌、炭疽桿菌、結核分枝桿菌等的裂解酶的研究相對較多，而對革蘭氏陰性菌，特別是大腸桿菌噬菌體裂解酶的研究尚未有報道。由于不同的噬菌體具有不同的裂解酶序列，即使是相同的基因序列在不同的噬菌體也會發揮不同的作用，且有的基因在體外表達還會受到很多條件的限制，從而阻礙了篩選真正具有裂菌作用的裂菌劑。本發明通過比較大腸桿菌0157噬菌體Min27的基因組系列，篩選多個特定的序列片段，通過修飾，進行原核表達、誘導和純化，獲得了有活性的裂菌制劑，可對多種血清型的大腸桿菌具有裂解作用。

發明內容
本發明的目的在于篩選具有特定的裂菌作用的基因，通過構建原核表達系統，篩選到具有裂解活性的重組表達產物，確定影響表達產物活性的最優裂解條件，提供一種能夠裂解多種血清型大腸桿菌的裂菌制劑及其裂解方法、用途。本發明的目的是通過以下的技術方案實現的 本發明涉及一種高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑，所述裂菌制劑是通過如下方法制備而得的
步驟一，通過噬菌體誘導的方法，誘導大腸桿菌溶原菌株，獲得裂解性噬菌體顆粒，純化得到噬菌體，提取噬菌體的DNA ；步驟二，設計引物，以步驟一所得DNA為模板，應用PCR擴增相應的基因片段；步驟三，采用原核表達系統pET_28a ( + )，將步驟二擴增所得DNA構建重組質粒；步驟四，將步驟三的重組質粒轉化到表達菌BL2KDE3)，篩選陽性轉化子進行蛋白的誘導表達和鑒定，獲得重組蛋白；步驟五，純化誘導表達的重組蛋白，篩選具有裂解活性的重組表達蛋白，得到蛋白制劑，即高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑。優選地，步驟二中所述引物的核苷酸序列為，上游CGCGGATCCATGAGCAGGAAACTCCG,下游CCCAAGCTTTTATCTGTCGATTCCCC。優選地，步驟二中所述擴增基因片段為534bp。優選地，步驟四中獲得的重組蛋白為23kDa。優選地，步驟五中所述篩選具有裂解活性的重組表達蛋白具體為將獲得的純化的重組蛋白、陽性轉化子的細菌裂解液進行平板裂解實驗，比較裂菌效果，從而篩選具有裂解活性的重組表達蛋白。本發明還涉及一種前述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑的裂解方法，所述裂解方法采用的還原劑為質量百分比濃度為0. 8%的P -巰基乙醇或IOmM的半胱氨酸，緩沖液為20mM pH5. 2醋酸鈉緩沖液，裂解菌液的pH值為8. 0，反應溫度為37°C。本發明還涉及一種前述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑的用途，所述裂解制劑用作裂解不同血清型大腸桿菌菌株的裂解制劑。優選地，所述血清型大腸桿菌菌株為大腸桿菌046、0118、0138、0157和MC1061菌株。本發明的原理在于通過序列比對，設計2對可能的引物，采用PCR擴增溶原性大腸桿菌Min27中誘導的裂解性噬菌體Min27的可能的裂解酶基因，獲得目的片段，再將目的片段與pET-28a ( + )載體連接，得到重組表達質粒pET-28a ( + )，導入大腸桿菌BL21 (DE3)表達，獲得陽性轉化子 BL21 (DE3) /pET-28a ( + )_P1 和 BL21 (DE3)/pET_28a ( + )_P2，通過誘導，表達重組的融合蛋白，經過Ni柱純化和加入還原劑復性，獲得純化的重組蛋白，具有裂菌活性，命名為LysEC，該制劑可以裂解多種不同血清型的大腸桿菌，而不裂解其他腸道菌，且裂解活性高。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果本發明通過原核表達系統和平板裂菌實驗，篩選出具有裂菌活性的重組表達蛋白LysEC，可在體外高效、特異性裂解多種血清型的大腸桿菌。


