專利名稱：一種用于降解石油的固體微生物菌劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于微生物菌劑技術領域，具體涉及一種用于降解石油的固體微生物菌劑及其制備方法。
背景技術：
石油類污染物的危害主要表現在對人和動物、土壤和天然水體的危害和影響。石油排入土壤后，會影響土壤的通透性，土壤顆粒受石油污染后不易被水所浸潤，形不成有效的土壤內導水通路，滲水量下降，透水性降低，而且積聚在土壤中的石油烴，絕大部分是高分子有機物，它們粘著在植物根系上形成一層粘膜，阻礙根系的呼吸與水分的吸收，甚至引起根系的腐爛。另外，石油富含反應基團，它們會與無機氮、磷結合，并抑制硝化作用和脫磷酸作用，從而減少土壤有效態氮、磷含量。 生物修復是指在污染環境中加入一些物質(如營養、O2、微生物)或提高這些物質的能力，使天然生物降解過程加速的生物技術。石油污染土壤的生物修復技術根據具體操作以及菌種的來源可以分為自然衰減法、生物刺激法和生物強化法。自然衰減法和生物刺激法對污染物的降解效率低，且易產生遷移性更強的中間產物，因此應用不廣泛。通過微生物操作篩選能夠降解石油烴污染物的微生物，并作為外源高效菌種添加到污染土壤中，降解轉化石油烴污染物的方法即為生物強化法。理論上生物強化修復技術可以通過添加外來高效石油烴降解菌來實現石油烴的高效去除。但由于石油烴組成復雜，毒性強，且生物可用性降低等原因使原位生物強化修復的效率低。同時外來菌種受生態系統中環境因素的復雜性和波動性的沖擊，接種微生物數量和活性迅速降低至無法達到預期目標，外源微生物的生存能力、活性以及遷移能力與環境因素之間的關系直接決定著生物強化修復的治理效果。制約生物強化修復技術發展的主要生態原因有生物因素和非生物因素。多數非生物因素可以通過工程措施，如調解土壤含水量、pH、添加有機碳源和無機營養物等進行調控；在生物強化修復過程中，受土壤多相復雜結構的限制，外源微生物在土壤中遷移困難，造成微生物無法與污染物有效接觸并攝取污染物，微生物對污染物攝取困難是原位生物修復的一個瓶頸。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術的不足，提供一種用于降解石油的固體微生物菌劑。該固體微生物菌劑可將有益微生物引入土壤中，優化土壤微生物體系，改善土壤的物理性狀，增強土壤的生物活性，修復板結退化的土壤，是生態環保的綠色菌劑。在土壤中施加固體微生物菌劑可促進作物的生長，并降解和轉化土壤中的石油污染物，還可增強作物的抗逆性、提高作物產量。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種用于降解石油的固體微生物菌劑，其特征在于，由以下重量份的成分混合制成微生物菌肥85 90份，藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的混合發酵液10 15份；所述固體微生物菌劑的含水量為5wt% 15wt% ;所述混合發酵液中的藤黃微球菌含量為I. OX IO8個/mL I. OX IO9個/mL，蠟狀芽孢桿菌含量為I. OX IO7個/mL I. OX 101°個/mL，短小芽孢桿菌含量為1.0X IO9個ZmT, I. OX IO11個ZmT,;所述藤黃微球菌為Micrococcus Iuteus,保藏編號CGMCC No. 6072，保藏日期為2012年5月3日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；所述蠟狀芽孢桿菌為Bacillus cereus，保藏編號CGMCC No. 6074，保藏日期為2012年5月3日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；所述短小芽孢桿菌為Bacillus pumilus，保藏編號CGMCC No. 6073，保藏日期為2012年5月3日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。上述的一種用于降解石油的固體微生物菌劑，由以下重量份的成分混合制成微生物菌肥89份，藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的混合發酵液11份；所述固體微生物菌劑的含水量為9. 5wt%。上述的一種用于降解石油的固體微生物菌劑，所述微生物菌肥中有效活菌數^ O. 8億個/g，有機質質量含量不低于25%，腐殖酸質量含量 不低于20%，氮、磷和鉀的總質量含量不低于5%。所述重量份可以為克、兩、斤、公斤、噸等重量計量單位。