專利名稱：一種特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量rt-pcr快速診斷試劑盒及其應用方法
一種特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒及其應用方法技術領域
本發明所涉及的一種特異檢測鴨黃病毒野毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒及其應用方法，屬于病毒核酸檢測領域，適用于臨床及科研中對鴨黃病毒的快速定性檢測。
背景技術：
自2010年以來，我國上海、浙江和江蘇等地首次出現了鴨黃病毒感染引起產蛋嚴重下降及蛋鴨的死亡。該病原造成的鴨疫情在世界范圍也屬首次。同年在湖北省一些養鴨場也出現不明原因的產蛋下降，臨床表現為產蛋嚴重下降甚至停止，并有一定的致死率， 剖檢病鴨脾臟呈現明顯腫大，卵巢肉變，卵泡嚴重充血，出血。該病的爆發給養殖戶帶來了巨大的經濟損失。
本課題組對該病進行了系統的流行病學調查、病原分離、動物回歸試驗、病毒部分基因的測序與分析。證 實該疾病是由一種新的黃病毒引起，根據病毒命名的通行規則， 參照病毒分尚地點，將其命名為HBJL株。初步序列分析結果表明該病毒屬于黃病毒科 (Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)蚊媒病毒類的恩塔亞病毒群(Ntaya virus group, NTAV 群)。
鴨黃病毒的基因組為不分節段的單股正鏈RNA，約由11000個核苷酸組成。在2010 年我省蛋鴨群首次爆發產蛋下降疫情時，本課題組進行了大量流行病學調查并進行了病原的分離鑒定工作，參照Tembusu virus NS5基因序列自主設計了特異性檢測引物，將檢測出陽性的病料進行SPF雞胚接種分離出鴨黃病毒湖北毒株HBJL。目前已完成了鴨黃病毒湖北毒株HBJL株部分基因NS5的測定，并提交至美國國家生物信息數據庫(NCBI，登錄號 JF423123)，參考HBJL株的NS5基因設計了引物DFV-F: atgaataaggtggtgaaggtaatgc ；DFV-R cagattcgtgaaagtgttgagagc ；DFV-P: catgactgttttcccatcacgtcccgg。產物長度為 130bp。
由于該病為動物新發疾病，現有的診斷方法非常有限，多是通過傳統的病毒分離培養(Virus Isolation, VI)、聚合酶鏈擴增法(Polymerase Chain Reaction, PCR)來進行該病的確診。因此建立一種快速診斷檢測方法是個迫切需要解決的問題。
熒光定量PCR (Fluorogenetic Quatitative PCR, FQ-PCR)方法是 20 世紀 90 年代中期發展起來的實時定量檢測特定核酸的技術，是在普通PCR的基礎上增加了一條具有高特異性的熒光標記DNA探針，通過始點定量和熒光檢測系統實時監測累積熒光強度而實現對核酸進行定量檢測的。是目前國際上用在病毒檢測上最先進的檢測方法之一，與普通 PCR擴增技術相比具有無法比擬的優點。該技術具有靈敏度高、耗時短、特異性強、無須凝膠電泳、可高通量高效率、定量檢測等優點。發明內容
本發明的目的在于提供一種利用應該熒光定量PCR技術的特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒及其應用方法，該試劑盒能夠特異靈敏地檢測出鴨黃病毒抗原，從而達到快速診斷的目的。
本發明為解決上述技術問題采用的技術方案是一種特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒包括a)RNA裂解液、b)熒光定量反應液、c)鴨黃病毒強陽性質控品、d)陰性質控品，熒光定量反應液含有上游引物DFV-F和下游引物DFV-R以及突光探針DFV-P,上游引物DFV-F序列為atgaataaggtggtgaaggtaatgc 25nt ;下游引物 DFV-R 序列為cagattcgtgaaagtgttgagagc 24nt ;突光探針 DFV-P 序列為catgactgttttcccatcacgtcccgg 27nt,突光探針DFV-P 5 ;端標記的是突光報告基團FAM，3 ;端標記的是熒光淬滅基團TAMRA。
按上述方案，熒光定量反應液由IXPCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs O. 5mM, M-MLV酶50U，Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R為各O. 2 μ M，所述的熒光探針DFV-P為O. 2 μ Μ。
