三七總皂苷的微生物發酵提取方法

專利名稱：三七總皂苷的微生物發酵提取方法
技術領域：
本發明涉及一種三七總皂苷的微生物發酵提取法。
背景技術：
三七是五加科人參屬植物，拉丁學名為Panax notoginseng (Burk. ) F. H. Chen,具有散瘀止血、消腫定痛之功效，是傳統的名貴中藥材。三七根中主要的有效成分是達瑪烷型人參皂苷Rbl、Rgl、Rd、Re和三七特有皂苷Rl，以及少量的人參皂苷Rg2、Rhl等20多 種皂苷成分。現代藥理學研究發現，三七總皂苷和其中的部分単體皂苷在血液、心腦血管及神經系統、物質代謝、抗炎、抗氧化及抗腫瘤等方面均有較好的活性。大量研究表明，人參皂苷經ロ服后，在體內逐級代謝為次級苷，最后代謝為苷元，這些次級苷和苷元由于脫去糖基，極性減小，脂溶性増加，作為稀有皂苷才是在體內真正發揮藥理作用的物質。而人參皂苷抗腫瘤活性的構效關系研究也表明低糖鏈的皂苷及苷元具有較強的抗腫瘤作用。因此探究有效的方法從植物中提取出活性成分，并研究合適的方法實現稀有人參皂苷的生物轉化具有重要意義。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種反應條件溫和、提取效率高、能増加稀有皂苷成分提取量的三七總皂苷的微生物發酵提取方法。為了解決上述技術問題，本發明提供一種三七總皂苷的微生物發酵提取方法，包括以下步驟I)、微生物固態發酵將三七根粉與作為營養輔料的麩皮按I. 5 4:1的重量比混合后作為發酵基質，將發酵基質進行滅菌，得滅菌后發酵基質；將pH=7 8、且濃度為O. 2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液進行滅菌，得滅菌后磷酸鹽緩沖溶液；按照每g發酵基質配用1 1. 4ml的pH=7 8、且濃度為O. 2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液的比例；在滅菌后發酵基質中加入滅菌后磷酸鹽緩沖溶液，得發酵底物；然后在無菌條件下進行以下操作按照每g發酵基質配用O. Γ0. 2 mL枯草芽孢桿菌的菌液的接種量，在發酵底物中加入枯草芽孢桿菌的菌液，攪拌均勻后，于34. 8^35. 2°C培養9(Tl00h (最佳為35°C培養96h)，得發酵曲；2)、三七總皂苷的提取將發酵曲用體積濃度為68 72%的こ醇溶液回流提取，こ醇溶液與步驟I)中的發酵基質的用量比為7. 5 8. 5ml (最佳為8ml)的こ醇溶液/g發酵基質；回流提取時間為
I.2^1. Sh (最佳為I. 5h);回流提取結束后，離心，分別得首次上清和殘渣；將殘渣用體積濃度為68 72%的こ醇溶液回流提取，こ醇溶液與步驟I)中的發酵基質的用量比為4. 5飛.5ml (最佳為5ml)的こ醇溶液/g發酵基質；回流提取時間為
I.2 I. 8h (最佳為I. 5h);回流提取結束后，離心，得二次上清；合并首次上清和二次上清，得三七總皂苷提取液。作為本發明的三七總皂苷的微生物發酵提取方法的改進三七根粉為三七根粉碎至能過40目篩。三七根為市售的已經經過常規干燥處理后的三七根，亦稱為三七根生藥，其含水率< 7%。作為本發明的三七總皂苷的微生物發酵提取方法的進ー步改進枯草芽孢桿菌的菌液的制備方法為包括如下步驟 ①、將I g豆柏渣與pH=7 8 (最佳為ρΗ=7· 5)、且濃度為O. 05 mol/L的磷酸鹽緩沖液28 32mL (最佳為30mL)混合，得液體種子發酵培養基，滅菌，得滅菌后液體種子發酵培