本發明還提供了上述用于降解石油的固體微生物菌劑的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟步驟一、將藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌分別接種于固體培養基中進行培養，得到藤黃微球菌一級菌種、蠟狀芽孢桿菌一級菌種和短小芽孢桿菌一級菌種；步驟二、將步驟一中所述一級菌種分別接種于液體培養基中進行培養，得到藤黃微球菌二級菌種、蠟狀芽孢桿菌二級菌種和短小芽孢桿菌二級菌種；步驟三、將步驟二中所述藤黃微球菌二級菌種、蠟狀芽孢桿菌二級菌種和短小芽孢桿菌二級菌種按照2 4:3 5:2 4的體積比混合后接種于發酵培養基中進行混合發酵培養，得到藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的混合發酵液；步驟四、將微生物菌肥與步驟三中所述混合發酵液按重量份配比混合均勻，得到可降解石油的微生物菌劑。上述的方法，步驟一中所述固體培養基為牛肉膏蛋白胨固體培養基，培養的溫度為37±1°C，培養時間為24h 36h。上述的方法，步驟二中所述液體培養基為牛肉膏蛋白胨液體培養基，培養的溫度為28±1°C，培養時間為24h 36h。上述的方法，步驟三中所述發酵培養基的組成為酵母粉40g 100g，K2HPO4Ig,CaCl2O. lg, MgSO4 · 7H20 I. 5g，MnSO4O. lg，蒸餾水定容至 1L，pH 值為 7· 2 7· 4。上述的方法，步驟三中所述發酵培養的接種量為2% 8%，培養溫度為28± 1°C，培養時間為24h 36h。本發明所述藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的篩選和鑒定方法為I、篩選方法步驟一、富集將從西安市未央區長安大學渭水校區陜西省地下水與生態環境工程研究中心試驗場土壤石油污染10000mg/kg修復區IOcm左右紅三葉草根際修復區采集的土樣以無菌方式稱取10. Og,接入100. OmL石油/無機鹽液體培養基中，置于28土1°C、130r/min恒溫搖床富集培養7d ;然后吸取5mL培養液重新轉接入新鮮的石油/無機鹽液體培養基中，再進行3次富集、馴化，每次7d ;所述石油/無機鹽液體培養基的組成為=NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 · 7H20 O. 05%, KCl O. 05%, FeSO4 · 7H20
O.001%, CaCl2O. 0002%,蒸餾水lOOOmL，原油(延長石油脫水原油)O. 5%，以上均為質量百分t匕，培養基 pH 值 7. O 7. 5，105KPa 滅菌 20min 25min ；步驟二、篩選和純化將步驟一中富集培養后的富集培養液按十倍稀釋法稀釋，取10_4、10_5、10_63個稀釋度的培養液各O. ImL涂布于石油/無機鹽固體平板培養基上，置于37土 1°C恒溫培養箱內培養48h，選取不同顏色及形態的優勢單菌落，在石油/無機鹽固體平板培養基上進行多次劃線分離，以純化得到形態一致的純化菌株，將純化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固體培養基上進行進一步篩選、活化，得到菌株，待用；所述石油/無機鹽固體平板培養基的組成為=NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 · 7H20 O. 05%, KClO. 05%，FeSO4 · 7H20 O. 001%, CaCl2O. 0002%，瓊脂 2%，蒸餾水 lOOOmL，原油(延長石油脫水原 油)0. 5%,以上均為質量百分比，培養基pH值7. O 7. 5，105KPa滅菌20min 25min ；步驟三、復篩將步驟二中活化好的菌株分別接種于IOOmL含有lwt%正十二烷和lwt%環己烷的無機鹽液體培養基中，28土 rC、130r/min搖床培養，當培養液明顯渾濁后，取ImL培養液接種到含lwt%正十二烷和lwt%環己烷的無機鹽固體培養基中培養，然后再將培養的菌株接種于IOOmL含有lwt%正十二烷和lwt%環己烷的無機鹽液體培養基中培養，如此重復3次，保存最終仍能使含有正十二烷和環己烷的無機鹽液體培養基變渾濁的菌株，共三株。2、鑒定方法步驟一、提取總DNA 101、分別取過夜培養的三株菌株(至多2X IO9個)，10000r/min離心Imin收集菌體，加入 180μ L 溶菌溶液(20mg/mL 溶菌酶，20mMTris_HClpH8，2. 5mMEDTA,l%TritonX-100)，重懸菌液，37°C水浴30min 60min ;然后向重懸菌液中添加20 μ L蛋白酶K溶液(10mg/mL)，充分振蕩混勻，56°C水浴30min至細胞完全裂解，接著加入200 μ L溶液BD，充分振蕩混勻，70°C水浴lOmin，再加入200 μ L無水乙醇，充分振蕩混勻；102、將吸附柱放入收集管中，用移液器將101中振蕩混勻后的菌液全部加入吸附柱中，靜置2min, 12000r/min離心3min,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 μ L溶液PW,10000r/min離心Imin,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 μ L漂洗溶液Wash buffer, 