專利名稱：一種鴨黃病毒及其滅活疫苗的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗鴨黃病毒滅活油乳疫苗的制備方法。
背景技術：
自2010年以來，在華東地區首次發生鴨黃病毒感染蛋鴨引發的鴨產蛋下降-死亡綜合癥的流行，并迅速傳播到浙江、安徽、福建、江蘇等省份的主要養殖場，之后傳播到廣東、山東、河南、河北等省市，到目前為止全國大部分主要水禽養殖地區均已受到該病的威脅。鴨子感染該病毒后，主要的臨床表現為病鴨出現高熱、沉郁、厭食等；蛋鴨出現產蛋量急劇下降甚至停產；肉鴨出現生長遲緩。該病的發病率高達100%，死亡率在5% 10%之間。該病毒屬于黃病毒科、黃病毒屬的坦布蘇病毒。該病在我國屬于首次報道，其病原的生物學特性，分子流行病學和分子致病機理 等方面的研究均剛剛起步，而該病近年來在我國水禽養殖區域的廣泛流行以及其造成的巨大經濟損失，更應加快研究鴨黃病毒病的疫苗的研究。本發明制備的鴨黃病毒疫苗免疫效果較好，能夠較好的預防鴨黃病毒病。
發明內容
本發明的目的是制備一種鴨黃病毒滅活疫苗，以預防鴨黃病毒病的流行。本發明的目的之一是提供一種鴨黃病毒，該病毒株保藏在中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，保藏名稱為鴨黃病毒AH-FlO株，保藏日期2012年4月18日，保藏編號為CCTCC N0:V201213o本發明的另一目的是對所發明的鴨黃病毒疫苗進行免疫效果的評價。本發明鴨黃病毒滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下將病毒第5代雞胚尿囊液(即上述所收獲的病毒尿囊液)中按體積比加入3%。甲醛于37°C搖床滅活36小時，滅活完成后，按體積比滅活病毒液96份，吐溫-80 4份搖勻，即得制苗用抗原，由它做為下步乳化的水相；白油佐劑做為下步乳化油相；按體積比油相3份、水相I份的比例取油相、水相攪拌乳化，制備成鴨黃病毒滅活油乳劑疫苗，并加入體積濃度1%硫柳汞溶液使之中終濃度為萬分之一，搖勻備用。本發明鴨黃病毒的分離方法，其步驟如下從感染鴨黃病毒的病鴨中無菌采集其卵巢病變組織，將其研磨勻漿后反復凍融三次，12000r/min離心lOmin。;無菌條件下取其上清液，將上清液經O. 22um微孔濾膜過濾除菌后接種10日齡SPF (即無特定病原體)雞胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育，棄去24小時內接種死亡的雞胚，收獲48小時至120小時內死亡雞胚尿囊液，連續傳至5代，收獲病毒尿囊液備用。與已有技術相比，本發明有益效果體現在本發明制備鴨黃病毒滅活疫苗的毒株分離自安徽地區，病毒能夠在雞胚中穩定的傳代，針對地方流行的鴨黃病毒病具有更好的保護性。本發明所制備的鴨黃病毒滅活疫苗采用成熟穩定的制作方法，具有較好的免疫效果，對動物的不良反應較小，在當下暫無商品疫苗的情況下，適合小規模的養殖單位對鴨群免疫及科研實驗使用。本發明建立了瓊擴方法檢驗抗體的效價，檢驗結果重復性好，快速準確。
圖I是抗原與周圍六孔的瓊擴抗體之間出現清晰的六條相連的沉淀線圖2是抗原與2°抗血清，2—1抗血清中間出現清晰的沉淀線
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發明技術方案做進一步解釋說明。實施例I
從安徽區域感染鴨黃病毒的病鴨中無菌條件下采集其卵巢等病變組織，將其研磨勻衆后反復凍融三次，12000r/min離心lOmin。無菌條件下取其上清液,將上清液經O. 22um微孔濾膜過濾除菌后接種10日齡SPF (即無特定病原體)雞胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育,棄去24小時內接種死亡的雞胚，收獲48小時至120小時內死亡雞胚的尿囊液，將收獲的一代病毒尿囊液接種10日齡SPF雞胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育。收獲48小時至120小時內死亡雞胚的尿囊液，獲取第二代病毒尿囊液，如此連續傳至5代，收獲尿囊液備用。在收獲的第5代病毒尿囊液中按體積比加入3%。甲醛于37°C搖床滅活36小時，滅活完成后，按滅活病毒液96份，吐溫-80 (即聚山梨酯-80)4份搖勻，即為制苗用抗原做為下步乳化的水相；白油佐劑做為下步乳化油相。按體積比油相3份、水相I份的比例取油相、水相攪拌乳化，制備成鴨黃病毒滅活油乳劑疫苗，并加入1%硫柳汞溶液使之終濃度為萬分之一，搖勻備用。AH-FlO株穩定性試驗將PCR檢測為陽性的鴨黃病毒病料研磨處理后接種10日齡SPF雞胚，每枚O. 2mL。接種后置于38°C孵化箱，連續觀察7天。將24小時至120小時內死亡雞胚收取尿囊液，連續傳至5代，病毒液仍可至雞胚100%死亡，獲得穩定的鴨黃病毒AH-FlO株。