專利名稱：生物素-親和素系統固定化糖化酶及其制備方法
技術領域：
本發明屬于酶制劑領域，特別涉及種固定化酶。
背景技術：
酶的固定化是指采用有機或無機固體材料作為載體，將酶包埋起來或束縛、限制于載體的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并且可以回收和重復使用酶的一種化 學方法與技術。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效性、專一性、溫和性以及可調節控制性等催化反應特性以外，還有其穩定性高、分離回收容易、可重復多次使用、操作連續可控、工藝簡便、成本低等一系列優點。近年來，固定化酶在食品、制藥、化學分析、環境保護等方面的應用越來越廣泛，而且因為具有節省能源與資源，減少污染的生態環境效應而符合可持續發展的戰略要求。傳統酶固定化方法存在酶在任意位點與載體進行連接使酶活性位點不能充分暴露；固定化酶經過重復使用后酶活力慢慢下降，而且酶的固定化量降低等問題。酶的定向固定就是通過不同的方法，把酶和載體在酶的特定位點上連接起來，使酶在載體表面按一定的方向排列，使它的活性位點面朝固體表面的外側排列，有利于底物進入到酶的活性位點里去，能夠顯著提高固定化酶的活性。與傳統的固定化方法相比，定點固定化技術制備的固定化酶具有更出色的催化活性。目前，定向固定的方法有以下幾種共價固定法；氨基酸置換法；抗體耦聯法；生物素-親和素親和法；酶與金屬離子連接和疏水定向固定法。親和素是一種糖蛋白，分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。親合素分子與生物素分子結合常數(Ka)高達1015mol/L。生物素-親和素(biotin-avidin)系統的應用開辟了一類新的酶固定化技術。生物素-親和素親和法是從蛋白融合法中派生出來的一種高效的定點固定化方法。生物素-親和素的分子識別特性在酶的固定化研究中有重要價值，日益受到大家的關注。生物素與親和素之間高度的特異性結合力、橋聯作用以及多級放大作用，可以使多數蛋白質、酶、抗體、DNA等較容易的生物素化，且生物素化并不降低其生物活性。因此，生物素-鏈親和素系統成為現代生物技術領域最有力的工具之一，在生物學、分子生物學、生物化學、臨床醫學等領域廣泛應用。一些研究者應用生物素-親和素系統固定化酶制備的生物傳感器取得較好的效果。該系統與固相載體的結合應用，更是具有潛在的發展前景。本研究在磁性瓊脂糖微球表面上偶聯上親和素，用生物素標記糖化酶，利用親和素和生物素的高特異性牢固結合，將糖化酶固定在磁性瓊脂糖微球表面上。糖化酶(Glucoamylase EC3. 2.1. 3)是由微生物分泌產生的具有外切酶活性的胞外酶，催化淀粉從非還原端水解a-1，4糖苷鍵逐個釋放出單個3-D-葡萄糖。此外，還能水解a -1，6糖苷鍵和a -1，3糖苷鍵，能將支鏈淀粉徹底水解為葡萄糖，是水解淀粉的主要酶類，現已被廣泛的應用于白酒、酒精、食醋、氨基酸、有機酸和抗生素等發酵工業。但是游離糖化酶在使用過程中存在著酶活力較低、易失活、不能重復使用、糖化時間長、不易與產物分離等缺點。而固定化酶則彌補了游離酶的這些不足，具有穩定性好、可反復使用、適應連續化自動化的工業生產、酶的使用效率提高和成本降低等優點。
發明內容
