專利名稱：一種角質酶的分離純化方法
技術領域：
本發明涉及一種以疏水色譜和陰離子交換為主要手段角質酶的分離純化方法，屬于生物技術分離純化領域。
背景技術：
角質酶(Cutinase，EC3. I. I. 74)是一種能破壞角質多聚物分子的酯鍵使其水解為單體和小分子寡聚體的胞外誘導水解酶，它主要存在于植物病原菌中，是病原菌侵入植物時用以突破植物表皮第一道屏障角質所需要的酶。角質酶屬于a/β水解酶家族，可降解不溶性甘油三酯、可溶性酯和角質等聚酯，它作為一種多功能水解酶，在食品及化工等諸多領域都具有廣泛的應用。角質酶既可水解不溶性多聚體角質的酯鍵，也可以作用于其他長鏈、短鏈脂肪酸酯、乳化的甘油三酯等。除了水解反應外，角質酶還能參與酸與醇的酯化。作為一種能裂解酶，角質酶主要應用在以下幾個方面
I、在生物催化方面的應用在工業產品及工藝中，角質酶具有獨特的應用優勢。從可溶性合成酯類到不溶性長鏈甘油的多種酯，角質酶對其均有水解作用，角質酶可在較低水分活度下進行脂肪和油的專酯化或醇類的(立體)選擇性酯化；可進行丁酸和2-丁醇、甲基_、乙基_、丙基丙酸酯等物質之間的酯化、專酯化反應，也可參與合成聚合物表面活性劑及含有一個或多個手性中心的藥物。2、在農業化學品工業中的應用大量性質不同的化合物，例如除草劑、殺蟲劑和植物生物物質等，沉積或吸附在植物表面，它們對植物的作用很大程度取決其通過角質層的能力。根據這一特點，人們研究了含有角質酶的制劑，開發用于農用化學品的增效劑及輔劑、植物防御反應的誘導物、除草劑及植物生長的抑制劑等。3、在護理用品行業的應用由于角質酶具有脂肪酶的性能，已被用作洗衣店的解脂肪酶或洗碟的清潔劑，用于去除脂肪。角質酶及其采用酶工程獲得的變體已經開發用于生產清潔劑或去污劑，聯合利華等公司擁有其相關專利。4、在食品工業和農產品深加工中的應用角質酶在乳制品工業中牛奶脂肪的水解，以及油化學工業中具有應用潛力；可用于低附加值的農副產品加工廢物轉化成有價值的脂肪酸等物質。5、在塑料廢物的生物降解和廢水處理方面的應用每年全球大約產生140，000，OOOt的合成塑料，這些合成塑料大都性質穩定，對環境造成的污染已經成為環境保護所面臨的一大問題。聚己內酯(polylcaprolactone,PCL)是其中一種合成聚酯，有研究發現它可被一些植物病原真菌降解。Murphy等人研究證實植物病原真菌茄病鐮刀菌降解聚己內酯過程中發揮作用的正是角質酶，因此，在PCL生物降解方面，人們對角質酶的用途有了新的認識。此外,Teles等人應用角質酶對皮革工業的固體廢物進行了脫脂研究。6、在紡織工業中的應用紡織工業傳統的對棉織物進行前處理是采用強堿高溫處理工藝，它存在許多不足之處，傳統工藝，流程復雜冗長，設備龐大、纖維損傷大；棉織物前處理水耗和能耗大等。用酶對棉織物進行前處理是國內外公認的21世紀的環保型染整技術，對紡織專用酶制劑的需求必將逐漸增大，推廣應用前景廣闊。棉花的角質層直接影響棉花的可紡性，2002年首次報道假單胞菌所產角質酶用于棉纖維角質層生物煮練的研究，研究表明它可有效提高原棉表層的潤濕性。在生物煮練過程中，角質酶與果膠裂解酶具有較好的協同效應，亦可用于去除織物表面的聚酯類污點，提高織物的質量。紡織工業是我國的傳統產業和支柱產業，在國內生產總值和外貿出口總值中占有重要比例。紡織工業廢水主要來自染整工段,包括退漿、煮煉、漂白、絲光、染色、印花和整理等，污染物主要是棉毛等紡織纖維上的污物、鹽類、油類和脂類，以及投加的各種上漿料、染料、助劑、酸、堿等，廢水量大，是嚴重的污染源之一。為了使棉纖維獲得優良的潤濕性和白度，需要在前處理過程中去除角質層、果膠質和蛋白質等各種伴生物。傳統的煮煉工藝用燒堿、肥皂、表面活性劑等的水溶劑，在120°C、pH值10 13的條件下對棉纖維進行煮煉。煮煉廢水量大，呈強堿性，BOD和COD均高達每升數千毫克。 使用生物煮練技術，最大的好處是提高染色的均勻性及減輕環境污染。隨著社會對紡織品和環境的環保問題日益重視，對紡織品的高檔化和高附加值加工的追求，酶用于紡織中，易于生物降解，不會污染環境與紡織品，另一方面生物酶能賦予被加工的紡織品許多獨特的效果，獨有的高催化效率和高度的專一性，使生物酶的應用具有光明的前景。2004年6月中旬在奧地利格拉茨召開的第三屆國際紡織技術交流會(INTB)上Bucheri^PKinuGrancaric等專家對棉纖維生物煮練中的酶制劑分別做了相關研究報告。在生物煮煉方面，有報道角質酶用于紡織工業中棉纖維角質層生物煮練，可提高原棉的潤濕性，與果膠裂解酶具有較好的協同效應，能更好地去除角質層、果膠層，保證織物的良好紡織性能，與其他紡織酶制劑復合使用可實現紡織的綠色加工。國內外的研究主要集中在發酵條件的優化以及基因工程菌的篩選，而對于角質酶分離純化的報道較少。中國專利CN100537758C介紹了一種角質酶的分離純化方法，其以疏水色譜為主要手段分離純化野生菌所產角質酶，該方法只適用于嗜熱子囊菌Thermobif idafusca發酵液的分離純化。
發明內容