10000r/min離心lmin，倒掉濾液；將吸附柱放入收集管中，于12000r/min離心2min，除去殘留的漂洗液 Washbuffer ；103、取出吸附柱，放入一個新的1.5mL的離心管，加入5(^1^預熱(60°0的洗脫液Elution buffer,靜置3min, 10000r/min室溫離心lmin,收集DNA溶液；采用濃度為2%瓊脂糖對提取的總DNA進行檢測，片段大小在13kb左右；步驟二、16SrDNA的PCR擴增以步驟一中提取的總DNA為模板進行PCR擴±曾，PCR反應體系DNA模板lOpmol，上游引物(10 μ M) I μ 1，下游引物(10 μ Μ) I μ I ;dNTP (IOMm) I μ I ； 10 X Taq reaction Buffer 5 μ I ； Taq (5U/ μ I) 0. 25 μ I ;加水至 50 μ I ;PCR反應條件預變性98°C 5min;循環95°C 35s，55°C 35s，72°C 30s，35個循環，最后72°C延伸8min，4°C保存；所述PCR擴增的引物序列為
上游引物(SEQID NO. I) :5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’ ；下游引物(SEQID NO. 2) :5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ ；步驟三、菌株16SrDNA序列分析及比對對步驟二中PCR擴增的產物(片段大小1.4kb左右)進行測序，得到的三株菌株的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 4和SEQ ID NO. 5)分別與GenBank中已發表的藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)的16SrDNA序列、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)的16SrDNA序列和短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)的16SrDNA序列進行同源性比較，相似度分別為99. 0%、100%和100%。綜合生理生化鑒定、16SrDNA序列分析鑒定結果，鑒定本發明的三株菌株分別為藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。本發明的固體微生物菌劑的使用方法為可在種植作物前施用于土壤或者作物種植后追施于土壤，用量以石油污染土壤的重量的1%與底肥混拌施用。 本發明采用的藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌均源于土壤，因此固體微生物菌劑進入土壤后很快形成優勢菌群，占據一定生態位；另外，這三種菌均具有促進植物根生長、改善根圍生態環境的作用。本發明與現有技術相比具有以下優點I、本發明的固體微生物菌劑可將有益微生物引入土壤中，優化土壤微生物體系，改善土壤的物理性狀，增強土壤的生物活性，修復板結退化的土壤。2、本發明的固體微生物菌劑可促進作物的生長，并降解和轉化土壤中的石油污染物。3、本發明的固體微生物菌劑可增強作物的抗逆性、提高作物產量，是生態環保的綠色菌劑。下面通過實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。
具體實施例方式菌株篩選步驟一、富集將從西安市未央區長安大學渭水校區陜西省地下水與生態環境工程研究中心試驗場土壤石油污染10000mg/kg修復區IOcm左右紅三葉草根際修復區采集的土樣以無菌方式稱取10. Og,接入100. OmL石油/無機鹽液體培養基中，置于28土1°C、130r/min恒溫搖床富集培養7d ;然后吸取5mL培養液重新轉接入新鮮的石油/無機鹽液體培養基中，再進行3次富集、馴化，每次7d ;所述石油/無機鹽液體培養基的組成為=NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 · 7H20 O. 05%, KCl O. 05%, FeSO4 · 7H20
O.001%, CaCl2O. 0002%,蒸餾水lOOOmL，原油(延長石油脫水原油)0. 5%，以上均為質量百分t匕，培養基 pH 值 7. O 7. 5，105KPa 滅菌 20min 25min ；步驟二、篩選和純化將步驟一中富集培養后的富集培養液按十倍稀釋法稀釋，取10_4、10_5、10_63個稀釋度的培養液各0. ImL涂布于石油/無機鹽固體平板培養基上，置于37土 1°C恒溫培養箱內培養48h，選取不同顏色及形態的優勢單菌落，在石油/無機鹽固體平板培養基上進行多次劃線分離，以純化得到形態一致的純化菌株，將純化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固體培養基上進行進一步篩選、活化，得到菌株，待用；所述石油/無機鹽固體平板培養基的組成為=NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 · 7H20 0. 