本發明提供生物素-親和素系統固定化糖化酶，由以下方法制得1.磁性瓊脂糖微球的制備①Fe3O4-性微球的制備按照Fe3+ Fe2+=1.75 I 的質量比，分別加入 35mL 0. 5mol/L FeCl3 和 20mL0. 5mol/L FeCl2溶液于200mL燒杯中，用電動攪拌器攪拌，使溶液混合均勻，置60°C水浴鍋中，然后快速滴入2mol/L NaOH溶液直至pH = 6. 5 (此為Fe3O4膠狀物的等電點)15min后繼續緩慢加入NaOH溶液調pH至10 11，其余條件不變，液體由棕色變為黑色即可，再升溫至 80°C恒溫保持lh，停止加熱，攪拌冷卻，待降至室溫后，分別用蒸餾水和乙醇洗滌數次，直至中性，室溫下進行真空干燥，干燥溫度60°C時間24hr，即得Fe3O4納米粒子。 ②磁性瓊脂糖微球的制備采用反相懸浮包埋法。分別將28mL三氯甲烷和72mL甲苯混合，攪拌，加入1. OmLSpan-80混勻，50°C水浴預熱。取2g瓊脂糖粉、溶入25mL自制Fe3O4磁流體中，加熱溶解后將其均勻分散在有機相中，攪拌冷卻，過濾，用石油醚清洗3次，用蒸餾水大量沖洗。2.親和素-磁性瓊脂糖微球的制備取Img磁性瓊脂糖微球，在磁場下用0. 01mol/L、pH6. 0磷酸二氫鈉緩沖液洗滌，在50mL燒杯中加入4ml pH7.1連接液,混勻。室溫下搖床中振蕩15min,避免磁性微球沉淀，并起混勻作用，磁場下用2mmol/L鹽酸溶液洗漆,再用0. 02mol/L、pH6. 2磷酸鹽緩沖液重懸磁性微球。立即加入30ii g親和素,混勻，室溫下振蕩20min。磁場下用0. 02mol/L、pH6. 2磷酸鹽緩沖液洗滌磁性微球，并重懸在該磷酸鹽緩沖液中。所述連接液的配制準確稱量30mg EDC、18mg NHS，溶于3mL 0. 01mol/LpH6. 0的磷酸二氫鈉緩沖液中。3.生物素標記糖化酶的制備稱取Img生物素溶于2mL、pH4. 6醋酸緩沖液中，然后取濃度為4mg/mL糖化酶液2. Oml加入到溶液中，20°C時攪拌2. 5h后靜置24h。用透析袋進行透析，除去未反應的生物素，得到生物素標記糖化酶。4.生物素-親和素系統固定化糖化酶將Img親和素-磁性瓊脂糖微球載體加入到5mL pH6.1乙酸乙-酸鈉緩沖溶液中，再加入40 ii L生物素標記的糖化酶液，20°C振蕩20min，用磁鐵收集，倒出上清液，用乙酸-乙酸鈉緩沖液充分洗滌，于4°C冰箱中保存，即得固定化糖化酶。有益效果本發明在磁性瓊脂糖微球表面上偶聯上親和素，用生物素標記糖化酶，利用親和素和生物素的高特異性牢固結合，將糖化酶固定在磁性瓊脂糖微球表面上加工而成的生物素-親和素系統固定糖化酶，克服了傳統游離糖化酶在使用過程中存在著酶活力較低、易失活、不能重復使用、糖化時間長、不易與產物分離等缺點。該產品穩定性好、可反復使用、適應連續化、自動化的工業生產、酶的使用效率高、成本低，在食品、制藥、化學分析、環境保護等領域具有很好的發展前景。其酶活力為1629. 7U/g，活力回收率為56.3%，固定化酶相對活力為64. 7% ;固定化酶連續使用5次，酶活仍保持了 77. 8%。固定化酶的半衰期為84d,固定化酶的最適作用溫度為65°C,最適pH為5.1,米氏常數KmS 2. 28mg/mL,較游離糖化酶的米氏常數Km(5. 56mol/L)小，說明其與底物的親和力提高，有利于酶與底物的作用。
圖1葡萄糖標準曲線圖2固定化對酶表觀Km值的影響圖3固定化酶的重復使用穩定性相關的檢測方法