本發明提供一種角質酶的分離純化方法，采用疏水色譜和陰離子交換為主要手段，有效的分離角質酶發酵液，適用于鐮刀菌屬Fusarium、炭疽菌屬Colletotrichum、鏈核盤菌屬Monilinia、曲霉屬Aspergillus、黑星菌屬Venturia、鏈格孢菌屬Alternaria、葡萄孢菌屬Botrytis、殼二孢屬Ascochyt發酵來源的發酵液,擴大了分離純化的范圍，為之后的蛋白質測序、性質應用分析和基因工程菌構建奠定基礎。本發明主要的工藝步驟為(I)將角質酶發酵液離心去除菌體后，向粗酶液中加入經研磨烘干后的固體硫酸銨，使硫酸銨達到90% -95%飽和度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl緩沖液溶解后，倒入經煮沸處理的透析袋中，在相同緩沖溶液中透析，透析后離心，收集上清液；
(2)向透析后的酶液加入研磨后的固體硫酸銨至20%-60%飽和度，盡快上樣于經30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液預平衡的Phenyl-Sepharose疏水柱中，先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液平衡至A28tl值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液與不含硫酸銨的Tris-HCl緩沖液線性洗 脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液洗脫，流速為2. 5mL/min, Phenyl-Sepharose疏水層析后,測定280nm吸收峰處集中管中酶液的活性，對活性較高的收集液進行SDS-PAGE，確認蛋白純度，若SDS-PAGE結果顯示多條蛋白帶，則收集酶活性較高的酶液，進行DEAE-Sepharose弱陰離子交換柱層析；(3)步驟(2)中酶活較高的收集液經濃縮后在Tris-HCl緩沖液中充分透析后，加入同種緩沖液平衡的DEAE-Sepharose層析柱中，酶蛋白經緩沖液洗脫至A28tl不變后，用Tris-HCl緩沖液和含有O. 2-1. OmoI/L NaCl的同一洗脫液線性梯度洗脫，流速為2. 5mL/min,收集活性峰。本發明相對于現有報道工藝，具有以下創新點(I)本發明方法適用范圍突破了以往的僅限于單一發酵來源的發酵液，適用于鐮刀菌屬 Fusarium、炭疽菌屬 Colletotrichum、鏈核盤菌屬 Monilinia、曲霉屬 Aspergillus、黑星菌屬Venturia、鏈格孢菌屬Alternaria、葡萄孢菌屬Botrytis、殼二孢屬Ascochyt菌株發酵液；(2)工藝簡單，靈活性高。本發明分離純化工藝根據不同發酵液在硫酸銨沉淀和疏水色譜的分離情況來決定是否采用之后的弱陰離子柱層析分離。
具體實施例方式實例I(I)將由鐮刀屬Fusarium oxysporium發酵獲得的角質酶發酵液離心去除菌體后，向粗酶液中加入經研磨烘干后的固體硫酸銨，使硫酸銨達到90%飽和度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl (pH值為8. O, 20mM)緩沖液溶解后，倒入經煮沸處理的透析袋中，在相同緩沖溶液中透析4小時，透析后離心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入經研磨烘干后的固體硫酸銨至30%飽和度，上樣于30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為8. O, IOmM)預平衡的Phenyl-Sepharose疏水柱中，先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液(pH值為8. O, IOmM)平衡至A28tl值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0，IOmM)與不含硫酸銨的同一緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液(pH值為8. O, IOmM)洗脫，流速為2. 5mL/min,Phenyl-Sepharose疏水層析后,測定280nm吸收峰處集中管中酶液的活性,對活性較高的收集液進行SDS-PAGE，確認蛋白純度，SDS-PAGE結果顯示多條蛋白帶，收集酶活性較高的酶液，進行DEAE-Sepharose弱陰離子交換柱層析；(3)將上一步酶活較高的收集液經濃縮后在Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0，IOmM)中充分透析后，加入同種緩沖液平衡的DEAE-Sepharose層析柱中，酶蛋白經緩沖液洗脫至A280不變后，用Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0，IOmM)和含有O. 2mol/L NaCl的同一洗脫液線性梯度洗脫，流速為2. 5mL/min，收集活性峰。