按上述方案，所述的鴨黃病毒強陽性質控品為高滴度的鴨黃病毒監利株，其在鴨胚上增殖，經滅活后得到 ，經測量ELD5tl為103 7/mL。
按上述方案，所述的陰性質控品是采集健康的且無病原的鴨組織，按體積比1:5 加入PBS液，充分勻漿破碎，離心去除沉淀，上清保存備用。
一種特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒的應用方法，其特征在于包括以下步驟1)鴨黃病毒基因組RNA的提取分別向200μI待檢測標本、鴨黃病毒強陽性質控品和陰性質控品中加入ImlRNA裂解液，靜置5min后，加入200 μ I氯仿，高速離心后吸取上清， 上清中加入等體積的異丙醇，再進行冰浴并高速離心沉淀，所得沉淀用75%乙醇洗滌后，用 20 μ I滅菌水溶解，所得溶液即為RNA模板；2)分別取步驟I)得到的RNA模板加入到熒光定量反應液中，用熒光定量檢測儀進行PCR反應并實時檢測反應過程中釋放的熒光強度，PCR反應得到鴨黃病毒特異性擴增目的基因，所述的鴨黃病毒特異性擴增目的基因序列為atg aataaggtgg tgaaggtaat gcgaccggga cgtgatggga aaacagtcat ggatgtcatc tcgcgggaag accagagggg aagtggacag gttgtgactt atgctctcaa cactttcacg aatctgt。
按上述方案，熒光定量反應液由IXPCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs O. 5mM, M-MLV酶50U，Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R為各O. 2 μ M，所述的熒光探針DFV-P為O. 2 μ Μ。
按上述方案，用于熒光定量RT-PCR檢測儀進行PCR反應的反應條件為42 °C反轉錄20min94°C預變性5min94°C變性IOs —— 60°C退火、延伸50s, 50個循環。
本發明與現有技術相比具有以下優點I特異性好，通過特異性引物高特異性擴增和熒光探針的高特異雜交雙重控制，具有很高的準確性，假陽性低；42靈敏度高，反應過程由熒光檢測系統實時監控，熒光檢測系統對熒光信號具有很高的檢測靈敏度；3檢測速度快，不需要另外制備cDNA，為一步法，僅需2個小時，加上核酸的提取，共需 3小時；4沒有后期處理，不用雜交、電泳、拍照等過程，所有試劑均是一次擴增，毋需開蓋，不產生污染。
圖I是標準品10倍梯度稀釋進行熒光定量PCR所得到的擴增曲線，橫坐標代表循環數，縱坐標代表熒光強度，圖中平行原理橫坐標的直線代表熒光閥值，其中，① ⑦依次為10倍稀釋的標準品；圖2是根據標準品10倍稀釋進行熒光定量結果所制作的標準曲線，橫坐標代表樣品稀釋倍數，縱坐標代表熒光ct值。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍。
實施例I特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒1.試劑組成Trizol RNA 裂解液為 Invitrogen 公司產品；Taq 酶(5U/μ L)、dNTPs (IOmM), MgCI2 (25禮)、] -]\0^酶(5(^/^1^均購自Promega公司；PCR引物對DFV-F和DFV-R由上海生工生物工程公司合成；熒光探針由上海基康生物工程公司合成；鴨黃病毒監利株由本實驗室保存；2.試劑配制A)熒光定量反應液1 XPCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs O. 5mM, M-MLV 酶 50U， Taq酶2U，上游引物DFV-F和下游引物DFV-R各O. 2μΜ和熒光探針DFV-P O. 2 μ M 組成；其中上游引物DFV-F序列為atgaataaggtggtgaaggtaatgc 25nt ；下游引物 DFV-R 序列為cagattcgtgaaagtgttgagagc 24nt ;突光探針 DFV-P 序列為 catgactgttttcccatcacgtcccgg 27nt,突光探針DFV-P 5 ;端標記的是突光報告基團FAM, 3 ’端標記的是熒光淬滅基團TAMRA。
B)鴨黃病毒強陽性質控品為高滴度的鴨黃病毒監利株，其在鴨胚上增殖，經滅活后得到，經測量ELD5tl為103 7/mL。
C)陰性質控品采集健康的且無病原的鴨各組織，按體積比1:5加入PBS液，充分勻漿破碎，離心去除沉淀，上清保存備用。