養基;②、在無菌條件下，在步驟①所得的滅菌后液體種子發酵培養基中接種Γ2環的枯草芽孢桿菌，于14(Tl60rpm、36. 8^37. 2°C的條件下培養22 26 h (最佳培養條件為于150rpm、37°C的條件下培養24 h);得枯草芽孢桿菌的菌液(即，枯草芽孢桿菌菌的懸液)。經檢測，每ml該枯草芽孢桿菌的菌液中約含有IO7個的枯草芽孢桿菌細胞。作為本發明的三七總皂苷的微生物發酵提取方法的進ー步改進步驟I)中將三七根粉與作為營養輔料的麩皮按7: 3的重量比混合；按照每g發酵基質配用I. 2ml的pH=7. 5、且濃度為O. 2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液的比例；在滅菌后發酵基質中加入滅菌后磷酸鹽緩沖溶液，得發酵底物；按照每g發酵基質配用O. 15 mL枯草芽孢桿菌的菌液的接種量，在發酵底物中加入枯草芽孢桿菌的菌液。備注說明本發明中所述的滅菌均為常規的滅菌方式，即于12(T122°C滅菌18 22min。在本發明中，こ醇溶液的最佳體積濃度為70%。在本發明中，枯草芽孢桿菌例如可購自中國エ業微生物菌種保藏管理中心(CICC)的菌株保藏編號為20627的枯草芽孢桿菌(屬名=Bacillus，種名加詞subtilis)發明人在發明過程中發現三七根的組織細胞壁由纖維素及果膠等物質構成，此夕卜，還含有大量淀粉，而微生物能利用這些大分子物質為碳源生長，產生出豐富酶系，在纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等的協同作用下，破壞植物組織細胞壁的致密結構，使三七皂苷溶出増加，在有效成分暴露后，糖苷酶進一歩水解皂苷配基上的糖鏈，達到生物轉化的效果，反應條件溫和。應用微生物發酵法提取三七皂苷既能使有效成分溶出増加，同時又能轉化生成活性更高的稀有皂苷，相比單純提取具有附加的價值，且目前未見應用微生物發酵法提取三七總皂苷的相關報道。本發明采用微生物固體發酵輔助提取三七總皂苷。該方法在常規醇提エ藝的基礎上，増加了發酵處理步驟，通過微生物產生豐富酶系協同作用，破壞三七根組織細胞壁致密結構，使三七皂苷溶出増加，在有效成分暴露后，糖苷酶進一歩水解皂苷配基上的糖鏈，達到生物轉化的效果，反應條件溫和。利用微生物發酵法提取三七總皂苷，既能提高有效成分的提取率，同時還能轉化生成活性更高的稀有皂苷，相比常規こ醇回流提取具有附加價值。
具體實施例方式實施例I、一種三七總皂苷的微生物發酵提取方法，依次進行以下步驟I)、微生物固態發酵依次進行以下步驟①、制備枯草芽孢桿菌的菌液(即菌懸液)將I g豆柏渣與30mL磷酸鹽緩沖液(pH=7. 5，C=O. 05mol/L)混合，得液體種子發酵培養基，滅菌(12TC滅菌20min)后，得滅菌后液體種子發酵培養基； 無菌操作下接種I環的枯草芽孢桿菌入上述滅菌后液體種子發酵培養基中，于150rpm、37°C的條件下培養24 h后，得枯草芽孢桿菌的菌液。每ml該枯草芽孢桿菌的菌液中約含有IO7個的枯草芽孢桿菌細胞。②、將干燥(含水率< 7%)的三七根(作為三七生藥材)粉碎成能過40目篩的三七根粉，取3g三七根粉和2g麩皮(作為營養輔料，含水率< 7%)混勻后作為發酵基質，將發酵基質于121°C滅菌20min ；將5mL的pH=7. O磷酸鹽緩沖液(C=0. 2mol/mL)于121°C滅菌20min，得已滅菌的pH=7. O 磷酸鹽緩沖液(C=0. 2mol/mL)然后無菌條件下進行以下操作在滅菌后發酵基質中加入已滅菌的pH=7. O磷酸鹽緩沖液(C=0. 2mol/mL), S卩，控制料液比為I: I ;得發酵底物；該發酵底物的初始pH為7. O。在發酵底物中按無菌操作接種O. 