05%, KClO.05%，FeSO4 · 7H20 0. 001%, CaCl2O. 0002%，瓊脂 2%，蒸餾水 lOOOmL，原油(延長石油脫水原油)O. 5%,以上均為質量百分比，培養基pH值7. O 7. 5，105KPa滅菌20min 25min ；步驟三、復篩將步驟二中活化好的菌株分別接種于IOOmL含有lwt%正十二烷和1被％環己烷的無機鹽液體培養基中，28±11、1301·/!^!!搖床培養，當培養液明顯渾濁后，取ImL培養液接種到含lwt%正十二烷和lwt%環己烷的無機鹽固體培養基中培養，然后再將培養的菌株接種于IOOmL含有lwt%正十二烷和lwt%環己烷的無機鹽液體培養基中培養，如此重復3次，保存最終仍能使含有正十二烷和環己烷的無機鹽液體培養基變渾濁的菌株，共三株，分別命名為4006、4033和4070。菌株鑒定步驟一、提取總DNA 101、分別取過夜培養的三株菌株(至多2X IO9個)，10000r/min離心Imin 收集菌體，加入 180μ L 溶菌溶液(20mg/mL 溶菌酶，20mMTris_HClpH8，2. 5mMEDTA,l%TritonX-100)，重懸菌液，37°C水浴30min 60min ;然后向重懸菌液中添加20 μ L蛋白酶K溶液(10mg/mL)，充分振蕩混勻，56°C水浴30min至細胞完全裂解，接著加入200 μ L溶液BD，充分振蕩混勻，70°C水浴lOmin，再加入200 μ L無水乙醇，充分振蕩混勻；102、將吸附柱放入收集管中，用移液器將101中振蕩混勻后的菌液全部加入吸附柱中，靜置2min, 12000r/min離心3min,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 μ L溶液PW,10000r/min離心lmin,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 μ L漂洗溶液Wash buffer, 10000r/min離心lmin，倒掉濾液；將吸附柱放入收集管中，于12000r/min離心2min，除去殘留的漂洗液 Washbuffer ；103、取出吸附柱，放入一個新的1.5mL的離心管，加入5(^1^預熱(60°0的洗脫液Elution buffer,靜置3min, 10000r/min室溫離心lmin,收集DNA溶液；采用濃度為2%瓊脂糖對提取的總DNA進行檢測，片段大小在13kb左右；步驟二、16SrDNA的PCR擴增以步驟一中提取的總DNA為模板進行PCR擴±曾，PCR反應體系DNA模板lOpmol，上游引物(10μΜ)1μ1，下游引物(10 μ Μ) I μ I ；dNTP (IOMm) I μ I ； 10 X Taq reaction Buffer 5 μ I ;Taq (5U/μ I) 0. 25 μ I ;加水至 50 μ I ;PCR反應條件預變性 98°C 5min ;循環 95°C 35s，55°C 35s，72°C 30s，35 個循環，最后 72°C延伸8min，4°C保存；所述PCR擴增的引物序列為上游引物(SEQID NO. I) :5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’ ；下游引物(SEQID NO. 2) :5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ ；步驟三、菌株16SrDNA序列分析及比對對步驟二中PCR擴增的產物(片段大小1.4kb左右)進行測序，得到的三株菌株的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 4和SEQ ID NO. 5)分別與GenBank中已發表的藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)的16SrDNA序列、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)的16SrDNA序列和短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)的16SrDNA序列進行同源性比較，相似度分別為99. 0%、100%和100%。綜合生理生化鑒定、16SrDNA序列分析鑒定結果，鑒定本發明的三株菌株分別為藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌，并分別命名為藤黃微球菌Micrococcus Iuteus4006，保藏編號CGMCC No. 6072，蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus 4033，保藏編號CGMCCNo. 6074，短小芽孢桿菌 Bacillus pumilus 4070，保藏編號 CGMCC No. 6073。