D)自備試劑氯仿、異丙醇、DEPC處理的滅菌雙蒸水配制的75%乙醇。
實施例2特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒的使用方法I、樣本的處理A)被檢樣本為組織樣品取待檢樣本50-100mg于潔凈、滅菌并烘干的勻衆器中，以I: 5體積比加入PBS液，充分勻漿，4000rpm離心lOmin，取100 μ L上清液(每一個反應)轉入無菌的I. 5mL離心管中，編號備用；B)被檢樣本為液體樣本(如全血、血清、鼻拭子等),直接取100μ L轉入無菌的1.5ml 離心管中，編號備用。
2、被檢樣本RNA的提取取η個滅菌的I. 5ml離心管，其中η為被檢樣品數與鴨黃病毒監利株強陽性對照及陰性質控品對照的和；每管分別加入被檢樣本、鴨黃病毒監利株陽性對照及陰性質控品對照各100 μ L，再分別加入500 μ L RNA裂解液，充分混勻，靜置5min ;再加入100 μ L氯仿， 振蕩混勻，4°C 12000rpm離心15min ;吸取上清至另一離心管，加入等體積的異丙醇，冰浴 15min,4°C 12000rpm 離心 IOmin ;棄盡上清，加入 Iml 75% 乙醇，混勻，4°C 12000rpm 離心 IOmin ;徹底棄上清。沉淀常溫干燥5min后，溶解于20 μ L DEPC處理過的滅菌雙蒸水，即得 RNA模板；3、熒光定量PCR反應分別取熒光定量反應液各19 μ L，取第3步所得的RNA模板各I μ L，分別加入不同的 PCR反應管，在熒光定量PCR反應儀上進行PCR檢測。循環條件為42°C 20min 94°C 5min 94°C IOs —— 60°C 50s 擴增50個循環。把熒光檢測的程序設定在每個循環的第二步結束時進行，檢測波長為530nm ；PCR反應得到鴨黃病毒特異性擴增目的基因，所述的鴨黃病毒特異性擴增目的基因序列為atg aataaggtgg tgaaggtaat gcgaccggga cgtgatggga aaacagtcat ggatgtcatc tcgcgggaag accagagggg aagtggacag gttgtgactt atgctctcaa cactttcacg aatctgt0
4、結果判斷A)結果分析條件設定循環結束后，運用儀器自帶軟件分析檢測結果。循環域值(Threshold Cycle,Ct)設定原則根據儀器噪聲情況調整，以Ct值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準；B)質控標準陰性對照無Ct值并且無擴增曲線；陽性對照的Ct值應在20左右并出現典型的擴增曲線；C)結果判定陰性結果判定無Ct值，且無典型的擴增曲線；陽性結果判定Ct值小于30，且出現典型的擴增曲線；實驗灰區Ct值大于35，且出現典型的擴增曲線的樣本建議重做。重做結果出現Ct值和典型的擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
實驗例3特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒的應用 I、靈敏度試驗用標準品進行10倍梯度稀釋的(103 7 10_7 7 ELD5(l/mL)做為模板，在熒光定量PCR儀上檢測，得到實時PCR擴增曲線和標準曲線分別見附圖I和附圖2。檢測出最低病毒量為6I (Γ2· 7ELD5(l/mL。
2、特異性試驗采用特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒對禽流感、禽白血病、禽大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、新城疫、減蛋綜合癥等進行特異性試驗，對上述7種病毒的檢測結果均為陰性。另外，對水及鴨的各種組織檢測結果均為陰性。以上結果充分證明該試劑盒在臨床樣品的檢測中具有很好的特異性。
3、重復性試驗取3份不同病毒水平的鴨黃病毒樣品進行組間重復性檢測，得到表1，算得重復性檢測的組間變異系數β值分別為4. 4%、4. 8%、3· 7%，均小于5%，證明該檢測方法具有很好的特異性。
表I樣品的組間重復性檢測病毒滴度結果
權利要求
1.一種特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒包括a) RNA裂解液、b)突光定量反應液、c)鴨黃病毒強陽性質控品、 d)陰性質控品，熒光定量反應液含有上游引物DFV-F和下游引物DFV-R以及熒光探針 DFV-P,上游引物 DFV-F 序列為atgaataaggtggtgaaggtaatgc 25nt ；下游引物 DFV-R 序列為cagattcgtgaaagtgttgagagc 24nt ;突光探針 DFV-P 序列為 catgactgttttcccatcacgtcccgg 27nt,突光探針DFV-P 5 ;端標記的是突光報告基團FAM, 3 ’端標記的是熒光淬滅基團TAMRA。