疫苗評價試驗從非黃病毒病疫區購買50只30周齡健康產蛋麻鴨(產蛋率為86. 7%)，隨機分為A, B, C，D四組，A，B兩組個15只，C，D兩組各10只。各組之間隔離飼養。A，B兩組實驗鴨分別經頸部皮下注射黃病毒滅活疫苗2mL/只，C，D兩組實驗鴨經頸部皮下注射滅菌后的生理鹽水2mL/只，連續觀察10天，期間各組實驗鴨無不良反應，無發病及死亡現象。實驗鴨會對注射產生應激反應，各組實驗鴨注射疫苗或生理鹽水后3天內，產蛋量有所下降，各組下降率分別為13. 3%，13. 3%，10%, 10%，第4天后漸漸回升，直至一周后恢復到注射前水平。注射疫苗后連續觀察2周，期間各組實驗鴨無發病，產蛋率無異常。注射疫苗后第15天，對A，B, C三組各實驗鴨腿部肌肉注射黃病毒五代病毒尿囊液，每只lmL，D組實驗鴨腿部肌肉注射生理鹽水ImL.連續觀察兩周。結果為免疫后攻毒的A，B組與注射生理鹽水的對照組D組各實驗鴨均無不良反應，產蛋率下降分別為13. 3%, 13. 3%, 10%ο攻毒組C組，攻毒后產蛋量持續快速下降，直至一周后停產。兩周的觀察期滿后，將各組實驗鴨捕殺剖檢發現A，B，D三組各實驗鴨無明顯病變，D組各實驗鴨均出現卵泡萎縮，有散在出血點，腸道、泄殖腔彌漫性出血等病變。由此可見本發明黃病毒滅活疫苗具有良好的安全性，較好的免疫保護性。實施例2以制備的鴨黃病毒滅活油乳劑抗原免疫體型健壯，體重約為2Kg新西蘭大白兔，操作如下于新西蘭大白兔頸部皮下注射油乳劑疫苗O. 5mL/只；兩周后頸部皮下注射油乳劑疫苗ImL/只，進行強化免疫；間隔兩周后用滅活油乳劑疫苗再次強化免疫一次，頸部皮下注射2mL/只，此后每四周加強免疫一次，每次頸部皮下注射油乳劑疫苗2mL/只，第三次免疫的一周后心臟采血，制備抗血清。抗鴨黃病毒多克隆抗體反應性檢測。將收獲的第5代病毒尿囊液中按比例加入3%。甲醛于37°C搖床滅活36小時，制備成瓊擴抗原。在1%的瓊脂糖凝膠平板上用七孔梅花打孔器打孔，中間孔加入瓊擴抗原，周圍六孔加入等量抗鴨黃病毒多克隆兔抗血清，于37°C 濕盒中反應15小時后瓊擴反應出現，中間孔與周圍六孔之間出現清晰的六條相連的沉淀線如圖I所示。抗鴨黃病毒多克隆抗體效價的測定。在1%的瓊脂糖凝膠平板上用七孔梅花打孔器打孔，將兔抗血清用PBS稀釋為2—1，2_2，2_3，2_4，2_5中間孔加入瓊擴抗原，周圍六孔依次加入等量原濃度抗血清，2-1抗血清，T2抗血清，2-3抗血清，抗血清，2-5抗血清，于37°C濕盒中反應20小時后觀察看出，2°抗血清，抗血清，與中間孔之間有沉淀線產生，即抗體效價為1:2，如圖2所示；說明該黃病毒滅活疫苗具有良好的免疫性。
權利要求
1.一種鴨黃病毒，其特征在于，該病毒株保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏名稱為鴨黃病毒AH-FlO株，保藏編號為CCTCC N0:V201213。
2.—種權利要求I所述鴨黃病毒的分離方法，其特征在于，所述分離方法如下從感染鴨黃病毒的病鴨中無菌采集其卵巢病變組織，將其研磨勻漿后反復凍融三次，12000r/min離心lOmin。；無菌條件下取其上清液，將上清液經0. 22um微孔濾膜過濾除菌后接種10日齡SPF雞胚，0. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育，棄去24小時內接種死亡的雞胚，收獲48小時至120小時內死亡雞胚尿囊液，連續傳至5代，收獲病毒尿囊液備用。
3.權利要求I所述的鴨黃病毒在制備鴨黃病毒滅活疫苗中的應用。
4.權利要求3所述的鴨黃病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于，制備步驟如下 取該病毒第5代雞胚尿囊液，按體積比加入3%。甲醛于37°C搖床滅活36小時，滅活完成后，按體積比滅活病毒液96份，吐溫-80 (即聚山梨酯-80) 4份搖勻，即得制苗用抗原，由它做為下步乳化的水相；白油佐劑做為下步乳化油相；按體積比油相3份、水相I份的比例取油相、水相攪拌乳化，制備成鴨黃病毒滅活油乳劑疫苗，并加入體積濃度1%硫柳汞溶液使之中終濃度為萬分之一，搖勻備用。
全文摘要
本發明為一種鴨黃病毒及以該毒株制備油乳滅活疫苗的制備方法，屬于獸醫傳染病領域。所述鴨黃病毒為鴨黃病毒AH-F10株，保藏編號為CCTCC V201213。本發明通過臨床分離純化病毒，將純化后的病毒液經過甲醛滅活，與油乳佐劑乳化后制成鴨黃病毒滅活油乳劑疫苗。本發明所制備的鴨黃病毒滅活疫苗具有較好的免疫效果，對動物的不良反應較小，在暫無商品疫苗的情況下，適合小規模的養殖單位對鴨群免疫及科研實驗使用。
文檔編號C12R1/93GK102757940SQ20121017218
公開日2012年10月31日 申請日期2012年5月29日 優先權日2012年5月29日
發明者占松鶴, 吳啟有, 孫裴, 張建軍, 徐前明, 朱良強, 潘鑫, 王曉旭, 王桂軍, 王漢清, 耿照玉 申請人:安徽農業大學