75ml枯草芽孢桿菌的菌液，攪拌均勻后，于35°C培養96h，得發酵曲。2)、三七總皂苷的提取在步驟I)所得的全部的發酵曲中加入40mL體積濃度為70%的こ醇溶液回流提取，回流提取的溫度約為80°C，回流提取時間為I. 5h。回流提取結束后，離心(3000轉/分，10分鐘)，分別得首次上清和殘渣。在殘渣中中加入25mL體積濃度為70%的こ醇溶液回流提取，回流提取的溫度約為80°C，回流提取時間為I. 5h。回流提取結束后，離心(3000轉/分，10分鐘)，得二次上清。合并首次上清和二次上清，得約60ml的上清作為三七總皂苷提取物；為了便于測量相應的成分含量的數據，在上述三七總皂苷提取物中加入體積濃度為70%的こ醇溶液定容至IOOmL,得待測三七總皂苷提取物。上述待測三七總皂苷提取物經分光光度法(《中國藥典》2005年版一部附錄 V)及高效液相色譜法(Aik-Jiang Lau, Bee-Hong Seo et al. High-performance丄I quid chromatograpnic method with quantitative comparisons 01 wholechromatograms of raw and steamed Panax notoginsenglJ」· Journal of ChromatographyA, 2004:141-149.)測定提取所得三七總皂苷含量為10.33% (即，每g三七根粉含有相當10. 33% g的三七總皂苷)，其中稀有人參皂苷組分Rhl、FU Rg3含量分別為6. 32mg/g (BP,每g三七根粉中含有相當Rh1的質量為6. 32mg)、2. 54mg/g、3. 26mg/g。實施例2、一種三七總皂苷的微生物發酵提取方法，依次進行以下步驟I)、微生物固態發酵依次進行以下步驟
①、制備枯草芽孢桿菌的菌液同實施例I。②、將干燥(含水率< 7%)的三七根粉碎成能過40目篩的三七根粉，取3. 5g三七根粉和I. 5g麩皮(作為營養輔料，含水率< 7%)混勻后作為發酵基質，將發酵基質于121°C滅菌20min。然后無菌條件下進行以下操作在滅菌后發酵基質中加入6mL已滅菌的pH=7. 5磷酸鹽緩沖液(C=0. 2mol/mL),即，控制料液比為1:1.2 ;得發酵底物；該發酵底物的初始pH為7. 5。在發酵底物中按無菌操作接種O. 75ml的枯草芽孢桿菌的菌液，攪拌均勻后，于35°C培養96h，得發酵曲。2)、三七總皂苷的提取同實施例I。
·
同理，在所得的三七總皂苷提取物中加入體積濃度為70%的こ醇溶液定容至IOOmL,得待測三七總皂苷提取物。經測定上述待測三七總皂苷提取物中三七總皂苷含量為12. 25%，其中稀有人參皂苷組分 Rhl、Fl、Rg3 含量分別為 7. 52mg/g、3. 00mg/g、3. 91mg/g。實施例3、一種三七總皂苷的微生物發酵提取方法，依次進行以下步驟I)、微生物固態發酵依次進行以下步驟①、制備枯草芽孢桿菌的菌液同實施例I。②、將干燥(含水率< 7%)的三七根粉碎成能過40目篩的三七根粉，取4g三七根粉和Ig麩皮(作為營養輔料，含水率< 7%)混勻后作為發酵基質，將發酵基質于121°C滅菌20min ;然后無菌條件下進行以下操作在滅菌后發酵基質中加入6mL已滅菌的pH=8. O磷酸鹽緩沖液(C=0. 2mol/mL),即，控制料液比為1:1.2 ;得發酵底物；該發酵底物的初始pH為8. O。在發酵底物中按無菌操作接種O. 75ml的枯草芽孢桿菌的菌液，攪拌均勻后，于35°C培養96h，得發酵曲。2)、三七總皂苷的提取同實施例I。