專利名稱：一種靶向cd123陽性白血病細胞的溶瘤腺病毒構建方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及溶瘤腺病毒基因治療領域，尤其是涉及一種靶向CD123陽性白血病細胞的溶瘤腺病毒構建方法及其用途。
背景技術：
腫瘤的祀向基因-病毒治療是結合基因治療和病毒治療的一種新策略，這種策略 利用溶瘤病毒在腫瘤細胞內的增殖、裂解來提高治療基因的抗癌作用。治療基因主要包括(I)抑癌基因，如p53和Rb。(2)免疫治療基因，包括一些細胞因子，如IL-24，以及供免疫細胞識別的腫瘤抗原。(3)自殺基因，如HSV-TK和CD，主要通過將細胞內原有的無毒性的物質轉化成具細胞毒性的產物，從而導致細胞死亡。(4)抗血管生成基因，如K5，抑制腫瘤組織血管生成。病毒載體主要有腺病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、痘苗病毒及皰疹性口炎病毒等。其中腺病毒以其致病性低、宿主范圍廣、包裝容量大等特點成為應用最廣的病毒載體。目前對5型腺病毒(Ad5)的研究已很成熟，因此Ad5成為用于腫瘤基因治療的主要腺病毒載體。Ad5對細胞的感染高度依賴細胞表面的柯薩奇-腺病毒受體(Coxsakie andadenovirus receptor, CAR),但白血病細胞和近50%的上皮細胞源性的腫瘤細胞表面缺乏CAR，使Ad5難以感染這些細胞。而另一方面，腫瘤細胞又往往高表達一些區別于絕大部分正常細胞的膜蛋白，如急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)細胞包括AML干細胞高表達⑶123 (IL-3受體a鏈)、⑶44以及⑶47，而大部分正常造血干細胞卻不表達這些蛋白。目前，利用白血病細胞表面⑶123靶點進行靶向治療的技術主要包括2個方面，一是利用⑶123單克隆抗體，一是將⑶123的天然配體IL-3 (白細胞介素-3)連接上毒性蛋白如白喉毒素。兩種技術均能在一定程度上清除CD123陽性的白血病細胞，但缺點是都不甚徹底。溶瘤腺病毒的優勢是不但可以通過自身的復制裂解癌細胞，還可通過復制使自身攜帶的抗癌基因拷貝數成百上千地增加，從而達到更為理想的抗癌效果，但目前還沒有利用溶瘤腺病毒來靶向CD123的技術。要利用Ad5溶瘤腺病毒來靶向CD123陽性白血病細胞，需要克服使Ad5溶瘤腺病毒通過CD123而不是通過其天然受體CAR來感染白血病細胞這一技術困難。
發明內容
本發明的目的之一在于建立一個通過修飾Ad5溶瘤腺病毒的外殼纖維(Fiber)使其經由CD123進入白血病細胞、裂解細胞的系統。該系統基于配體(Ligand)和受體(Receptor)特異識別的原理，使Ad5溶瘤腺病毒攜帶sCAR_IL3融合基因，sCAR (solubleCAR)是CAR的膜外片段，IL-3是⑶123的天然配體。溶瘤腺病毒在HEK293細胞內包裝過程中即表達該融合蛋白，通過sCAR和Fiber的結合組裝到溶瘤腺病毒外殼，而IL-3部分則能特異識別CD123，因此得到的溶瘤腺病毒可特異感染CD123陽性的白血病細胞。溶瘤腺病毒感染CD123陽性白血病細胞后不但能在靶細胞內復制，還能繼續表達SCAR-IL3融合蛋白，完成溶瘤腺病毒外殼的修飾，因此復制出的新病毒能啟動對靶細胞的新一輪感染，以達到高感染率。另外，溶瘤腺病毒在此基礎上進一步武裝抗癌基因，以達到較好的抗白血病效果。靶向CD123陽性白血病細胞的溶瘤腺病毒的構建方法，所述方法構建的溶瘤腺病毒攜帶SCAR-IL3表達框或攜帶SCAR-IL3表達框和外源抗癌基因表達框，具體的構建方法包括如下步驟
1)構建SCAR-IL3的表達框；
2)酶切回收SCAR-IL3的表達框，插入到pXC2-sp-ElA質粒相應酶切位點，獲得pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒；
3)pXC2質粒在刪除ElB后在原位置引入酶切位點，插入外源抗癌基因表達框構建得 到 pXC2- A ElB-gene 質粒；通過酶切連接將 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA質粒上的 sCAR-IL3_sp片段置換到 PXC2- A ElB-gene 質粒上，構建得到 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene 質粒;
4)pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒及 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene 質粒分別和PBHGE3骨架質粒共轉染HEK293細胞，在HEK293細胞內完成溶瘤腺病毒Ad_sCAR_IL3_sp_ElA 和溶瘤腺病毒 Ad_sCAR_IL3_sp_ElA_ A ElB_gene 的組裝；
5)分離純化溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene。所述的溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB-gene是由腫瘤特異啟動子控制復制的條件復制型腺病毒。所述的溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp_ElA和/或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB-gene是通過刪除病毒基因獲得的條件復制型腺病毒。所述的外源抗癌基因包括IL-24、TRAIL、MnS0D、smac、p53、PPA中的一種或多種。所述的溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene 用于制備抗腫瘤藥物。本申請包括如下有益效果