1.生物素結合糖化酶及親和素的測定方法①生物素結合糖化酶的測定紫外可見分光光度計測定生物素與糖化酶反應后的溶液在210nm處的OD值。②親和素結合量的測定紫外可見分光光度計測定親和素與磁性微粒充分反應前后溶液在210nm處的OD值。通過測定其偶聯效率計算在磁性瓊脂糖微粒表面親和素的結合容量。2.游離酶及固定化酶活性的測定2.1葡萄糖標準曲線的繪制準確稱取于105 110°C干燥后的葡萄糖50mg,用蒸懼水溶解,定容至50mL容量瓶中，配成lmg/mL標準溶液。按表I比例操作后，開水煮沸15min冷卻,加入10. 5 mL蒸懼水，搖勻，于WFJ2100型可見分光光度計0. 5cm比色皿，550nm比色。表I葡萄糖標準曲線表
編號含葡萄糖量/mg 葡萄糖溶液/ral 蒸餾水/ml DNS液/ml A550/nm
0000.51.50
10.10.10.41.50.07520.20.20.31.50.198
30.30.30.21.50.333
40.4OA0.11.50.448
50.5U 501.50.543空白蒸餾水代替葡萄糖以OD值為縱坐標，葡萄糖毫克數為橫坐標，作標準曲線，求出K值。2. 2糖化酶活力的測定糖化酶活力定義在40°C pH4. 6條件下，每小時水解淀粉產生Img葡萄糖作為一個酶活力單位。(I)游離糖化酶活力的測定 在25mL磨口塞試管中，加入2%可溶性淀粉9. 8mL,于40 V水浴鍋中，預熱3 5min鐘，加入稀釋一定倍數的酶液0. 2mL，準確反應20min，立刻取出0. 5mL反應液于預先吸有1. 5mLDNS液的試管中，開水煮沸15min，冷卻后加10. 5mL蒸餾水，搖勻，比色測定。條件與標準曲線一致。空白用高溫滅活酶液，其余操作同上。酶活力用如下公式計算酶活力=0DXnXkX5X20X3式中0D——吸光度5——將0. 2mL酶液換算成ImL酶液k——比色常數n——酶稀釋倍數20——將0. 5mL反應液換算成IOmL3-將20min按換算成Ih
(2)固定化酶活力測定加入固定化酶0. 05g替代0. 2mL的酶液，其余條件同上。3.蛋白質的測定采用微量凱式定氮法(見國標GB/T 5009. 5-2003)分別測定固定化酶中酶蛋白的含量。
^ (f -FOx CX 0.0140 rX =-^--X F X 100
m X 10/100式中X_試樣中蛋白質的含量，g/100g或g/100mL ;V1-試樣消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，mL ；V2-空白消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，mL ；C-硫酸或鹽酸標準滴定液濃度，mo I/L0. 0140-1. OmL 硫酸[c(l/2H2S04) =1. 000mol/L]或鹽酸[c (HCL) =1. 000mol/L]標準滴定溶液相當的氮的質量，g ;m-試樣的質量或體積，g或mL ;F-蛋白質轉換系數，為6. 25。4.固定化酶表觀米氏常數Km值的測定取Img固定化酶，以濃度分別為2、3、4、5、10mg/mL的淀粉溶液作為底物，于pH4. 6、溫度40°C下保溫反應lh，測定其酶活力，以相對酶活力代表酶反應的速度,按Lineweaver-Burk作圖法以反應速度的倒數對底物濃度的倒數作圖,所得直線在x軸上的截距即為-1/Km,如圖1所示。從圖2中求出固定化酶的米氏常數Km為2. 28mg/mL，較游離酶的米氏常數Km(5. 56mg/mL)小,說明固定化酶對底物的親和力遠遠大于游離酶,即使用含較低底物濃度的反應系統便可以獲得最大的反應速度。5.固定化酶重復使用穩定性的測定將Img固定化酶在相同條件下連續反應5個批次，每批次反應后分別測定酶活力，結果如圖3所示，固定化酶反復使用5次后酶活仍保持了 77. 8%。6.固定化酶保存半衰期的測定固定化酶的保存穩定性通常以半衰期表示，即固定化酶活力下降為初活力一半時
