與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記及其開發方法

專利名稱：：與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記及其開發方法
技術領域：
：本發明屬于農業生物技術工程，特別涉及與水稻白背飛虱抗性基因相連鎖的分子標記及其獲得方法。
背景技術：
：水稻白背飛虱(Sogatellaftircifera,Horvdth)是我國和東南亞水稻產區的主要害蟲之一，80年代以來，隨著我國高產雜交稻技術的推廣及可能與雜種優勢有關的作物生理因素，白背飛虱已成為水稻主要害蟲。據中國農業年鑒記載，在稻飛虱重發年份，受害面積超過我國水稻總面積的50%。1991年，我國發生的大范圍稻飛虱為害造成近16億公斤稻谷的損失，受害面積達2,933萬hm2;2005年稻飛虱又大爆發，加之與稻縱巻葉螟的疊加效應，稻飛虱為害達2.6億畝次以上。因此，對白背飛虱的防治已成為保障糧食生產的重要內容。大面積種植的主要水稻品種不帶抗性基因，是白背飛虱爆發的內在原因，加上化學肥料的大量施用，茂盛生長的感蟲水稻為白背飛虱的快速繁殖提供了充足的食源。長期以來，白背飛虱的防治主要是依靠施用化學殺蟲劑。然而，農藥殺蟲劑的濫用，殺死了稻田中的稻飛虱天敵，反而誘發白背飛虱的再猖獗。另外，白背飛虱屬大范圍遷飛性害蟲，每年的水稻生長季節，白背飛虱隨春夏暖濕氣流，由南往北逐代逐區遷入我國稻區。白背飛虱發生初期，若蟲的蟲體小，隱蔽性強，不易被農民發現，防治不及時使其得以大量繁殖，蟲害便得以流行；蟲害爆發的水稻成熟灌漿期，稻株長勢旺盛，將殺蟲劑施到稻株基部的操作非常困難，加上成蟲有很好的移動性和較強的抗藥性，結果屢屢造成危害和減產。水稻抗病蟲育種實踐證明，利用抗白背飛虱基因培育新品種是水稻白背飛虱綜合防治中最為經濟有效的方法。栽種的水稻品種即使只帶有中等水平的抗性基因，也足以將白背飛虱的群體控制在造成危害的水平以下，不會導致白背飛虱大爆發、或實際危害及產量損失。另一方面，隨著分子生物學的發展，使難以鑒定、易受環境影響的抗病蟲性狀采用分子輔助育種已成為可能，該技術不僅可在早代進行準確、穩定的選擇，而且可克服分離單株的顯隱性和純雜合問題，從而加速育種進程，提高育種效率，但該技術的基礎是必須擁有優良的目標基因及與之緊密連鎖的分子標記。為實現上述任務，挖掘新的抗性基因，發展緊密連鎖的新標記成為水稻抗白背飛虱分子育種的關鍵。最早對水稻白背飛虱抗性開展分子定位研究的是McCouch，首先應用TN1(臺中本地1號)/IR36近等基因系將^&;jW定位到兩個RFLP標記RG146和RG445之間，但由于該RFLP標記是多拷貝標記，而難以用作選擇標記；此后，『6;/z2和『*/26w也先后被定位，但它們的遺傳距離分別為25.6cM和21.2cM，實際應用仍有很大困難。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記及其開發方法，本發明所得的分子標記與白背飛虱抗性基因緊密連鎖，能用于水稻白背飛虱抗性輔助選擇育種。為了解決上述技術問題，本發明提供一種與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記，以水稻作為物種，該分子標記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5'—3'，RM6917正向CTGGTTGTTTTCTGAACTCCGT反向GCATTAACCATAGCTGTCCACTC;AP4741正向AATCATGCTAGGTTATTACTCG反向GTGCAGAGATCATGCTTTTG。作為本發明的分子標記的改進RM6917定位于水稻第6染色體上；AP4741也定位于水稻第6染色體上。本發明還提供了上述分子標記的開發方法，包括以下步驟1)、以粳稻品種春江06作為抗蟲基因供體親本與作為感蟲品種的臺中本地1號進行雜交，從而獲得作為雜交后代的抗蟲單株；2)、用CTAB(十六烷基三乙基溴化銨，HexadecyltrimethylammoniumBromide)法提取水稻親本幼苗及雜交后代幼苗基因組DNA;3)、采用SSR(簡單重復序列，simplesequencerepeat)和/或STS(序列標簽位點sequence-taggedsite)分子標記方法進行水稻白背飛虱抗性分子標記的篩選；4)、篩選出一個SSR分子標記RM6917和一個STS分子標記AP4741。