圖I為采用SDS-PAGE鑒定純化的重組表達蛋白LysEC的示意圖；圖2為純化的重組蛋白LysEC平板裂解實驗示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下面實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I、噬菌體的誘導和噬菌體DNA的制各通過噬菌體誘導的方法，誘導大腸桿菌溶原菌株，獲得裂解性噬菌體顆粒，純化得到噬菌體，提取噬菌體的DNA ;具體操作如下將大腸桿菌0157Min27株接種5mL LB液體培養基，37°C振蕩過夜后，以I : 4的體積比加入新鮮LB液體培養基中，再加入絲裂霉素C至終濃度I. 0 ii g/mL,繼續振搖14h后，加入0. 1%的氯仿后再振搖15min,4000g離心IOmin,上清液過濾除菌,濾液中即含Stx2曬菌。將MC1061加入LB培養基中進行倍比稀釋lO'lO'lO—6，分別取200 ill噬菌體稀釋液% 200 u I宿主菌混勻，并加入lmol/L CaCl2至終濃度0. lmol/L，37。。孵育15min后，將混 合液加入與己熔化的頂層瓊脂中混勻，倒入含有底層瓊脂的平板上，待上層瓊脂凝固后，置于37°C溫箱培養10_12h，觀察噬菌斑形態。將單個噬菌斑擴大培養后，收集噬菌體懸液。噬菌體懸液中入加蛋白酶K至終濃度50 U g/ml，37°C溫育30分鐘，再加入SDS至終濃度0. 5%，混勻，56°C溫育I小時。用等體積Tris平衡酚(pH8. 0)進行抽提，4000g離心10分鐘，收集上層水相。用等體積氯仿再次抽提，5000g離心10分鐘，收集上層水相，并轉移至另一個離心管中。在回收的水相中加入3mol/L乙酸鈉至終濃度0. 3mol/L，再加兩倍體積的無水乙醇輕輕洗滌，12000g離心10分鐘，棄上清，用適量TE溶解沉淀，獲得噬菌體DNA。實施例2，設計2對引物引物，PCR擴增目的基因片段設計2對引物Pl和P2，以實施例I所得DNA為模板，應用PCR擴增相應的基因片段，確定基因的擴增片段為534bp和501bp ;具體操作如下根據GenBank中大腸桿菌0157Min27噬菌體的DNA序列(NC_010237)，設計2對引物引物，引物序列見表1，分別擴增2個基因區段，引物I擴增的位置在1-534，引物2擴增的位置34-534位氨基酸處，在上下游引物的5’端分別引入BamH I和Hind III酶切位點。以噬菌體DNA為模板，按照常規方法進行目的基因片段的擴增，反應結束后，取5 u L產物進行瓊脂糖凝膠電泳。利用PCR產物回收試劑盒回收PCR產物。表IPCR引物序列
物名稱處物序列(5'-3 T傷巧川途
Pl CGCGG^CCATGAGCAGGAAACTCCG1-17擴 Jfl 片段 534bp
P2 CGCGGATCCGCCGTTCTGGCGCTGAT34-50纊增片段501 bp
h■游引物 CCCAAGCTTTTATCTGTCGATTCCCC526-534通丨Tl 卜—游實施例3,重組質粒的構津采用原核表達系統pET_28a ( + )，將實施例2擴增所得DNA構建重組質粒，進行序列分析和比對，確定獲得正確序列的重組質粒pET-28a ( + )-Pl和pET-28a ( + )P2 ;具體操作如下
將實施例2的PCR擴增產物連接到pMD-18T載體(Takara公司)上測序。所設計的引物上游包含BamH I限制性酶切位點，下游包含Hind III限制性酶切位點。將BamHI和Hind III酶切PCR產物和pET-28a ( + )，T4DNA連接酶(Takara公司)10 16°C過夜連接。連接產物轉入大腸桿菌DH5 a中，37°C過夜培養，提取質粒。用BamH I和Hind III酶切鑒定，鑒定的陽性重組質粒測序，分別獲得陽性重組質粒pET-28a ( + )-Pl和pET-28a ( + )_P2。