實施例2(I)將炭疽菌屬Colletotrichum gloeosporioides發酵而來的角質酶發酵液離心出去菌體后，向粗酶液中加入經研磨烘干后的固體硫酸銨，使硫酸銨達到95%飽和度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0,40mM)溶解后，倒入經煮沸處理的透析袋中，在相同緩沖溶液中透析4小時，透析后離心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入經研磨烘干后的固體硫酸銨至20% -60%飽和度，上樣于30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為8. O, 20mM)預平衡的Phenyl-S^harose疏水柱中，先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0,20mM)平衡至A28tl值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0，20mM)與不含硫酸銨的同一緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0,20mM)洗脫，流速為2. 5mL/min,Phenyl-Sepharose疏水層析后,測定280nm吸收峰處集中管中酶液的活性,對活性較高的收集液進行SDS-PAGE，確認蛋白純度。實施例3(I)將鏈核盤菌屬Monilinia fructicola角質酶發酵液離心出去菌體后，向粗酶 液中加入經研磨烘干后的固體硫酸銨，使硫酸銨達到92%飽和度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,20mM)溶解后，倒入經煮沸處理的透析袋中，在相同緩沖溶液中透析2小時，透析后離心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入經研磨烘干后的固體硫酸銨至50%飽和度，上樣于30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,20mM)預平衡的Phenyl-S印harose疏水柱中，先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液平衡至A28tl值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,20mM)與不含硫酸銨的同一緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液洗脫,流速為2. 5mL/min, Phenyl-Sepharose疏水層析后,測定280nm吸收峰處集中管中酶液的活性，對活性較高的收集液進行SDS-PAGE，確認蛋白純度。實施例4(I)將曲霉屬Aspergillus oryzae角質酶發酵液離心出去菌體后，向粗酶液中加入經研磨烘干后的固體硫酸銨，使硫酸銨達到94%飽和度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl緩沖液(pH值為7.0，20mM)溶解后，倒入經煮沸處理的透析袋中，在相同緩沖溶液中透析一段時間，透析后離心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入經研磨烘干后的固體硫酸銨至20% -60%飽和度，上樣于30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)預平衡的Phenyl-S^harose疏水柱中，先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液平衡至A28tl值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)與不含硫酸銨的同一緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)洗脫，流速為2. 5mL/min ；(3)上一步酶活較高的收集液經濃縮后在Tris-HCl緩沖液(pH值為 . 0，8mM)中充分透析后，加入同種緩沖液平衡的DEAE-Sepharose層析柱中，酶蛋白經緩沖液洗脫至A280不變后，用Tris-HCl緩沖液和含有O. 5mol/L NaCl的同一洗脫液線性梯度洗脫，流速為2. 5mL/min,收集活性峰。