專利名稱：檢測飛虱體內南方水稻黑條矮縮病毒的pcr引物及其方法
技術領域：
本發明屬農業科學技術領域，涉及ー種檢測飛虱體內南方水稻黑條矮縮病毒的PCR引物及其方法。
背景技術：
南方水稻黑條矮縮病是近年在我國南方稻區新發現的一種水稻病毒病，2008年由華南農大首次報道，2009年全國發生300萬畝，2010年迅速上升至1900萬畝，給水稻生產帶來巨大損失。目前的研究結果表明白背飛風(SbgaieWa Λ/rci/era)是該病毒病的田間主要傳播介體，因此白背飛虱的種群數量及其帶毒率是預測預報南方水稻黑條矮縮病發生的重要指標。*
單蟲帶毒檢測的難點在于ー頭飛虱的體積很小，病毒的含量非常少，從單頭蟲子體內提取病毒再用于檢測非常困難。目前檢測關于飛虱體內南方水稻黑條矮縮病毒(southern rice black streaked dwarf virus, SRBSDV)的檢測技術主要分為血清學技術和分子檢測技術兩種。浙江大學江等研究単位利用單克隆抗體技術進行南方黑條矮縮病毒的檢測，不過該項技術不能區分親緣關系與之非常相近的普通水稻黑條矮縮病毒(riceblack streaked dwarf virus, RBSDV)。華南農大報道了用一步雙重RT-PCR檢測技術南方水稻黑條矮縮病毒的方法，該方法利用2對基因特異性引物進行反轉錄和擴增，但2對引物不僅增加了檢測成本，而且出現一條擴增條帶時無法準確判斷到底是否帶毒。因此有必要建立ー種能準確從單頭白背飛虱體內檢測南方水稻黑條矮縮病毒的技術。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供ー種檢測飛虱體內南方水稻黑條矮縮病毒的PCR引物及其方法，利用本發明所述引物及方法能夠準確、快速檢測出飛虱體內的南方水稻黑條矮縮病毒，將南方水稻黑條矮縮病毒與普通水稻黑條矮縮病毒準確的區分開來，特別是能準確地從單頭白背飛虱體內檢測南方水稻黑條矮縮病毒。本發明提供的技術方案是ー種檢測飛虱體內南方水稻黑條矮縮病毒的引物，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID No. I所示,反向引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
同時，本發明還提供一種檢測檢測飛虱體內南方水稻黑條矮縮病毒的方法，該方法是提取待測樣品總RNA為模板，反轉錄獲得cDNA ;以所述的cDNA為模板，利用所述的引物進行PCR擴增，然后取擴增產物進行檢測，若擴增產物大小約為338bp，則待測樣品中存在南方水稻黑條矮縮病毒。上述的方法中，所述總RNA為模板反轉錄獲得cDNA過程中，采用隨機引物，所述的隨機引物為6個堿基的隨機引物，例如生エ生物工程上海有限公司產品編號為B0043的產
品O本發明具有以下有益效果
與現有技術相比，本發明的優點是應用本發明的檢測方法，僅用本發明的一對引物就可將南方水稻黑條矮縮病毒與普通水稻黑條矮縮病毒準確的區分開來，特別是能檢測出單頭飛虱體內的南方水稻黑條矮縮病毒，而且檢測結果準確，靈敏度高。本發明方法使用隨機引物進行反轉錄，轉錄產物的豐度大，使得條帶更亮更清楚。本發明的引物和方法可應用在病害診斷和預測預報上，利用本發明方法可以排除水稻黑條矮縮病的干擾，快速鑒定出單頭飛虱體內是否攜帯南方水稻黑條矮縮病毒。
圖I是本發明引物擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖，從左至右圖中第一條泳帶為Marker，第二泳道為SRBSDV陽性對照，第三泳道為RBSDV，其余為檢測的單蟲。
具體實施方式
下面通過具體實施方式
的詳細描述來進ー步闡明本發明，但并不是對本發明的限制，僅僅作示例說明。一、引物的設計
本發明人利用病毒核苷酸序列進化的保守性，從NCBI捜索并下載南方水稻黑條矮縮病毒S5序列，運用DNAssist軟件對這些序列進行比對，找出不同研究者報告的南方水稻黑條矮縮病毒核苷酸序列所共有而其它病毒序列均與之不同的引物候選區，設計出一對特異性引物，引物序列如下
正向引物5’ -TACGCAATACCTCATACCTG-3，(SEQ ID No. I),