(I)根據配體和受體的特異識別設計而成，對表達CD123的白血病細胞具有較好的靶向性。(2)sCAR-IL3融合基因裝載在溶瘤腺病毒的基因組，該融合基因可在HEK293細胞內病毒包裝時就得以表達，以非共價的方式修飾到溶瘤腺病毒表面。(3) SCAR-IL3融合基因由于是裝載在溶瘤腺病毒的基因組，因此當溶瘤腺病毒感染腫瘤細胞并在細胞內復制時，該融合基因可獲表達并修飾到溶瘤腺病毒表面，因此復制出來的新病毒的表面都將組裝有SCAR-IL3融合蛋白，可進一步感染更多的CD123+白血病細胞，達到高感染率。(4)構建的溶瘤腺病毒有供抗癌基因插入的位點，抗癌基因隨著病毒復制其拷貝數大幅度升高，實現對腫瘤細胞的高效殺傷能力。(5)根據抗癌基因的不同,可形成一系列的Ad-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene,如武裝 IL-24 抗癌基因，則形成 Ad-sCAR-IL3-sp-ElA- A E1B-IL24。
(6)使用條件復制型溶瘤腺病毒，因此構建的溶瘤腺病毒可在腫瘤細胞內高度復制，卻不能在正常細胞內復制，以此實現對正常細胞無毒性或低毒性，達到腫瘤靶向治療的目的。(7)可進一步使用不同類型的條件復制型溶瘤腺病毒載體，可形成一系列攜帶SCAR-IL3和抗癌基因表達框的溶瘤腺病毒，以靶向⑶123陽性的白血病細胞。當然實施本發明的任一技術方案并不一定同時達到以上所述的所有有益效果。
圖 I. pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒和 pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA-A ElB-gene 質粒的構建方法。其中pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA是將sCAR_IL3表達框插入pXC2_sp_ElA的XhoI位點構建而成；pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB-gene 是對 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA 質粒進行NheI及AleI雙酶切后回收含sCAR-IL3-sp的片段，對pXC2_ A ElB-gene進行同樣的雙酶切回收大片段，將兩個回收的片段連接起來構建而成。 圖2.溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA成功感染CD123+白血病細胞系KG-1。Western blot檢驗病毒ElA和sCAR_IL3蛋白在KG-1細胞內的表達。圖3.溶瘤腺病毒 Ad-sCAR-IL3-sp-ElA-AE1B-IL24 相比較對照病毒 Ad-sp-ElA及Ad-sCAR-IL3-sp-ElA顯示出較強的抑制KG-I細胞增殖的能力，這種抑制作用呈現出劑量依賴的特征。
具體實施例方式靶向CD123陽性白血病細胞的溶瘤腺病毒的構建方法，所述方法構建的溶瘤腺病毒攜帶SCAR-IL3表達框或攜帶SCAR-IL3表達框和外源抗癌基因表達框，具體的構建方法包括如下步驟
1)構建SCAR-IL3的表達框；
2)酶切回收SCAR-IL3的表達框，插入到pXC2-sp-ElA質粒相應酶切位點，獲得pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒；
3)pXC2質粒在刪除ElB后在原位置引入酶切位點，插入外源抗癌基因表達框構建得到 pXC2- A ElB-gene 質粒；通過酶切連接將 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA 質粒上的 sCAR-IL3_sp片段置換到 PXC2- A ElB-gene 質粒上，構建得到 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene 質粒;
4)pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒及 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene 質粒分別和PBHGE3骨架質粒共轉染HEK293細胞，在HEK293細胞內完成溶瘤腺病毒Ad_sCAR_IL3_sp_ElA 和溶瘤腺病毒 Ad_sCAR_IL3_sp_ElA_ A ElB_gene 的組裝；
5)分離純化溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene。所述的溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB-gene是由腫瘤特異啟動子控制復制的條件復制型腺病毒。所述的溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB-gene是通過刪除病毒基因獲得的條件復制型腺病毒。
所述的外源抗癌基因包括IL_24、TRAIL、MnS0D、smac、p53、PPA中的一種或多種。所述的溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp_ElA和/或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene 用于制備抗腫瘤藥物。實施例I.