實施例5(I)將Ascochyta rabiei角質酶發酵液離心出去菌體后，向粗酶液中加入經研磨烘干后的固體硫酸銨，使硫酸銨達到95%飽和度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,20mM)溶解后，倒入經煮沸處理的透析袋中，在相同緩沖溶液中透析5小時，透析后離心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入經研磨烘干后的固體硫酸銨至30%飽和度，上樣于30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)預平衡的Phenyl-Sepharose疏水柱中，先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)平衡至A28tl值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)與不含硫酸銨的同一緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)洗脫，流速為2. 5mL/min ；(3)上一步酶活較高的收集液經濃縮后在Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0，12mM)中充分透析后，加入同種緩沖液平衡的DEAE-Sepharose層析柱中，酶蛋白經緩沖液洗脫至 A280不變后，用Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)和含有O. 4mol/L NaCl的同一洗脫液線性梯度洗脫，流速為2. 5mL/min，收集活性峰。
權利要求
1.一種角質酶的分離純化方法，其特征在干 (1)將角質酶發酵液離心去除菌體后，向粗酶液中緩慢加入經研磨烘干后固體硫酸銨，使硫酸銨達到一定濃度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量TriS-HCl緩沖液溶解后，倒入經煮沸處理后的透析袋中，相同緩沖溶液中透析，透析后離心，收集上清液。
(2)向步驟(I)透析后的酶液加入經研磨烘干后的固體硫酸銨至一定飽和度，上樣于經30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液預平衡的Phenyl-S^harose疏水柱，上樣結束后先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液平衡至A280值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液與不含硫酸銨的Tris-HCl緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液洗脫，流速為2. 5mL/min，測定280nm吸收峰處集中管中酶液的活性，對活性較高的收集液進行SDS-PAGE，確認蛋白純度，若SDS-PAGE結果顯示多條蛋白帯，則收集酶活性較高的酶液，進行DEAE-Sepharose弱陰離子交換柱層析。
(3)將步驟(2)酶活較高的收集液濃縮后在Tris-HCl緩沖液中充分透析，加入同種緩沖液平衡的DEAE-S印harose層析柱中，酶蛋白經緩沖液洗脫至A280不變后，用Tris-HCl緩沖液和含有NaCl的同一洗脫液線性梯度洗脫，流速為2. 5mL/min,收集活性峰，即為所制備的電泳純角質酶溶液。
2.根據權利要求I所述的角質酶分離純化方法，其特征在于角質酶發酵液的來源可以為錸刀菌屬Fusarium、炭疽菌屬Colletotrichum、鏈核盤菌屬Monilinia、曲霉屬Aspergillus、黑星菌屬Venturia、鏈格孢菌屬Alternaria、葡萄孢菌屬Botrytis、殼ニ孢屬Ascochyt的真菌發酵。
3.根據權利要求I所述的角質酶分離純化方法，其特征在于3個步驟所實施的溫度均要求在0-4°C。
4.根據權利要求I所述的角質酶分離純化方法，其特征在于3個步驟中所述的Tris-HCl緩沖液的pH值范圍為7. 0-9.0，其中步驟(I)中Tris-HCl緩沖液的濃度為20-40mM，步驟⑵和(3)中Tris-HCl緩沖液的濃度為8_20mM。
5.根據權利要求I所述的角質酶分離純化方法，其特征在于步驟(I)中硫酸銨的濃度為90% -95% ;透析時間為2-10小時。
6.根據權利要求I所述的角質酶分離純化方法，其特征在于步驟(2)中向透析后的酶液加入經研磨后烘干的固體硫酸銨至一定飽和度指的飽和度為20% -60%。
7.根據權利要求I所述的角質酶分離純化方法，其特征在于步驟(3)中NaCl的濃度為 O. 2-1. OmoI/Lο
全文摘要
本發明提供一種鐮刀菌屬Fusarium、炭疽菌屬Colletotrichum、鏈核盤菌屬Monilinia、曲霉屬Aspergillus、黑星菌屬Venturia、鏈格孢菌屬Alternaria、葡萄孢菌屬Botrytis、殼二孢屬Ascochyt來源的角質酶發酵液的分離純化方法，其特點在于選用硫酸銨沉淀和疏水色譜進行分離純化后，可根據角質酶純度選用弱陰離子交換進行進一步的分離純化，得到了電泳純的角質酶溶液，可根據后續需求進行進一步的加工。本發明適用范圍廣，方法簡單，酶純度高，是一種高效、簡潔的酶分離純化方法。
文檔編號C12R1/645GK102839163SQ20121036150
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者王秀英 申請人:四川金稞生物科技有限公司