本發明的固體微生物菌劑及其制備方法通過以下實施例I至實施例4進行描述以下實施例所用牛肉膏蛋白胨固體培養基的組成為牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g,瓊脂15g 20g，蒸餾水定容至1L，培養基pH值為7. 2 7. 4。所用牛肉膏蛋白胨液體培養基的組成為牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaC15g，蒸餾水定容至1L，培養基pH值為7. 2 7. 4。所用發酵培養基的組成為酵母粉40g 100g，K2HPO4Ig, CaCl2O. lg, MgSO4 · 7H20
I.5g，MnSO4O. Ig,蒸餾水定容至1L，培養基pH值為7. 2 7. 4。實施例I本實施例的用于降解石油的固體微生物菌劑，由以下成分混合制成微生物菌肥90g,藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus 4006，保藏編號CGMCC No. 6072)、臘狀芽抱桿菌 (Bacillus cereus 4033,保藏編號 CGMCC No. 6074)和短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus4070，保藏編號CGMCC No. 6073)的混合發酵液IOg ;所述固體微生物菌劑的含水量為5wt% ；所述混合發酵液中的藤黃微球菌含量為I. O X IO8個/mL I. O X IO9個/mL，蠟狀芽孢桿菌含量為I. OX IO7個/mL I. OX 101°個/mL，短小芽孢桿菌含量為I. OX IO9個/mL
I.OX IO11個/mL ;所述微生物菌肥為西安德龍生物科技有限公司生產的12菌微生物菌肥，菌肥中有效活菌數> O. 8億個/g,有機質質量含量不低于25%,腐殖酸質量含量不低于20%,氮、磷和鉀的總質量含量不低于5%。本實施例的固體微生物菌劑的制備方法包括以下步驟步驟一、將藤黃微球菌(MicrococcusIuteus 4006,保藏編號CGMCC No. 6072)、臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus 4033，保藏編號CGMCC No. 6074)和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus 4070，保藏編號CGMCC No. 6073)分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基中，在溫度為37±1°C的條件下培養24h 36h，得到藤黃微球菌一級菌種、蠟狀芽孢桿菌一級菌種和短小芽孢桿菌一級菌種；步驟二、將步驟一中所述藤黃微球菌一級菌種、蠟狀芽孢桿菌一級菌種和短小芽孢桿菌一級菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在溫度為28±1°C的條件下培養24h，得到藤黃微球菌二級菌種、蠟狀芽孢桿菌二級菌種和短小芽孢桿菌二級菌種；所述培養過程中調節搖床轉速為130rpm 150rpm ；步驟三、將步驟二中所述藤黃微球菌二級菌種、蠟狀芽孢桿菌二級菌種和短小芽孢桿菌二級菌種按照232的體積比混合后接種于發酵培養基中進行混合發酵培養，得到藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的混合發酵液；所述發酵培養的接種量為8%，培養溫度為28 ± I °C，培養時間為36h ；步驟四、將90g微生物菌肥與IOg步驟三中所述混合發酵液混合均勻，得到可降解石油的微生物菌劑。本實施例制備的固體微生物菌劑中的有效活菌數為I. OX IO9Cfu/克 I. OxiO11Cfu/ 克。實施例2本實施例的用于降解石油的固體微生物菌劑，由以下成分混合制成微生物菌肥85kg,藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus 4006,保藏編號CGMCC No. 6072)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus 4033,保藏編號 CGMCC No. 6074)和短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus4070，保藏編號CGMCC No. 6073)的混合發酵液15kg ;所述固體微生物菌劑的含水量為15wt% ;所述混合發酵液中的藤黃微球菌含量為I. O X IO8個/mL I. O X IO9個/mL，蠟狀芽孢桿菌含量為I. O X IO7個/mL I. O X 101°個/mL，短小芽孢桿菌含量為I. O X IO9個/mL