除特別說明外，本發明可采用本領域常規技術。I)構建SCAR-IL3的表達框
獲取 sCAR 基因(GenBank accession no. Y07593)。利用 PCR 方法對 HEK293 細胞的總cDNA 進行 sCAR 基因的擴增，上游引物 5’ -TACTCATATGGCGCTCCTGCTGTGCTT-3，(引物 1)，下游引物 5’ -TGGCTCGAGAGCTTTATTTGAAGGAGGGAC-3 (引物 2)，擴增產物兩端為MZeI 和ZAoI 酶切位點。擴增產物以酶切連接的方法連接在pET-28a質粒，形成pET-28a-sCAR。pET_28a質粒購自德國Novagen公司。構建pET-28a_sCAR-Linker質粒，即在sCAR序列下游加入Linker序列,Linker的作用為減少sCAR和IL-3之間的干擾,保證正確的蛋白三級結構。Linker通過合成獲得，正義鏈為 5，-TCGAGCCATCAGCCTCCGCATCTGCTTCCGCCCCTGGATCCGCGGCCGCCATTGAGGGCCGCT-3 ’(Linker 正義鏈)，反義鏈為 5’ -TCGAAGCGGCCCTCAATGGCGGCCGCGGATCCAGGGGCGGAAGCAGATGCGGAGGCTGATGGC-3’ (Linker反義鏈)，兩條鏈經過退火形成雙鏈，以酶切連接的方法連接入pET-28a-sCAR的沿ol位點，同時，Linker序列內部具備及麗TI和艙(1位點，供IL-3基因插入。構建pET-28a-sCAR-Linker-IL3 質粒，即在 pET-28a_sCAR-Linker 的位點插入IL-3基因。IL-3基因購自武漢三鷹生物技術有限公司。以PCR方法擴增去掉信號肽序列的 IL-3 基因片段，上游引物為 5’ -TCAGCGGCCGCCGCTCCCATGACCCAGACAACGT-3，(引物 3 )，下游引物為 5 ’ -TCAGCGGCCGCAAGCTTTCAAAAGATCGAGAGAAAGTC-3 ’(引物 4 )。擴增片段5’端為艙(1位點，3’端為Z/i/^III和艙打位點。擴增片段以酶切連接方法連入pET-28a-sCAR-Linker 的位點，形成 pET-28a-sCAR-Linker_IL3 質粒。構建pQE30-sCAR-IL3 質粒。以 pET-28a-sCAR-Linker_IL3 質粒為模板 PCR 方法擴增 SCAR-IL3 融合基因，上游引物為 5’ -TTCAAGCTTATGGCGCTCCTGCTGTGCTTCGT-3’ (引物5 )，下游引物為 5 ’ -TCAGCGGCCGCAAGCTTTCAAAAGATCGAGAGAAAGTC-3 ’(引物 6 )，同 IL-3 基因擴增的下游引物。擴增片段兩端有Z/i/^III酶切位點，經酶切連接的方法連入PQE30質粒(購自德國Qiagen公司)的歷/^111位點，形成口0￡30-8041 -113，該質粒還可用于sCAR_IL3的原核表達。利用pQE30-sCAR-IL3質粒，sCAR_IL3融合基因可通過歷III酶切回收。pMD18_T simple -CMV-SV40 Poly A質粒的構建。該質粒由 pMD18_T simple 質粒(購自大連TaKaRa生物技術公司)和pCA13質粒(購自加拿大Microbix Biosystem Inc公司)構建而成，目的是將PCA13質粒上的CMV-SV40 Poly A表達框插入pMD18_T simple質粒，形成中間質粒PMD18-T simple -CMV-SV40 Poly A，方便插入外源基因。利用PCR法回收PCA13質粒上的表達框，上游引物為5' -GTCGACTAATTCCCTGGCATTATGC-3'(引物7);下游引物為 5' -GTCGACACGATCCAGACATGATAAG-3'(引物 8)。將 PCR 所得的 574 bp CMV-SV40Poly A 片段與 pMD18_T simple 載體連接形成 pMD18_T simple-CMV_SV40 Poly A 質粒。pMD18-T simple -CMV-sCAR-IL3_SV40 Poly A 質粒的構建。M Hind III 酶切pQE30-sCAR-IL3質粒回收sCAR_IL_3片段，利用酶切連接的方法將sCAR_IL_3片段連入PMD18-T simple-CMV-SV40 Poly A，即形成 pMD18_T simple -CMV-sCAR-IL3-SV40 Poly A質粒。2)從 pMD18_T simple -CMV-sCAR-IL3_SV40 Poly A 質粒質粒上酶切回收CMV-sCAR-IL3-SV40 Poly A表達框片段，將表達框連入pXC2_sp-ElA質粒，即形成pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA 質粒。Survivin 啟動子(sp)片段可利用 I 和I 酶切位點連接入pXC2質粒(購自加拿大Microbix Biosystem Inc公司)，即形成pXC2_sp-ElA,此質粒的ZAo I位點用于表達框的插入。 3) pXC2質粒在刪除ElB后在原位置引入酶切位點得到pXC2_ A ElB質粒，插入外源抗癌基因表達框則構建得到PXC2- A ElB-gene質粒；通過酶切連接將pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒上的 sCAR-IL3_sp 片段置換到 pXC2_ A ElB-gene 質粒上，構建得到 pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB-gene 質粒；
以pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA- A E1B-IL24為例，構建步驟如圖I所示。將IL-24表達框插入pXC2- A ElB質粒即形成pXC2- A E1B-IL24質粒。pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒可與 pXC2- A E1B-IL24 質粒重組，形成pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA- A E1B-IL24 質粒。利用 Nhe\ 和 AJeI 雙酶切穿梭質粒pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA,回收2546bp片段，該片段含sCAR_IL3表達框和sp啟動子。質粒pXC2- A E1B-IL24同樣用船el和雙酶切，回收大片段8766bp大片段。兩個片段通過連接，形成 pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA- A E1B-IL24 質粒。4)pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒及 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene 質粒分別和PBHGE3骨架質粒共轉染HEK293細胞，在HEK293細胞內完成溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA 和溶瘤腺病毒 Ad-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene 的組裝；分離純化溶瘤腺病毒 Ad- sCAR_IL3_sp_ElA 和溶瘤腺病毒 Ad_sCAR_IL3_sp_ElA_ A ElB_gene。pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒及 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA- A E1B-IL24 質粒可分別與腺病毒骨架質粒PBHGE3質粒共同轉染HEK293細胞，10-14天出現病毒空斑，經過3輪病毒空斑純化，即可得到不含野生型病毒污染的溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA或Ad-sCAR-IL3-sp-ElA- A E1B-IL24。溶瘤腺病毒的鑒定。提取病毒DNA，利用PCR方法進行鑒定。鑒定sCAR_IL3的上游引物為 5 ’ -ATGGCGCTCCTGCTGTGCTT-3，(引物 9 )，下游引物為 5 ’ -TCACTGTTGAGCCTGCG-3，(引物10)，如正確可擴增出1137 bp的條帶。鑒定是否含野生型病毒的上游引物為5' -CGCGGGAAAACTGAATAAGA-3'(引物 11 )，下游引物為 5' -ACCGCCAACATTACAGAGTCG-3'(引物12)，溶瘤腺病毒能擴增出2300bp的條帶，野生型病毒能擴增出500bp的條帶。檢測溶瘤腺病毒在體外對白血病細胞的感染能力和殺傷效果。檢測Ad-sCAR-IL3-sp_ElA對CD123+的急性髓性白血病細胞KG-1的感染能力。將KG-I以5xl05/孔培養在6孔板中，將Ad- sCAR-IL3-sp-ElA-及對照病毒Ad. sp-ElA以50、100M0I的量加入(空白對照不加病毒)，繼續培養48小時后收集細胞，利用細胞蛋白提取液提取蛋白，Western blot方法鑒定病毒ElA和基因sCAR_IL3的表達。結果如圖2所示，空白對照和對照病毒處理組未檢出ElA和SCAR-IL3的表達，但Ad-sCAR-IL3-sp-ElA 處理組明顯表達 ElA 和 sCAR_IL3，表明 Ad-sCAR-IL3_sp-ElA 可成功感染⑶123+白血病細胞。
將KG-I 以 IxlO4/ 孔培養在 96 孔板中，將 Ad-sCAR-IL3_sp-ElA、Ad-sCAR-IL3-sp-ElA-AE1B-IL24 或對照病毒 Ad. sp-ElA 以 0、5、10、50、100M0I 的量加入，各病毒重復6個孔，另外6孔不加病毒作為空白對照，繼續培養96小時，利用MTT法檢測細胞存活率。結果如圖3所示，Ad-sCAR-IL3-sp_ElA-AE1B-IL24在體外顯著殺傷KG-I細胞。實施例2