所經歷的時間。假定活力損失與時間成指數關系，半衰期可用下式表達
0 69^hi 2 = —~
人/) 其中Kd是衰減常數，可用下式計算r -. rr 2.303 , A0Kn=-log (-)
tEE/E0是在時間t后，酶活力殘留的分數。具體操作是將固定化酶放在4°C冰箱保存，每隔15大測定一次固定化酶活力，代入上述公式計算得固定化酶的保存半衰期為84d。 7.固定化酶活力回收率和固定化酶相對活力測定酶活力回收率是指偶聯反應后，固定化酶所顯示的活力占加入偶聯液中酶的總活力的百分數。即酶活力回收率=^ X100%
加入偶聯液的總_活力固定化酶相對活力是指固定化了的酶活力與同樣蛋白量的自然酶的活力的比值。計算公式
相對酶活力=-Miifc隊活力-1oo%
同樣蛋白量的自然酶的活力按上述方法計算最佳工藝制備的固定化酶的活力回收率為56. 3%，固定化酶相對活力為64.7%。8.固定化酶的最適作用溫度及最適作用pH8.1最適作用溫度的測定稱Img 固定化酶，于 pH4. 6，溫度分別取 40、45、50、55、60、65、70、75 °C 的各 IOmL 的
2%可溶性淀粉溶液中，按常規方法測定固定化酶活力得知，隨著溫度的升高，固定化酶活力增加；當溫度為65°C時，固定化酶的活力最高，比游離酶的最適作用溫度提高了 5°C，這是由于固定化酶具有更加穩定的空間立體結構，酶蛋白耐受熱變性的能力提高。酶最適反應溫度的提高，使酶催化反應能在較高溫度下進行，加快反應速度，從而提高酶催化作用效率。8. 2最適pH值的測定稱Img 固定化酶，置于 pH 分別為 3.6,4. 1,4.6,5. 1,5.6,6. 1、6. 6，溫度為 40°C 的IOmL的2%可溶性淀粉中，按常規方法測定固定化酶活力得知，隨著pH的增加固定化酶的相對活力逐漸升高，PH5.1時相對酶活達到最高，隨后開始下降。故固定化酶的最適作用pH為 5.1。9.生物素-親和素系統固定化糖化酶活力的測定按常規方法測定固定化糖化酶的活力為1629. 7U/g。
權利要求
1.生物素-親和素系統固定化糖化酶，由以下方法制得(1)磁性瓊脂糖微球的制備①Fe3O4磁性微球的制備分別加入 35mL O. 5mol/L FeCljP20mL O. 5mol/L FeCl2 溶液于 200mL 燒杯中，用電動攪拌器攪拌，使溶液混合均勻，置60°C水浴鍋中，然后快速滴入2mol/L NaOH溶液直至pH = 6. 5，15min后繼續緩慢加入NaOH溶液調pH至10 11，其余條件不變，液體由棕色變為黑色即可，再升溫至80°C恒溫保持lh，停止加熱，攪拌冷卻，待降至室溫后，分別用蒸餾水和乙醇洗滌數次，直至中性，室溫下進行真空干燥，干燥溫度60°C時間24hr，即得Fe3O4納米粒子;②磁性瓊脂糖微球的制備采用反相懸浮包埋法。分別將28mL三氯甲烷和72mL甲苯混合，攪拌，加入LOmL Span-80混勻，50°C水浴加熱，在快速攪拌下加入8%瓊脂糖溶液，使瓊脂糖在有機相中分散均勻，減慢攪拌速度，自然冷卻，過濾，用石油醚清洗3次，用蒸餾水大量沖洗；(2)生物素標記糖化酶的制備稱取Img生物素溶于2mL、pH4. 6醋酸緩沖液中，然后取濃度為4mg/ml糖化酶液2. 25ml 加入到溶液中，20°C時攪拌3h后靜置24h。用透析袋進行透析，除去未反應的生物素，得到生物素標記糖化酶；(3)親和素-磁性瓊脂糖微球的制備取Img磁性瓊脂糖微球，在磁場下用磷酸二氫鈉緩沖液洗滌，在50mL燒杯中加入連接液，混勻。