I.OX IO11個/mL ;所述微生物菌肥為西安德龍生物科技有限公司生產的12菌微生物菌肥，菌肥中有效活菌數> O. 8億個/g,有機質質量含量不低于25%,腐殖酸質量含量不低于20%,氮、磷和鉀的總質量含量不低于5%。本實施例的固體微生物菌劑的制備方法包括以下步驟步驟一、將藤黃微球菌(MicrococcusIuteus 4006,保藏編號CGMCC No. 6072)、臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus 4033，保藏編號CGMCC No. 6074)和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus 4070，保藏編號CGMCC No. 6073)分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基中，在溫度為37土1°C的條件下培養36h，得到藤黃微球菌一級菌種、蠟狀芽孢桿菌一級菌種和短小芽 孢桿菌一級菌種；步驟二、將步驟一中所述藤黃微球菌一級菌種、蠟狀芽孢桿菌一級菌種和短小芽孢桿菌一級菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在溫度為28±1°C的條件下培養36h，得到藤黃微球菌二級菌種、蠟狀芽孢桿菌二級菌種和短小芽孢桿菌二級菌種；所述培養過程中調節搖床轉速為130rpm 150rpm ；步驟三、將步驟二中所述藤黃微球菌二級菌種、蠟狀芽孢桿菌二級菌種和短小芽孢桿菌二級菌種按照454的體積比混合后接種于發酵培養基中進行混合發酵培養，得到藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的混合發酵液；所述發酵培養的接種量為2%，培養溫度為28±1°C，培養時間為36h ；步驟四、將85g微生物菌肥與15g步驟三中所述混合發酵液混合均勻，得到可降解石油的微生物菌劑。本實施例制備的固體微生物菌劑中的有效活菌數為I. OX IO9Cfu/克 I. OxiO11Cfu/ 克。實施例3本實施例的用于降解石油的固體微生物菌劑，由以下成分混合制成微生物菌肥89g,藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus 4006，保藏編號CGMCC No. 6072)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus 4033,保藏編號 CGMCC No. 6074)和短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus4070，保藏編號CGMCC No. 6073)的混合發酵液Ilg ;所述固體微生物菌劑的含水量為9. 5wt% ;所述混合發酵液中的藤黃微球菌含量為I. OX IO8個/mL I. OX IO9個/mL，蠟狀芽孢桿菌含量為I. OX IO7個/mL I. O X 101°個/mL，短小芽孢桿菌含量為I. OX IO9個/mL I. OX IO11個/mL ;所述微生物菌肥為西安德龍生物科技有限公司生產的12菌微生物菌肥，菌肥中有效活菌數> O. 8億個/g,有機質質量含量不低于25%,腐殖酸質量含量不低于20%，氮、磷和鉀的總質量含量不低于5%。本實施例的固體微生物菌劑的制備方法包括以下步驟步驟一、將藤黃微球菌(MicrococcusIuteus 4006,保藏編號CGMCC No. 6072)、臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus 4033，保藏編號CGMCC No. 6074)和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus 4070，保藏編號CGMCC No. 6073)分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基中，在溫度為37±1°C的條件下培養30h，得到藤黃微球菌一級菌種、蠟狀芽孢桿菌一級菌種和短小芽孢桿菌一級菌種；步驟二、將步驟一中所述藤黃微球菌一級菌種、蠟狀芽孢桿菌一級菌種和短小芽孢桿菌一級菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在溫度為28±1°C的條件下培養30h，得到藤黃微球菌二級菌種、蠟狀芽孢桿菌二級菌種和短小芽孢桿菌二級菌種；所述培養過程中調節搖床轉速為130rpm 150rpm ；步驟三、將步驟二中所述藤黃微球菌二級菌種、蠟狀芽孢桿菌二級菌種和短小芽孢桿菌二級菌種按照343的體積比混合后接種于發酵培養基中進行混合發酵培養，得到藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的混合發酵液；所述發酵培養的接種量為5%，培養溫度為28±1°C，培養時間為30h ； 步驟四、將89g微生物菌肥與Ilg步驟三中所述混合發酵液混合均勻，得到可降解石油的微生物菌劑。本實施例制備的固體微生物菌劑中的有效活菌數為I. OX IO9Cfu/克 I. OxiO11Cfu/ 克。