與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記RM6917和AP4741,具體是用下述方法得到的1)、抗蟲基因供體親本來自中國水稻研究所的粳稻品種春江06(CJ06)，與感蟲品種普通秈稻品種臺中本地l號(TN1)進行雜交，抗、感蟲單株是通過雜交、回交和自交，獲得的抗、感蟲近等基因系用于配組和基因定位。2)、用CTAB法提取水稻親本幼苗及雜交后代幼苗基因組DNA。3)、采用SSR和STS分子標記方法進行水稻白背飛虱抗性分子標記的篩選；4)、篩選出一個SSR分子標記RM6917和一個STS分子標記AP4741,經連鎖分析，發現這兩個標記與水稻抗白背飛虱基因相連鎖。采用SSR和STS分子標記進行篩選與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記的方法具體是(1)、SSR、STS引物在抗、感親本以及它們的雜交后代間DNA多態性分析用SSR標記技術篩選，采用根據Temnykh在2000年發表的分布于水稻12條染色體上的SSR引物，引物委托上海申能博彩公司合成，在PTC-225PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為20ng/ul水稻基因組DNAlul,10xPCRBuffer2.0ul,25mMMgCl22.0ul，2mMdNTP2.0ul,10uM引物2.0ul,5U/ulTaqDNA聚合酶0.2ul，ddH20U.8ul，總體系20ul。反應程序95'C變性5分鐘；94變性1分鐘，55退火1分鐘，72延伸1分鐘，40個循環；72補齊10分鐘；產物檢測在含有0.5^ug/ulEB的4.0X的瓊脂糖你叫電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結果。用STS標記技術篩選，首先對基因組已完成測序的日本晴(^://巧？.血&^&"gojp)和93-ll(http:〃www.rise.genomics.org.cn)的序列進行序列比對，根據日本晴和93-11序列比對的結果設計合適的引物用于CJ06和TN1的多態性篩選，引物委托上海申能博彩公司合成，在PTC-225PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為20ng/ul水稻基因組DNAlul,lOxPCRBuffer2.0ul，25mMMgCl22.0ul,2mMdNTP2.0ul,10uM引物2.0ul，5U/ulTaqDNA聚合酶0.2ul，ddH2011.8ul，總體系20ul。反應程序95。C變性5分鐘；94。C變性1分鐘，52'C退火1分鐘，72'C延伸1分鐘，40個循環；72°C10分鐘；產物檢測在含有0.5%ug/ulEB的4.0%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結果。(2)、分子標記的連鎖分析CJ06和TN1雙親及其后代的白背飛虱抗性鑒定在田間進行，在田間自然誘發條件下，于分蘗早期分別從遷入蟲數、蜜蟲害發生密度和被害程度等方面對雙親及后代分離群體進行抗蟲性鑒定；分別提取抗蟲、感蟲單株的總DNA，用與前面同樣的反應體系、篩選獲得的多態性引物及程序進行單株的PCR擴增，統計抗、感單株標記帶的出現頻率和交換類型并計算交換值，用MapnakerEXP3.0b計算標記與抗蟲基因之間的遺傳距離。本發明是用分子生物學方法以高抗白背飛虱水稻品種CJ06為材料，篩選和尋找新的、而且穩定存在與白背飛虱抗性基因緊密連鎖的分子標記及其方法，用于水稻白背飛虱抗性輔助選擇育種；由于研究所用的材料對白背飛虱表現高抗的特性，其對我國稻區的白背飛虱具有普遍的抗性。另外，根據所得分子標記也有助于水稻抗白背飛虱新基因的克隆。