I)SCAR-IL3的表達框的構建同實施例I。2)質粒 pXC2-sCAR-IL3-sp_ElA 的構建同實施例 I。3) pXC2質粒在刪除ElB后在原位置引入酶切位點得到pXC2_ A ElB質粒，插入外源抗癌基因表達框構建得到pXC2-A ElB-gene質粒；通過酶切連接將 pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒上的 sCAR-IL3_sp 片段置換到 pXC2_ A ElB-gene 質粒上，構建得到 pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB-gene 質粒；
以 pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA- A E1B-TRAIL 為例，構建步驟如圖 I 所示。在質粒pXC2- A ElB上插入TRAIL表達框，即構成pXC2- A E1B-TRAIL質粒。pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒可與質粒 pXC2- A E1B-TRAIL 重組，形成pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA- A E1B-TRAIL 質粒。利用 Nhe\ 和 AJeI 雙酶切穿梭質粒pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA,回收2546bp小片段，該片段含sCAR_IL3表達框和sp啟動子。質粒pXC2- A E1B-TRAIL同樣用Nhel和雙酶切，回收大片段。兩個片段通過連接，形成pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA- A E1B-TRAIL 質粒。4) pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA- A E1B-TRAIL 質粒和 pBHGE3 骨架質粒共轉染 HEK293細胞，在J1EK293細胞內完成溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA- A E1B-TRAIL的組裝；分離純化溶瘤腺病毒 Ad-sCAR-IL3-sp-ElA- A E1B-TRAIL。溶瘤腺病毒的鑒定。提取病毒DNA，利用PCR方法對病毒進行鑒定。鑒定SCAR-IL3的上游引物為5，-ATGGCGCTCCTGCTGTGCTT-3’(引物9)，下游引物為5，-TCACTGTTGAGCCTGCG-3’(引物10)，如正確可擴增出1137 bp的條帶。鑒定是否含野生型病毒的上游引物為5 ' -CGCGGGAAAACTGAATAAGA-3 '(引物11 )，下游引物為5' -ACCGCCAACATTACAGAGTCG-3'(引物12)，溶瘤腺病毒能擴增出2300bp的條帶，野生型病毒能擴增出500bp的條帶。同理，通過在pXC2- A ElB質粒上插入MnSOD、smac、p53或PPA (掌葉半夏凝集素)的表達框就可構建出 pXC2- A EIB-MnSOD、pXC2- A ElB-smac、pXC2- A ElB-p53 或pXC2- A ElB-PPA質粒，這些質粒通過上述方法與pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA質粒重組，可構建出 pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB-MnSOD, pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-smac,pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB_p53 或 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-PPA 質粒，它們分別與PBHGE3骨架質粒共轉染HEK293細胞，在HEK293細胞內完成溶瘤腺病毒 Ad-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB-MnSOD, Ad-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-smac,Ad-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB_p53 或 Ad-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-PPA 的組裝。溶瘤腺病毒的鑒定方法同上。
本發明不局限于以上實施方式，有些基于本發明的技術方案變型，比如利用不同的中間質粒構建上述的溶瘤腺病毒，或以其它類型的溶瘤腺病毒攜帶SCAR-IL3和外源抗癌基因表達框，或以其它的外源抗癌基因取代上述的外源抗癌基因，或利用不同的溶瘤腺病毒包裝體系來包裝上述溶瘤腺病毒，均應認為在本發明的保護范圍之內。 序列表
弓丨物 I 5’-tactcatatggcgctcctgctgtgctt-3’
弓丨物 2: 5’-tggctcgagagctttatttgaaggagggac-3’