反向引物5’-AAGACTTGTTTCTGCTGGTT-3’ ( SEQ ID No. 2)。上述引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，預期的PCR產物為338bp。ニ、病毒的RT-PCR過程
(一)提取總RNA，方法如下
1.取單頭蟲子于離心管中，液氮研磨；
2.加入100μ L的Trizol試劑；
3.加入500mL氯仿-異戊醇(24:1)劇烈震蕩搖勻15s;
4.冰浴IOmin,12000r/min離心15min,取上清液于另一新離心管中；
5.加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)輕微混勻，取上清液于另一新離心管中；
6.加入IOOPL的異丙醇，顛倒混勻；
7.室溫放置IOmin,12000r/min離心IOmin,棄上清；
8.加80%的こ醇洗漆沉淀,7500r/min離心5min,棄上清；
9.加無水こ醇洗漆沉淀，7500r/min離心5min,棄上清；
10.室溫下沉淀并充分干燥后；溶于1(^LDEPC水中。(ニ)用上述設計的弓I物對提取的總RNA進行RT-PCR擴增
在O. 2 mL PCR反應管中加入如下試劑進行反轉錄模板RNA 3μ ，5倍第一鏈合成緩沖液4PL，dNTPs( 10mM)2PL，隨機引物(生エ生物工程上海有限公司產品編號為B0043的產品，例如批次Lot ID 11-25) (25μΜ)0. 8μ ，無RNA酶的無菌水9. 2μ ，混勻后65°C預變性5 min，迅速置于冰上；然后加入M-MLV反轉錄酶(200U/>L) μ ,42で水浴反應I h，4°C保存備用。PCR擴增反應體系25μ ，其中，模板cDNA 2μ , 10XPCR Buffer 2. 5 μ L，dNTPs(IOmM) O. 5μ L, F 端引物(SEQ ID No. I) (10 μ Μ) μ ，R 端引物(SEQ ID No. 2) (ΙΟμΜ)lKL，滅菌去離子水17. 5 μ L，TaqDNA聚合酶(2. 5U/μ L) O. 5 μしPCR的反應條件為95°C預變性5min，95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸45s，35個循環，72°C延伸IOmin。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，若擴增產物大小約為338bp，則待測樣品中存在南方水稻黑條矮縮病毒。 用上述方法對湖南省2011年田間采集的白背飛虱進行了檢測，部分結果請參見圖1，擴增出338bp的條帶，與預期的一致。說明了本發明能準確區分南方黑條矮縮病毒和普通黑條矮縮病毒，且檢測條帶清楚。
權利要求
1.ー種檢測飛虱體內南方水稻黑條矮縮病毒的引物，其特征在于其正向引物核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.一種檢測檢測飛虱體內南方水稻黑條矮縮病毒的方法，其特征在于提取待測樣品總RNA為模板，反轉錄獲得cDNA ；以所述的cDNA為模板利用權利要求I所述的引物進行PCR擴增，然后取擴增產物進行檢測，若擴增產物大小為338bp，則待測樣品中存在南方水稻黑條矮縮病毒。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述總RNA為模板反轉錄獲得cDNA過程中，采用隨機引物。
全文摘要
本發明公開了一種檢測飛虱體內南方水稻黑條矮縮病毒的引物及其方法，利用本發明引物及方法能夠準確、快速檢測出飛虱體內的南方水稻黑條矮縮病毒，將南方水稻黑條矮縮病毒與普通水稻黑條矮縮病毒準確的區分開來，特別是能準確地快速鑒定出單頭白背飛虱體內是否攜帶南方水稻黑條矮縮病毒，可應用于病害診斷和預測預報上。
文檔編號C12N15/11GK102660653SQ20121016999
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月29日 優先權日2012年5月29日
發明者周倩, 朱俊子, 高必達 申請人:湖南農業大學