白背飛虱是危害水稻生產的主要蟲害。本發明是利用分子標記方法得到兩個新的與白背飛虱抗性基因緊密連鎖的分子標記。利用這種方法，不僅克服了常規育種方法所需時間周期長等缺點，可以有目標地將抗蟲基因在實驗室內選擇獲得并有目的地進行多個抗性基因的聚合，從而培育出具有穩定抗性的水稻新品種。同時，也可利用這兩個白背飛虱抗性基因分子標記，深入進行抗白背飛虱基因的克隆并對其進行結構和功能分析，這對于進一步了解水稻抗白背飛虱的分子遺傳學機制有積極的意義。因此，本發明結果在水稻育種實踐及抗蟲理論研究上都有重要意義。其優點具體歸納如下(1)本發明的與白背飛虱抗性基因緊密連鎖的分子標記，是在對水稻高抗白背飛虱的CJ06及其抗性穩定的雜交后代單株中獲得的新標記，對水稻白背飛虱具有很強的抗性，而且穩定存在，可用于水稻白背飛虱抗性品種的鑒定和水稻抗蟲后代的輔助選擇育種。(2)本發明所用的材料高抗水稻白背飛虱，還有著較強的抗褐飛虱能力，具有普遍的抗蟲特性。因此，根據所得的分子標記有望克隆到新的白背飛虱抗性基因。(3)為克隆水稻白背飛虱抗性基因、基因序列分析以及轉抗白背飛虱基因水稻研究奠定了良好基礎。下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一歩詳細說明。圖1是兩個水稻品種及其后代基因組DNA的SSR分子標記RM6917篩選電泳譜帶圖2是兩個水稻品種及其后代基因組DNA的STS分子標記AP4741篩選電泳譜帶圖3是檢測分子標記RM6917與抗蟲性連鎖的分子標記的電泳譜帶圖4是檢測分子標記AP4741與抗蟲性連鎖的分子標記的電泳譜帶圖5是SSR分子標記RM6917和STS分子標記AP4741與抗蟲基因間的遺傳距離示意對上述圖1~5中符號分別作如下說明l代表抗蟲親本春江06;2代表感蟲親本TN1;3代表春江06/TNl的F1植株；4,5均代表春江06和TN1雜交后代的抗蟲單株，此抗蟲單株是通過雜交、回交的自交，從抗白背飛虱穩定的高世代株系中得到；即4和5是將春江06的抗蟲基因借助標記輔助選擇技術導入TN1而獲得的抗蟲材料；R代表帶抗白背飛虱基因的雜交后代的抗蟲單株；S代表不帶抗白背飛虱基因的雜交后代的感蟲單株。具體實施例方式實施例1、用SSR分子標記獲得與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記RM6917:具體做法是抗蟲基因供體親本來自中國水稻研究所的粳稻品種春江06(CJ06)，與感蟲品種普通秈稻品種臺中本地1號(TN1)進行雜交，抗蟲單株是通過雜交、回交和自交，獲得的抗、感蟲近等基因系用于配組和基因定位，從該群體后代中鑒定得到76株隱性個體用于連鎖關系分析。以下所有步驟中，沒有詳細告知的均采用去離子水作為溶液。一、提取DNA1)、配制DNA提取緩沖液按順序依次加1體積的DNA提取溶液(0.35Msorbitol;0.1MTris，pH8.2;0.005MEDTA;)，1體積的核裂解液(0.2MTris,pH7.5;0.05MEDTA;2MNaCl;0.055MCTAB;)和0.4體積的5%sarkosyl;最后加入亞硫酸氫鈉，使之終濃度為0.02M。2)、對上述CJ06、TN1和76株抗蟲隱性個體的水稻葉片分別進行如下處理①、稱取0.1g的水稻葉片用液氮研磨成粉狀，然后加入700nl的上述配制的DNA提取緩沖液，65。C水浴40分鐘。再加700|al的氯仿:異戊醇(24:1的體積比)，并混勻。10,000rpm離心5分鐘，將上清液轉移到新的離心管中。②、在上述步驟①離心后所得的上清液中加2/3-1倍體積預冷的異丙醇，輕輕混勻至DNA沉淀。13,000rpm離心8分鐘，倒出上清液。③、再用70。/。的已醇洗滌上述步驟②所得的DNA沉淀物。、將上述洗滌后的DNA涼干并溶于100piTE緩沖液或純水中。、紫外分光光度法檢測上述步驟④所得的DNA樣品的濃度，0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。