linker 正義鏈 5' -tcgagccatcagcctccgcatctgcttccgcccctggatccgcggccgccattgagggccgct-3’
linker 反義鏈 5’ -tcgaagcggccctcaatggcggccgcggatccaggggcggaagcagatgcggaggct gatggc_3，
弓丨物 3 5’-tcagcggccgccgctcccatgacccagacaacgt-3’
弓 I物 4 5’-tcagcggccgcaagctttcaaaagatcgagagaaagtc-3’
弓 I物 5 5’-ttcaagcttatggcgctcctgctgtgcttcgt-3’
弓丨物 6 5’-tcagcggccgcaagctttcaaaagatcgagagaaagtc-3’
弓丨物 7 5’-gtcgactaattccctggcattatgc-3’
弓丨物 8 5’-gtcgacacgatccagacatgataag-3’
弓丨物 9 5’ -atggcgctcctgctgtgctt-3’
引物 10 5，-tcactgttgagcctgcg-3，
弓 I物 11 5’-cgcgggaaaactgaataaga_3’
弓 I物 12 5’-accgccaacattacagagtcg-3’
權利要求
1.一種靶向CD123陽性白血病細胞的溶瘤腺病毒的構建方法，其特征在于，所述方法構建的溶瘤腺病毒攜帶SCAR-IL3表達框或攜帶SCAR-IL3表達框和外源抗癌基因表達框，具體的構建方法包括如下步驟 1)構建SCAR-IL3的表達框； 2)酶切回收SCAR-IL3的表達框，插入到pXC2-sp-ElA質粒相應酶切位點，獲得pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒； 3)pXC2質粒在刪除ElB后在原位置引入酶切位點，插入外源抗癌基因表達框構建得到 pXC2- AElB-gene 質粒；通過酶切連接將 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA質粒上的 sCAR-IL3_sp片段置換到 PXC2- A ElB-gene 質粒上，構建得到 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene 質粒; 4)pXC2-sCAR-IL3-sp-ElA 質粒及 pXC2-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene 質粒分別和PBHGE3骨架質粒共轉染HEK293細胞，在HEK293細胞內完成溶瘤腺病毒Ad_sCAR_IL3_sp_ElA 和溶瘤腺病毒 Ad_sCAR_IL3_sp_ElA_ A ElB_gene 的組裝； 5)分離純化溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene。
2.如權利要求I所述的靶向CD123陽性白血病細胞的溶瘤腺病毒的構建方法，其特征在于，所述的溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB-gene是由腫瘤特異啟動子控制復制的條件復制型腺病毒。
3.如權利要求I所述的靶向CD123陽性白血病細胞的溶瘤腺病毒的構建方法，其特征在于，所述的溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA- A ElB-gene是通過刪除病毒基因獲得的條件復制型腺病毒。
4.如權利要求I所述的靶向CD123陽性白血病細胞的溶瘤腺病毒的構建方法，其特征在于，所述的外源抗癌基因包括IL-24、TRAIL、MnS0D、smac、p53、PPA中的一種或多種。
5.一種如權利要求I所述方法構建的靶向CD123陽性白血病細胞的溶瘤腺病毒的用途，其特征在于，所述的溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-IL3_sp-ElA- A ElB-gene 用于制備抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發明公開了一種靶向CD123陽性白血病細胞的溶瘤腺病毒構建方法及其用途。構建sCAR-IL3的表達框；插入到pXC2-sp-E1A,獲得pXC2-sCAR-IL3-sp-E1A；pXC2插入外源抗癌基因表達框構建得到pXC2-△E1B-gene；將pXC2-sCAR-IL3-sp-E1A上的sCAR-IL3-sp片段置換到pXC2-△E1B-gene上，構建得到pXC2-sCAR-IL3-sp-E1A-△E1B-gene；分別和pBHGE3骨架質粒共轉染HEK293細胞，完成溶瘤腺病毒的組裝。對表達CD123的白血病細胞具有較好的靶向性，抗癌基因隨著病毒復制其拷貝數大幅度升高，從而實現對腫瘤細胞的高效殺傷能力。
文檔編號C12N7/01GK102747046SQ20121020463
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者劉新垣, 張艷紅, 李恭楚, 李新, 李曉艷, 武虎, 陳磊, 駱菁菁 申請人:浙江理工大學