同理，在所得的三七總皂苷提取物中加入體積濃度為70%的こ醇溶液定容至IOOmL,得待測三七總皂苷提取物。經測定上述待測三七總皂苷提取物中三七總皂苷含量為10. 24%，其中稀有人參皂苷組分 Rhl、Fl、Rg3 含量分別為 6. 27mg/g、2. 44mg/g、3. 32mg/g。對比實驗為證明按照本發明方法提取的優越所在，發明人還進行了如下的對比實驗對比實驗1-1、相對于實施例I作如下更改取消步驟I);在步驟2)中以5g三七根粉末(過40目篩)替代發酵曲，其余同實施例I。同理，在所得的三七總皂苷提取物中加入體積濃度為70%的こ醇溶液定容至IOOmL,得待測三七總皂苷提取物。
經測定上述待測三七總皂苷提取物中三七總皂苷含量為9. 05%，其中稀有人參皂苷組分Rhl、Rg3含量分別為2. 07mg/g、0. 85mg/g, Fl未檢測到。對比實驗1-2、相對于實施例I作如下更改取消步驟I);在步驟2)中以3 g三七根粉末(過40目篩)+2g麩皮替代發酵曲，其余同實施例
Io同理，在所得的三七總皂苷提取物中加入體積濃度為70%的こ醇溶液定容至IOOmL,得待測三七總皂苷提取物。 經測定上述待測三七總皂苷提取物中三七總皂苷含量為9. 12%，其中稀有人參皂苷組分Rhl、Rg3含量分別為2. 25mg/g、0. 91mg/g, Fl未檢測到。對比實驗1-3、相對于實施例I作如下更改取消步驟I);在步驟2)中以3.5 g三七根粉末(過40目篩)+1. 5g麩皮替代發酵曲，其余同實施例I。同理，在所得的三七總皂苷提取物中加入體積濃度為70%的こ醇溶液定容至IOOmL,得待測三七總皂苷提取物。經測定上述待測三七總皂苷提取物中三七總皂苷含量為8. 94%，其中稀有人參皂苷組分Rhl、Rg3含量分別為2. 05mg/g、0. 87mg/g, Fl未檢測到。對比實驗1-4、相對于實施例I作如下更改取消步驟I);在步驟2)中以4g三七根粉末(過40目篩)+Ig麩皮替代發酵曲，其余同實施例
Io同理，在所得的三七總皂苷提取物中加入體積濃度為70%的こ醇溶液定容至IOOmL,得待測三七總皂苷提取物。經測定上述待測三七總皂苷提取物中三七總皂苷含量為8. 67%，其中稀有人參皂苷組分Rhl、Rg3含量分別為2. 29mg/g、0. 88mg/g, Fl未檢測到。對比實驗2-1、相對于實施例2作如下更改將步驟I)中的接種量改成10% (即，接種O. 5ml的枯草芽孢桿菌的菌液)，其余同實施例2。同理，在所得的三七總皂苷提取物中加入體積濃度為70%的こ醇溶液定容至IOOmL,得待測三七總皂苷提取物。經測定上述待測三七總皂苷提取物中三七總皂苷含量為10. 11%，其中稀有人參皂苷組分 Rhl、Rg3 含量分別為 6. 28mg/g、3. 85mg/g, Fl 為 2. 87mg/g。對比實驗2-2、相對于實施例2作如下更改將步驟I)中的接種量改成20% (即，接種I. Oml的枯草芽孢桿菌的菌液)，其余同實施例2。同理，在所得的三七總皂苷提取物中加入體積濃度為70%的こ醇溶液定容至IOOmL,得待測三七總皂苷提取物。經測定上述待測三七總皂苷提取物中三七總皂苷含量為9. 94%，其中稀有人參皂苷組分 Rhl、Rg3 含量分別為 6. 18mg/g、3. 79mg/g, Fl 為 2. 97mg/g。從上述實施例和對比例可看出，經本發明的微生物發酵處理可以提高所得三七總皂苷的含量，實現稀有人參皂苷的生物轉化。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.