實施例4本實施例的用于降解石油的固體微生物菌劑，由以下成分混合制成微生物菌肥87g,藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus 4006，保藏編號CGMCC No. 6072)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus 4033,保藏編號 CGMCC No. 6074)和短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus4070，保藏編號CGMCC No. 6073)的混合發酵液13g ;所述固體微生物菌劑的含水量為llwt%;所述混合發酵液中的藤黃微球菌含量為I. OX IO8個/mL I. OX IO9個/mL，蠟狀芽孢桿菌含量為I. OX IO7個/mL I. O X 101°個/mL，短小芽孢桿菌含量為I. OX IO9個/mL I. OX IO11個/mL ;所述微生物菌肥為西安德龍生物科技有限公司生產的12菌微生物菌肥，菌肥中有效活菌數> O. 8億個/g,有機質質量含量不低于25%,腐殖酸質量含量不低于20%，氮、磷和鉀的總質量含量不低于5%。本實施例的固體微生物菌劑的制備方法包括以下步驟步驟一、將藤黃微球菌(MicrococcusIuteus 4006,保藏編號CGMCC No. 6072)、臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus 4033，保藏編號CGMCC No. 6074)和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus 4070，保藏編號CGMCC No. 6073)分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基中，在溫度為37±1°C的條件下培養24h，得到藤黃微球菌一級菌種、蠟狀芽孢桿菌一級菌種和短小芽孢桿菌一級菌種；步驟二、將步驟一中所述藤黃微球菌一級菌種、蠟狀芽孢桿菌一級菌種和短小芽孢桿菌一級菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在溫度為28±1°C的條件下培養28h，得到藤黃微球菌二級菌種、蠟狀芽孢桿菌二級菌種和短小芽孢桿菌二級菌種；所述培養過程中調節搖床轉速為130rpm 150rpm ；步驟三、將步驟二中所述藤黃微球菌二級菌種、蠟狀芽孢桿菌二級菌種和短小芽孢桿菌二級菌種按照I:I:I的體積比混合后接種于發酵培養基中進行混合發酵培養，得到藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的混合發酵液；所述發酵培養的接種量為4%，培養溫度為28±1°C，培養時間為32h ；步驟四、將87g微生物菌肥與13g步驟三中所述混合發酵液混合均勻，得到可降解石油的微生物菌劑。
本實施例制備的固體微生物菌劑中的有效活菌數為I. OX IO9Cfu/克 I. OxiO11Cfu/ 克。本發明研究了藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌對原油的降解能力，以及固體微生物菌劑的應用效果。一、對原油的降解能力試驗配制原油液體培養基(NaNO3L5g，(NH4)SO4L 5g, K2HPO4Ig, MgSO4 · 7H20 O. 5g,KCl 0. 5g，FeSO4 · 7H20 0. Olg, CaCl2O. 002g，蒸餾水 lOOOmL，原油 10g)，將原油液體培養基分為五組空白對照組、藤黃微球菌組、蠟狀芽孢桿菌組、短小芽孢桿菌組和混合細菌組(藤黃微球菌、臘狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌混合)；分別將藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus4006，保藏編號 CGMCC No. 6072)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus4033，保藏編號 CGMCCNo. 6074)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus 4070，保藏編號CGMCC No. 6073)接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基上活化24h，然后分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基內活化24h，再按照2% 8%的接種量將藤黃微球菌菌液接種于藤黃微球菌組培養基中，將蠟狀芽孢桿菌菌液接種于蠟狀芽孢桿菌組組培養基中，將短小芽孢桿菌菌液接種于短小芽孢桿菌組培養基中，將藤黃微球菌菌液、蠟狀芽孢桿菌菌液和短小芽孢桿菌菌液按照I : I : I的體積比混合后接種于混合細菌組，空白對照組不接種細菌；將各組置于搖床上培養，調節搖床轉速為130rpm 150rpm, 28± 1°C條件下培養7d ;培養結束后，向各組中分別加入石油醚,離心打破水包油乳液，有機相用顆粒狀無水硫酸鈉過濾脫水后稀釋，于260nm波長處，用Icm石英比色杯，以石油醚為空白，在UV7501型紫外可見分光光度計下測定OD值，計算培養基中的殘油含量。采用公式(I)計算總石油烴的生物降解率(Π%)，結果見表I :η%= ( ω0-ωχ) /ω0χ 100%(I)式中為原油液體培養基的原油含量；ωχ為各組的殘油含量。表I總石油烴降解率結果