二、SSR分析根據Temnykh在2000年發表的分布于水稻12條染色體上的SSR引物序列，委托上海申能博彩公司合成引物90對，具體如表l所示表1、合成的90對SSR引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1、PCR擴增(1)、反應體系為水稻基因組DNA20ng/ullul，10xPCRBuffer2.0ul，25mMMgCl22.0ul，2mMdNTP2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ulTaqDNA聚合酶0.2ul，ddH2010.8ul，總體系20ul。(2)、反應程序95'C變性5分鐘；94變性1分鐘，55退火1分鐘，72延伸1分鐘，40個循環；72補齊10分鐘。2、電泳檢測取上述擴增產物20ul，用4.0%的瓊脂糖凝膠(含有0.5^ug/ulEB)電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結果。我們首先利用90對SSR引物對CJ06和TN1進行多態性分析，其中有52對引物在雙親間表現出多態性。進一步用這52對引物對CJ06、TNI和其76株的雜交后代單株進行SSR分析，發現SSR引物RM6917在所有抗蟲的雜交后代單株中均出現抗蟲親本CJ06—樣的帶型。說明SSR引物RM6917與水稻抗白背飛虱特性存在聯系。RM6917引物序列為左翼5'-CTGGTTGTTTTCTGAACTCCGT，(SEQIDNO:1)，右翼5，-GCATTAACCATAGCTGTCCACTC-3，(SEQIDNO:2)，定位于水稻第6染色體上。三、SSR分子標記RM6917的連鎖性鑒定CJ06和TN1雙親及其后代的白背飛虱抗性鑒定在田間進行，在田間自然誘發條件下，于分蘗早期分別從遷入蟲數、蜜露分泌量、蟲害發生密度和被害程度等方面對雙親及后代分離群體進行抗蟲性鑒定；提取隱性的抗蟲單株的總DNA，用與前面同樣的反應體系及程序，用引物RM6917進行單株的PCR擴增，統計抗、感單株標記帶的出現頻率和交換類型并計算交換值，用MapnakerEXP3.0b計算標記與抗蟲基因之間的遺傳距離。以RM6917對雜交后代群體76個單株進行PCR擴增，擴增條件同上。結果顯示，76個抗蟲單株中有72單株的帶型與抗蟲親本CJ06—樣，有4株的帶型同時帶有雙親的帶型，沒發現與感蟲親本TN1帶型一樣的單株。這一實驗結果表明SSR分子標記RM6917與水稻的白背飛虱抗性緊密連鎖的，但在抗蟲單株中仍有一定的交換，如圖3所示，出現雙親帶型的單株表明發生了交換。經計算，其重組率為2.6%，SSR分子標記與抗蟲基因間的遺傳距離為2.6cM。實施例2:用STS分子標記獲得與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記AP4741植物材料同實施例l，具體做法如下-一、提取DNA1)、首先配制DNA提取緩沖液同實施例1。2)、對每種水稻葉片分別進行如下處理同實施例1。二、STS分析STS引物設計根據日本晴和93-11序列比對的結果設計合適的引物用于CJ06和TN1的多態性篩選，委托上海申能博彩公司合成設計的STS引物3對，具體如表2所示表2、合成的3對STS引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>1、PCR擴增(1)、反應體系為水稻基因組DNA20ng/ullul，10xPCRBuffer2.0ul，25mMMgCl22.0ul，2mMdNTP2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ulTaqDNA聚合酶0.2ul，ddH2010.8ul，總體系20ul。(2)、反應程序95'C變性5分鐘；94變性1分鐘，55退火1分鐘，72延伸1分鐘，40個循環；72補齊10分鐘。2、電泳檢測取上述擴增產物20ul，用4.0%的瓊脂糖凝膠(含有0.5^ug/ulEB)電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結果。我們利用3對STS引物對CJ06和TN1進行多態性分析，其中有1對引物在雙親間表現出多態性。進一步用這對引物對CJ06、TN1和其雜交后代單株進行STS分析，發現STS引物AP4741在所有抗蟲的雜交后代單株中均帶有抗蟲親本CJ06—樣的帶型。