實施例4，重組質粒的原核表達將實施例3的重組質粒pET_28a ( + ) -Pl和pET_28a ( + ) _P2轉化到表達菌BL21(DE3 )，篩選陽性轉化子 BL21 (DE3) /pET_28a (+ ) -PI 和 BL21 (DE3) /pET_28a (+ ) -P2 進行蛋白的誘導表達和鑒定，獲得的重組蛋白，確定其蛋白分子量分別為23kDa和22kDa ;具體操作如下提取陽性重組質粒DNA，轉入大腸桿菌BL21 (DE3)中。分別獲得陽性轉化子BL21 (DE3) /pET-28a ( + ) -Pl 和 BL21 (DE3) /pET_28a ( + ) -P2,分別挑取 I 個菌落接種 2ml 卡那霉素LB培養基過夜培養。取5mL過夜培養菌液接種IL卡那霉素LB培養基，37°C 140rpm振蕩培養3至4小時，至OD6tltl約為I. O。加入1000mmol/L的異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG) 100 u L至終濃度為lmmol/L, 27°C 80rpm振蕩培養4h。取Iml菌液12000rpm離心Imin,棄上清，沉淀加入20 ii L蒸餾水重懸，再加入20 y L 2 X SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，100°C沸水浴IOmin后進行SDS-PAGE凝膠電泳，通過SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白表達情況。誘導的含pET-28a空載體菌做如上處理后作為對照進行SDS-PAGE電泳，獲得的融合重組蛋白分別為23kDa和22kDa。實施例5,融合蛋白的純化純化誘導表達的重組蛋白，得到蛋白制劑；具體操作如下IPTG誘導的細菌IL溶于25mL預冷的裂解緩沖液(含50mM磷酸鈉緩沖液，pH8. 0)，超聲破碎。8000g離心取上清。以8個柱體積的裂解緩沖液洗Ni柱，將樣品上至柱內，再用預冷的裂解緩沖液洗柱，直至OD28tl < 0. I。用預冷的清洗緩沖液A (裂解緩沖液加5mM咪唑)洗柱，直至OD28tl < 0. I。用預冷的清洗緩沖液B (裂解緩沖液加20mM咪唑)洗柱，直至OD280 < 0. I。最后用溶出液(裂解緩沖液加250mM咪唑)洗柱，收集洗脫液，即為純化的重組蛋白。圖I為采用SDS-PAGE鑒定純化的重組表達蛋白LysEC的示意圖，由圖I可知1是誘導的細菌的表達產物；2是標準Marker蛋白；3是未誘導的細菌產物；4是細菌誘導產物的純化獲得重組蛋白，由圖可以看出陽性轉化子BL21 (DE3)/pET-28a ( + )P1的誘導產物純化后可以得到純度很高的純化重組蛋白。實施例6,平板裂菌實驗將實施例5獲得的純化的重組蛋白、陽性轉化子BL21 (DE3)/pET_28a ( + )P1和BL21 (DE3)/pET-28a ( + )_P2的細菌裂解液進行平板裂解實驗，比較裂菌效果，篩選具有裂解活性的重組表達蛋白，確定BL21 (DE3)/pET-28a ( + )_P1的表達產物具有裂菌活性，將其命名為LysEC ;具體操作如下200ml 表達菌 BL21/pET28a-Pl、BL21/pET28aP2 以及空載體菌 BL21/pET28a 在27°C誘導4小時后離心，用5ml IOmM的無菌PBS緩沖液(pH 7. 2)重懸后超聲破碎。超聲功率為300-400W，工作5s，間隔15s，120個循環。獲得裂解液做平板裂解試驗。將新鮮培養的大腸桿菌MC1061菌清洗后的細菌加入0. 65%融化的瓊脂糖中混勻，混合物倒入平皿中，冷卻后在平皿上打孔，每孔直徑10mm。分別滴加50iU空載體裂解液、50 引物I的細菌裂解液、引物2的細菌裂解液，37°C溫箱培養直至觀察到培養基上出現的透明抑菌圈。結果顯示BL21 (DE3)/pET-28a ( + )-Pl的原核表達產物顯示有裂菌效果，而BL21 (DE3)/pET-28a ( + )_P2的原核表達沒有裂菌效果，將BL21 (DE3)/pET_28a ( + )-Pl的重組表達產物命名為LysEC，即為裂菌制劑。