一種快速檢測灰飛虱體內水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病毒的方法
【專利摘要】本發明提供了一種快速同步檢測昆蟲介體灰飛虱體內水稻條紋病毒(RSV)和水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)的方法，屬植物保護領域。根據水稻條紋病毒RNA4和水稻黑條矮縮病毒S2核苷酸序列設計三條引物：[A]RS-F，[B]RB-F，[C]RSRB-R，其中A/C組合檢測水稻條紋病毒，B/C組合檢測水稻黑條矮縮病毒。單頭灰飛虱提取總RNA后，只需一個反應的RT-PCR，即可檢測水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病毒兩種病毒，實現了灰飛虱體內兩種病毒的快速同步檢測。相對于傳統的一次RT-PCR反應檢測一種病毒的方法，大大節約了成本，節省了時間，是一種快速、簡便、靈敏、特異的檢測方法。本方法可應用于田間灰飛虱群體帶毒率的監測工作，也可應用于病毒與介體互作機制的相關研究工作。
【專利說明】一種快速檢測灰飛虱體內水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病 毒的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種對介體昆蟲灰飛虱體內水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病毒快速 同步檢測的方法，屬植物保護領域。
【背景技術】
[0002] 水稻條紋病毒（Rice stripe virus, RSV)是纖細病毒屬（Tenuivirus)的典型成 員，其引起的水稻條紋葉枯病是水稻重要病害之一，在過去的數十年間，該病在我國以華東 稻區為主的廣大稻區暴發流行，對水稻生產構成極大威脅。例如，2004年江蘇省發病面積達 2355萬畝，占江蘇水稻種植面積的79%，成片水稻絕收，2005年達到2800萬畝，并開始向 浙江、安徽、河南、山東、上海等周邊省市蔓延，因其嚴重的危害性一度被稱為水稻上的"癌 癥"，引起了很大的社會反響。
[0003] 水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)，是水稻上一種 危害嚴重的病毒病，隸屬于植物呼腸孤病毒科斐濟病毒屬（Fijivirus)，病毒粒體球狀，田 間癥狀前期主要表現為植株矮縮，葉片濃綠，后期在葉片、葉鞘及莖桿上出現蠟滴狀突起， 而后形成黑條，對水稻的產量影響很大，重病田甚至可導致無產量。除水稻外，該病毒還 可侵染玉米引起玉米粗縮病、侵染小麥引起小麥綠矮病，此外，還可侵染多種禾本科雜草。 1963和1966年水稻黑條矮縮病在中國江蘇、上海、浙江一帶流行，90年代在我國許多玉米 和水稻產區暴發流行，造成了嚴重損失。近年來該病在江浙地區蔓延發生，且呈日漸嚴重的 趨勢，2008年僅江蘇省發病面積就達400萬畝，致使當地的水稻生產損失嚴重。
[0004] RSV和RBSDV主要由它們的共同介體昆蟲灰飛風Laodelphax striatellus Fall6n傳播，區別在于RSV可由灰飛虱經卵傳播，而RBSDV不經卵傳播。水稻條紋葉枯病的 典型癥狀為出現褪綠的條紋斑點或斑塊，株高一般正常，而黑條矮縮病的癥狀為植株矮縮， 葉片濃綠，后期可見白色蠟滴狀突起，而后形成黑條。兩種病害在田間極易區分診斷，但介 體灰飛虱的帶毒情況則無法直接鑒別，需借助生物學技術才能實現。田間灰飛虱群體帶毒 率的預測預報和持續監測在水稻病毒病害的無害化綜合防控中具有重要作用，對后續的防 控技術的采用能起到積極的指導作用。
[0005] 目前，昆蟲介體內的植物病毒的鑒定方法主要有：生物學接種實驗、血清學檢測、 電鏡觀察及分子生物學檢測。生物學接種實驗是收集灰飛虱刺吸感病水稻品種，然后觀察 水稻癥狀，不但工作量大，而且耗時長，例如黑條矮縮病的顯癥時間往往需要1個月。血清 學檢測對抗體的依賴性高，需要高特異性抗體，目前RSV的單抗檢測已比較成熟，而高效的 RBSDV抗血清還不成熟。電鏡觀察需要高值儀器設備，且不適合大量樣品檢測，一般應用于 病原特性的研究工作。當前應用較多的還是以RT-PCR技術為主的分子生物學檢測法，之前 也有報道使用RT-PCR的方法檢測RSV和RBSDV，但尚未報道能同步檢測RSV和RBSDV的技 術方法，本方法只需一次RT-PCR即可實現兩種的病毒鑒別，在保證可靠性和靈敏性的前提 下，簡化了操作，節省了成本和時間。
【發明內容】
[0006] 本發明填補了在介體灰飛虱體內水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病毒快速同步鑒 別技術上的空白，提供了一種快速、簡便、靈敏、特異的鑒別方法，可應用于田間灰飛虱群體 帶毒率的監測工作以及病毒與介體互作機制的研究工作。