權利要求
1.一種用于降解石油的固體微生物菌劑，其特征在于，由以下重量份的成分混合制成微生物菌肥85 90份，藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的混合發酵液10 15份；所述固體微生物菌劑的含水量為5wt% 15wt% ;所述混合發酵液中的藤黃微球菌含量為I. O X IO8個/mL I. O X IO9個/mL，蠟狀芽孢桿菌含量為I. O X IO7個/mL 1.0X 101°個/mL，短小芽孢桿菌含量為I. O X IO9個/mL I. O X IO11個/mL ;所述藤黃微球菌為Micrococcus luteus4006,保藏編號CGMCC No. 6072 ;所述臘狀芽抱桿菌為Bacilluscereus4033,保藏編號CGMCC No. 6074 ;所述短小芽抱桿菌為Bacillus pumilus4070,保藏編號 CGMCC No. 6073 ο
2.根據權利要求I所述的一種用于降解石油的固體微生物菌劑，其特征在于，由以下重量份的成分混合制成微生物菌肥89份，藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的混合發酵液11份；所述固體微生物菌劑的含水量為9. 5wt%。
3.根據權利要求I或2所述的一種用于降解石油的固體微生物菌劑，其特征在于，所述微生物菌肥中有效活菌數> O. 8億個/g,有機質質量含量不低于25%,腐殖酸質量含量不低于20%，氮、磷和鉀的總質量含量不低于5%。
4.一種制備如權利要求I或2所述用于降解石油的固體微生物菌劑的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 步驟一、將藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌分別接種于固體培養基中進行培養，得到藤黃微球菌一級菌種、蠟狀芽孢桿菌一級菌種和短小芽孢桿菌一級菌種； 步驟二、將步驟一中所述一級菌種分別接種于液體培養基中進行培養，得到藤黃微球菌二級菌種、蠟狀芽孢桿菌二級菌種和短小芽孢桿菌二級菌種； 步驟三、將步驟二中所述藤黃微球菌二級菌種、蠟狀芽孢桿菌二級菌種和短小芽孢桿菌二級菌種按照2 4:3 5:2 4的體積比混合后接種于發酵培養基中進行混合發酵培養，得到藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的混合發酵液； 步驟四、將微生物菌肥與步驟三中所述混合發酵液按重量份配比混合均勻，得到可降解石油的微生物菌劑。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟一中所述固體培養基為牛肉膏蛋白胨固體培養基，培養的溫度為37±1°C，培養時間為24h 36h。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟二中所述液體培養基為牛肉膏蛋白胨液體培養基，培養的溫度為28±1°C,培養時間為24h 36h。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟三中所述發酵培養基的組成為酵母粉 40g IOOg, K2HPO4Ig, CaCl2O. lg, MgSO4 · 7H201. 5g，MnSO4O. lg，蒸餾水定容至 1L，pH 值為 7. 2 7. 4。
8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟三中所述發酵培養的接種量為2% 8%，培養溫度為28±1°C，培養時間為24h 36h。
全文摘要
本發明公開了一種用于降解石油的固體微生物菌劑，由以下重量份的成分混合制成微生物菌肥85～90份，藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的混合發酵液10～15份。另外，本發明還提供了該固體微生物菌劑的制備方法。本發明的固體微生物菌劑可將有益微生物引入土壤中，優化土壤微生物體系，改善土壤的物理性狀，增強土壤的生物活性，修復板結退化的土壤，是生態環保的綠色菌劑。在土壤中施加本發明的固體微生物菌劑可促進作物的生長，并降解和轉化土壤中的石油污染物，還可增強作物的抗逆性、提高作物產量。
文檔編號C12R1/07GK102839137SQ20121026420
公開日2012年12月26日 申請日期2012年7月27日 優先權日2012年7月27日
發明者王文科, 申圓圓, 李春榮, 王周峰, 韓曉嬌, 廖鵬輝, 王兆琪 申請人:長安大學