圖2為純化的重組蛋白LysEC平板裂解實驗示意圖，由圖2可知A BL21 (DE3)/pET-28a ( + )-P2的細菌裂解液對大腸桿菌指示劑菌沒有裂解作用；B BL21 (DE3)/pET_28a( + )-Pl的細菌裂解液對大腸桿菌指示劑菌有裂解作用；B:BL21 (DE3)/pET-28a ( + )_P1的誘導表達產物的純化物對大腸桿菌指示劑菌的裂解作用最強。實施例7，裂菌制劑LysEC最佳裂解條件的確定探索實施例5獲得的純化重組蛋白LysEC發揮活性的最佳條件；具體操作如下 最佳裂解條件的測定包括還原劑濃度、緩沖液成分、pH值、裂解溫度等測定方法采用池度遞減試驗，確定最佳裂解條件。lmg/ml LysEC純化蛋白，分別加入0. 5%、0. 8%、
I.0%、3. 0% 和 5. 0% (V/V) ^ -巰基乙醇；lmg/ml LysEC 純化蛋白分別加入 lmM、2mM、4mM、5mM、8mM、10mM、15mM 半胱氨酸；或用 20mM/L 為 pH4. O、pH6. O、pH8. O、pH10. O、pH12. 0 和PH14. 0磷酸鈉緩沖液進行重懸菌液，并調成OD6tltl約為I. 0 ;或用20mMpH5. 2醋酸鈉緩沖液、IOmM pH6. 8磷酸鹽緩沖液、IOmM pH7. 2磷酸鹽緩沖液、20mM pH8. 5Tris-Cl緩沖液重懸菌液；或將細菌懸液IOOiU與100 ill純化后的裂解劑混合，分別放置在4°C、18°C、25°C、37°C、42°C。每個實驗各做3個重復，裂解緩沖液作為空白對照。室溫下反應30min后，在600nm處讀取吸光度。取吸光度減少最大的作為最佳裂解最佳條件。P _巰基乙醇濃度為0. 8% ;半胱氨酸最佳濃度為IOmM ;最佳反應緩沖液為20mM pH5. 2醋酸鈉緩沖液；最佳裂解效果的為裂解菌液的PH值為8. 0 ;裂解酶最佳反應溫度為37°C。實施例8,裂菌制劑LysEC裂解活件測定實施例5獲得的純化重組蛋白LysEC的酶活性；具體操作如下以新鮮培養的大腸桿菌12000rmp離心2min,棄上清,預冷的IOmM PBS (pH7. 2)洗兩遍后重懸，調OD6tltl為I. O。純化重組蛋白的濃度為lmg/ml的LysEC，用IOmM PBS(pH7. 2)在96孔板中進行倍比稀釋，終體積為100 yl，每個稀釋孔中加入IOOiU細菌懸液，每個稀釋度3個重復，細菌懸液加IOmM PBS (pH7. 2)作為空白對照，在600nm處讀取吸光度，記錄初始值。96孔板置37°C，放置50min，600nm處讀取吸光度，記錄反應后的吸光值，計算濁度下降，可使細菌濁度下降50%的酶的最高稀釋度的倒數即定義為該蛋白酶的活性(unit/mg)。在37°C條件下，當原濃度為lmg/ml的LysEC稀釋倍數為I :3200時，大腸桿菌0157的0D600值下降50%，因此，LysEC的活性為3200u/mg，每單位所含的LysEC量為0. 31 y g。實施例9,裂菌制劑LysEC裂菌譜測定實施例5獲得的純化重組蛋白LysEC的裂菌譜的范圍；具體操作如下將生長至對數生長期的沙門氏菌、金黃色葡萄球、鏈球菌、大腸桿菌046、0118、0138、0157和MC1061等菌株離心后分別用20mM pH7. 2PBS (磷酸鈉)緩沖液重懸，調節成OD600為I. O。稀釋后的細菌懸液分別加入96孔板中，每孔100 iil，做四個重復。將終濃度為I. 25 ii g/ml的LysEC裂菌制劑100 U I加入細菌混懸液中。每株細菌各做3個重復，剩下一孔加入20mM pH7. 2磷酸鈉緩沖液IOOul作為空白對照。37°C下震蕩反應50min后，在吸光波長600nm處讀取吸光度值。以細菌濁度下降50%為裂解陽性標準，檢測LysEC對沙門氏菌、金黃色葡萄球、鏈球菌、大腸桿菌046、0118、0138、0157和MC1061等菌株的裂解作用。結果裂解酶LysECl只對不同血清型的大腸桿菌菌株具有裂解作用，對革蘭氏陰性菌如沙門氏菌、3種革蘭氏陽性菌包括金黃色葡萄球和鏈球菌均無裂解活性(見表2)。LysEC對6株大腸桿菌的裂解效率可以達到51% 73%，而對于其它菌株裂解效率均不高于10%。表2LysEC的裂菌譜測定