[0007] 1、引物設計：
[0008] 1)在 NCBI(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez ? db = nucleotide) 上下載已報道的水稻條紋病毒RNA4核苷酸序列（D10979, AF513505, EU931525, AJ871748， FJ602692, EU931521，EU931517, AF221834, AF221835, FJ602700)和水稻黑條矮縮病毒 S2 核苷酸序列（AJ409145，KC134290)，使用DNAstar-MegAlign軟件的Clustal V方法進行序 列比對，發現RSV-RNA4與RBSDV-S2有一小段序列極為相似，利用該段相似區設計RSV和 RBSDV的共用引物，引物序列如下：
[0009] RSRB-R :5' -CCYATCACAAASAAATMAAAAT-3'
[0010] RS-F :5, -AGATCCAGAGAGAGTCACGGAAG-3，
[0011] RB-F : 5 ' -GTTCAAAGACAATACACTCAAAA-3 '
[0012] 2)引物配對及擴增目的核酸條帶的大小如下：
[0013] 引物組合 檢測病毒名稱 目的片段大小
[0014] RS-F/RSRB-R 水稻條紋病毒 1114bp
[0015] RB-F/RSRB-R水稻黑條矮縮病毒414bp
[0016] 2、總 RNA 提取：
[0017] 1)取單頭灰飛風置于1. 5mL離心管，加入250μ L Trizol reagent充分研磨，室溫 放置5min ;
[0018] 2)加入50 μ L氯仿，混勻后靜置3min ;
[0019] 3)4°C, 12000g，離心 lOmin ;
[0020] 4)取上層水相移入新的1. 5mL離心管，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min ;
[0021] 5) 4°C，12000g，離心 lOmin，棄去上清；
[0022] 6)加入1IHL701%乙醇洗漆沉淀，12000g，離心5min，棄上清；
[0023] 7)干燥RNA沉淀，加40 μ L DEPC處理水溶解沉淀，用NanoDrop2000C分光光度計 測定RNA的濃度和質量，-70°C保存。
[0024] 3、RT_PCR 擴增：
[0025] 1)反轉錄（RT)反應：
[0026] 取PCR管,加入樣品：提取的總RNA3 μ L，隨機引物（random hexamers) 1 μ L，DEPC 處理水5μ L，置于70°C下變性5min，立即取出冰浴lmin。再依次加入下列試劑：
[0027] 5xM-MuLV反轉錄酶緩沖液 3 μ? dNTP (lOmMeach) 1.5 μ?
[0028] RNase inhibitor (20 υ/μΙ>) 0.5 pL M-MuLV 反轉錄酶（200UVL) 1 μι
[0029] 42°C水浴 lh，70°C處理 5min，-20°C保存備用。
[0030] 2)聚合酶鏈式反應（PCR):
[0031] 以RT合成的第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增，反應體系如下：
[0032]
【權利要求】
1. 一種快速檢測灰飛虱體內水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病毒的方法，其特征在 于：利用RSV-RNA4片段與RBSDV-S2片段之間的一段相似序列合理設計引物，RSRB-R : 5' -CCYATCACAAASAAATMAAAAT-3'，RS-F :5' -AGATCCAGAGAGAGTCACGGAAG-3'，RB-F : 5' -GTTCAAAGACAATACACTCAAAA-3'，其中 RS-F/RSRB-R 配對檢測水稻條紋病毒（1114bp)， RB-F/RSRB-R配對檢測水稻黑條矮縮病毒（414bp)，以實現灰飛風體內水稻條紋病毒和水 稻黑條矮縮病毒的快速同步檢測。
2. 根據權利要求1所述的快速灰飛虱體內水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病毒的方法， 其特征在于反轉錄（RT)反應中使用隨機引物（random hexamers), PCR擴增中的退火溫度 為 46-48 °C。
【文檔編號】C12Q1/68GK104141015SQ201410330961
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月9日 優先權日:2014年7月9日
【發明者】李碩, 季英華, 王喜, 周益軍 申請人:江蘇省農業科學院