2.按權利要求I所述的特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于熒光定量反應液由 IXPCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs O. 5mM, M-MLV酶50U，Taq 酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R為各0.2 μ M，所述的熒光探針DFV-P為O.2 μ M。
3.按權利要求I所述的特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于所述的鴨黃病毒強陽性質控品為高滴度的鴨黃病毒監利株，其在鴨胚上增殖，經滅活后得到，經測量ELD5tl為103 7/mL。
4.按權利要求I所述的特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于所述的陰性質控品是采集健康的且無病原的鴨組織，按體積比1:5加入PBS液，充分勻漿破碎，離心去除沉淀，上清保存備用。
5.權利要求I所述的特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒的應用方法，其特征在于包括以下步驟1)鴨黃病毒基因組RNA的提取分別向200μ I待檢測標本、鴨黃病毒強陽性質控品和陰性質控品中加入ImlRNA裂解液，靜置5min后，加入200 μ I氯仿，高速離心后吸取上清， 上清中加入等體積的異丙醇，再進行冰浴并高速離心沉淀，所得沉淀用75%乙醇洗滌后，用 20 μ I滅菌水溶解，所得溶液即為RNA模板；2)分別取步驟I)得到的RNA模板加入到熒光定量反應液中，用熒光定量檢測儀進行PCR反應并實時檢測反應過程中釋放的熒光強度，PCR反應得到鴨黃病毒特異性擴增目的基因，所述的鴨黃病毒特異性擴增目的基因序列為atg aataaggtgg tgaaggtaat gcgaccggga cgtgatggga aaacagtcat ggatgtcatc tcgcgggaag accagagggg aagtggacag gttgtgactt atgctctcaa cactttcacg aatctgt。
6.按權利要求5所述的一種特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒的應用方法，其特征在于熒光定量反應液由IXPCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs O. 5mM, M-MLV酶50U，Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R為各O. 2 μ M，所述的熒光探針DFV-P為O. 2 μ Μ。
7.按權利要求5或6所述的特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒的應用方法，其特征在于，用于熒光定量RT-PCR檢測儀進行PCR反應的反應條件為·42 °C反轉錄20min·94°C預變性5min·94°C變性IOs —— 60°C退火、延伸50s, 50個循環。
全文摘要
本發明所涉及的一種特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒及其應用方法，試劑盒包括a)RNA裂解液、b)熒光定量反應液、c)鴨黃病毒強陽性質控品、d)陰性質控品，熒光定量反應液含有上游引物DFV-F和下游引物DFV-R以及熒光探針DFV-P，適用于臨床及科研中對鴨黃病毒的快遞定量檢測。本發明具有以下優點特異性好,通過引物高特異性擴增和熒光探針的高特異雜交雙重控制,具有很高的準確性,假陽性低；靈敏度高；檢測速度快，僅2小時，加上核酸的提取，共需3小時左右；沒有后處理，不用雜交、電泳、拍照等過程，不產生污染。
文檔編號C12Q1/68GK102925592SQ201210493140
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者張蓉蓉, 溫國元, 羅青平, 邵華斌, 王紅琳, 楊峻, 艾地云, 羅玲 申請人:湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所