三七總皂苷的微生物發酵提取方法，其特征是包括以下步驟 1)、微生物固態發酵 將三七根粉與作為營養輔料的麩皮按I. 5 4:1的重量比混合后作為發酵基質，將發酵基質進行滅菌，得滅菌后發酵基質； 將pH=7 8、且濃度為0. 2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液進行滅菌，得滅菌后磷酸鹽緩沖溶液； 按照每g發酵基質配用廣I. 4ml的pH=7 8、且濃度為0. 2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液的比例；在滅菌后發酵基質中加入滅菌后磷酸鹽緩沖溶液，得發酵底物； 然后在無菌條件下進行以下操作 按照每g發酵基質配用0. ro. 2 mL枯草芽孢桿菌的菌液的接種量，在發酵底物中加入枯草芽孢桿菌的菌液，攪拌均勻后，于34. 8^35. 2°C培養9(Tl00h，得發酵曲； 2)、三七總皂苷的提取 將發酵曲用體積濃度為68 72%的乙醇溶液回流提取，所述乙醇溶液與步驟I)中的發酵基質的用量比為7. 5^8. 5ml的乙醇溶液/g發酵基質；回流提取時間為1.2 1.8h ;回流提取結束后，離心，分別得首次上清和殘渣； 將殘渣用體積濃度為68 72%的乙醇溶液回流提取，所述乙醇溶液與步驟I)中的發酵基質的用量比為4. 5^5. 5ml的乙醇溶液/g發酵基質；回流提取時間為I. 2^1. Sh ;回流提取結束后，離心，得二次上清； 合并首次上清和二次上清，得三七總皂苷提取液。
2.根據權利要求I所述的三七總皂苷的微生物發酵提取方法，其特征是所述三七根粉為三七根粉碎至能過40目篩。
3.根據權利要求2所述的三七總皂苷的微生物發酵提取方法，其特征是所述枯草芽孢桿菌的菌液的制備方法為包括如下步驟 ①、將Ig豆柏渣與pH=7 8、且濃度為0. 05 mol/L的磷酸鹽緩沖液28 32mL混合，得液體種子發酵培養基，滅菌，得滅菌后液體種子發酵培養基； ②、在無菌條件下，在步驟①所得的滅菌后液體種子發酵培養基中接種廣2環的枯草芽孢桿菌，于14(Tl60rpm、36. 8^37. 2°C的條件下培養22 26 h ;得枯草芽孢桿菌的菌液。
4.根據權利要求1、2或3所述的三七總皂苷的微生物發酵提取方法，其特征是 所述步驟I)中 將三七根粉與作為營養輔料的麩皮按7:3的重量比混合； 按照每g發酵基質配用I. 2ml的pH=7. 5、且濃度為0. 2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液的比例；在滅菌后發酵基質中加入滅菌后磷酸鹽緩沖溶液，得發酵底物； 按照每g發酵基質配用0. 15 mL枯草芽孢桿菌的菌液的接種量，在發酵底物中加入枯草芽孢桿菌的菌液。
全文摘要
本發明公開了一種三七總皂苷的微生物發酵提取方法，包括以下步驟1)、微生物固態發酵將三七根粉與麩皮按1.5~4:1的重量比混合后作為發酵基質，在滅菌后發酵基質中加入滅菌后磷酸鹽緩沖溶液，得發酵底物；在發酵底物中加入枯草芽孢桿菌的菌液，培養，得發酵曲；2)、三七總皂苷的提取將發酵曲用乙醇溶液回流提取，所得的殘渣重復用乙醇溶液回流提取；合并兩次回流提取所得的上清，得三七總皂苷提取液。本發明的三七總皂苷的微生物發酵提取方法，具有反應條件溫和、提取效率高、能增加稀有皂苷成分提取量的特點。
文檔編號C12P33/20GK102676627SQ20121018578
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月5日 優先權日2012年6月5日
發明者于海寧, 楊婧娟, 沈生榮 申請人:浙江大學