權利要求
1.一種高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑，其特征在于，所述裂菌制劑是通過如下方法制備而得的 步驟一，通過噬菌體誘導的方法，誘導大腸桿菌溶原菌株，獲得裂解性噬菌體顆粒，純化得到噬菌體，提取噬菌體的DNA ； 步驟二，設計引物，以步驟一所得DNA為模板，應用PCR擴增相應的基因片段； 步驟三，采用原核表達系統pET-28a ( + )，將步驟二擴增所得DNA構建重組質粒； 步驟四，將步驟三的重組質粒轉化到表達菌BL2KDE3)，篩選陽性轉化子進行蛋白的誘導表達和鑒定，獲得重組蛋白； 步驟五，純化誘導表達的重組蛋白，篩選具有裂解活性的重組表達蛋白，得到蛋白制齊U，即高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑。
2.根據權利要求I所述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑，其特征在于，步驟二中所述引物的核苷酸序列為，上游CGCGGATCCATGAGCAGGAAACTCCG，下游CCCAAGCTTTTATCTGTCGATTCCCC。
3.根據權利要求2所述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑，其特征在于，步驟二中所述擴增基因片段為534bp。
4.根據權利要求I和2所述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑，其特征在于，步驟四中獲得的重組蛋白為23kDa。
5.根據權利要求I所述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑，其特征在于，步驟五中所述篩選具有裂解活性的重組表達蛋白具體為將獲得的純化的重組蛋白、陽性轉化子的細菌裂解液進行平板裂解實驗，比較裂菌效果，從而篩選具有裂解活性的重組表達蛋白。
6.一種根據權利要求I所述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑的裂解方法，其特征在于，所述裂解方法采用的還原劑為質量百分比濃度為0. 8%的P -巰基乙醇或IOmM的半胱氨酸，緩沖液為20mM pH5. 2醋酸鈉緩沖液，裂解菌液的pH值為8. 0，反應溫度為37°C。
7.一種根據權利要求I所述的高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑的用途，其特征在于，所述裂解制劑用作裂解不同血清型大腸桿菌菌株的裂解制劑。
8.根據權利要求7所述的用途，其特征在于，所述血清型大腸桿菌菌株為大腸桿菌·046、0118、0138、0157 和 MC1061 菌株。
全文摘要
本發明公開了一種高效裂解大腸桿菌的裂菌制劑及其裂解方法、用途。設計引物，采用PCR擴增溶原性大腸桿菌中誘導的裂解性噬菌體的裂解酶基因，獲得目的片段，再將目的片段與pET-28a(+)載體連接，得到重組表達質粒，導入大腸桿菌BL21(DE3)表達，獲得陽性轉化子，通過誘導，表達重組的融合蛋白，純化誘導得純化的重組蛋白，篩選具有裂解活性的重組表達蛋白，即得所述裂菌制劑。所述裂解方法為pH 8.0，37℃，采用的還原劑為質量百分比濃度為0.8%的β-巰基乙醇或10mM的半胱氨酸，緩沖液為20mM pH5.2醋酸鈉緩沖液。本發明獲得的裂菌制劑對多種血清型大腸桿菌的裂解特異性強、裂解效率高，可有效殺滅大腸桿菌。
文檔編號C12N15/70GK102703491SQ201210162640
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月23日 優先權日2012年5月23日
發明者嚴亞賢, 孫建和, 楊曦 申請人:上海交通大學