說明STS引物AP4741與水稻抗白背飛虱特性存在聯系。AP4741引物序列為左翼5，-AATCATGCTAGGTTATTACTCG-3，(SEQIDNO:3)，右翼5，-GTGCAGAGATCATGCTTTTG-3，(SEQIDNO:4)，定位于水稻第6染色體上。三、STS分子標記AP4741的連鎖性鑒定CJ06和TN1雙親及其后代的白背飛虱抗性鑒定在田間進行，在田間自然誘發條件下，于分蘗早期分別從遷入蟲數、蜜露分泌量、蟲害發生密度和被害程度等方面對雙親及后代分離群體進行抗蟲性鑒定；提取隱性的抗蟲單株的總DNA，用與前面同樣的反應體系及程序，用引物AP4741進行單株的PCR擴增，統計抗、感單株標記帶的出現頻率和交換類型并計算交換值，用MapnakerEXP3.0b計算標記與抗蟲基因之間的遺傳距離。以AP4741對雜交后代群體76個單株進行PCR擴增，擴增條件同上。結果顯示，76個抗蟲單株中有71個單株的帶型與抗蟲親本CJ06—樣，有5個單株的帶型同時帶有雙親的帶型，沒發現與感蟲親本TN1帶型一樣的單株。這一實驗結果表明STS分子標記AP4741與水稻的白背飛虱抗性緊密連鎖的，但在抗蟲單株中仍有一定的交換，如圖3示，出現雙親帶型的單株表明發生了交換。經計算，其重組率為3.3%,STS分子標記與抗蟲基因間的遺傳距離為3.3cM。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。序列表SEQIDNO:1ctggttgttttctgaactccgt22SEQIDNO:2gcattaaccatagctgtccaetc23SEQIDNO:3aatcatgctaggttattacteg22SEQIDNO:4gtgcagagatcatgcttttg20權利要求1.一種與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記，以水稻作為物種，其特征是所述分子標記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5′→3′，RM6917正向CTGGTTGTTTTCTGAACTCCGT反向GCATTAACCATAGCTGTCCACTC；AP4741正向AATCATGCTAGGTTATTACTCG反向GTGCAGAGATCATGCTTTTG。2、根據權利要求l所述的與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記，其特征是所述RM6917定位于水稻第6染色體上；所述AP4741也定位于水稻第6染色體上。3、如權利要求1或2所述的分子標記的開發方法，其特征是包括以下步驟1)、以粳稻品種春江06作為抗蟲基因供體親本與作為感蟲品種的臺中本地1號進行雜交，從而獲得作為雜交后代的抗蟲單株；2)、用CTAB法提取水稻親本幼苗及雜交后代幼苗基因組DNA;3)、采用SSR和/或STS分子標記方法進行水稻白背飛虱抗性分子標記的篩選；4)、篩選出一個SSR分子標記RM6917和一個STS分子標記AP4741。全文摘要本發明公開了一種與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記，以水稻作為物種，分子標記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5′→3′；RM6917正向CTGGTTGTTTTCTGAACTCCGT反向GCATTAACCATAGCTGTCCACTC；AP4741正向AATCATGCTAGGTTATTACTCG反向GTGCAGAGATCATGCTTTTG。本發明還同時提供了上述分子標記的開發方法。本發明的分子標記與白背飛虱抗性基因緊密連鎖，能用于水稻白背飛虱抗性輔助選擇育種。文檔編號C12N15/29GK101294161SQ200810061330公開日2008年10月29日申請日期2008年4月22日優先權日2008年4月22日發明者堅劉,張光恒,曾大力,李家洋,江胡,董國軍,郭龍彪,前錢申請人:中國水稻研究所