室溫下搖床中振蕩15min，避免磁性微球沉淀，并起混勻作用，磁場下用鹽酸緩沖液洗滌，再用磷酸鹽緩沖液重懸磁性微球。立即加入親和素30 μ g，混勻，室溫下振蕩 20min。磁場下用磷酸鹽緩沖液洗滌磁性微球，重懸在磷酸鹽緩沖液中；(4)糖化酶的固定化將Img親和素-磁性瓊脂糖微球載體加入到5mL pH6.1乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，再加入生物素標記的糖化酶液40 μ L，20°C振蕩30min，用磁鐵收集，倒出上清液，用緩沖液充分洗滌，最后于4°C冰箱中保存，即得固定化糖化酶。
2.根據權利要求1所述生物素-親和素系統固定化糖化酶的制備方法，包括如下步驟(I)磁性瓊脂糖微球的制備①Fe3O4磁性微球的制備分別加入35mL O. 5mol/LFeCl3和20mL O. 5mol/L FeCl2溶液于200mL燒杯中，用電動攪拌器攪拌，使溶液混合均勻，置60°C水浴鍋中，然后快速滴入2mol/L NaOH溶液直至pH = 6. 5，15min后繼續緩慢加入NaOH溶液調pH至10 11，其余條件不變，液體由棕色變為黑色即可，再升溫至80°C恒溫保持lh，停止加熱，攪拌冷卻，待降至室溫后，分別用蒸餾水和乙醇洗滌數次，直至中性，室溫下進行真空干燥，干燥溫度60°C時間24hr，即得Fe3O4納米粒子;②磁性瓊脂糖微球的制備采用反相懸浮包埋法。分別將28mL三氯甲烷和72mL甲苯混合，攪拌，加入LOmL Span-80混勻，50°C水浴加熱，在快速攪拌下加入8%瓊脂糖溶液，使瓊脂糖在有機相中分散均勻，減慢攪拌速度，自然冷卻，過濾，用石油醚清洗3次，用蒸餾水大量沖洗；(2)生物素標記糖化酶的制備稱取Img生物素溶于2mL、pH4. 6醋酸緩沖液中，然后取濃度為4mg/mL糖化酶液2. 25ml 加入到溶液中，20°C時攪拌3h后靜置24h。用透析袋進行透析，除去未反應的生物素，得到生物素標記糖化酶；(3)親和素-磁性瓊脂糖微球的制備取Img磁性瓊脂糖微球，在磁場下用磷酸二氫鈉緩沖液洗滌，在50mL燒杯中加入連接液，混勻。室溫下搖床中振蕩15min，避免磁性微球沉淀，并起混勻作用，磁場下用鹽酸緩沖液洗滌，再用磷酸鹽緩沖液重懸磁性微球。立即加入親和素30 μ g，混勻，室溫下振蕩 20min。磁場下用磷酸鹽緩沖液洗滌磁性微球，重懸在磷酸鹽緩沖液中； (4)糖化酶的固定化將Img親和素-磁性瓊脂糖微球載體加入到5mL pH6.1乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，再加入生物素標記的糖化酶液40 μ L，20°C振蕩30min，用磁鐵收集，倒出上清液，用緩沖液充分洗滌，最后于4°C冰箱中保存，即得固定化糖化酶。
全文摘要
本發明公開一種生物-素親和素系統固定化糖化酶及其制備方法。本發明提供生物素-親和素系統固定化糖化酶，由以下方法制得1.磁性瓊脂糖微球的制備①Fe3O4磁性微球的制備，②磁性瓊脂糖微球的制備，2.親和素-磁性瓊脂糖微球的制備，3.生物素標記糖化酶的制備稱取1mg生物素溶于2mL、pH4.6醋酸緩沖液中，然后取濃度為4mg/mL糖化酶液2.0ml加入到溶液中，20℃時攪拌2.5h后靜置24h。用透析袋進行透析，除去未反應的生物素，得到生物素標記糖化酶。4.生物素-親和素系統固定化糖化酶。該產品穩定性好、可反復使用、適應連續化、自動化的工業生產、酶的使用效率高。
文檔編號C12N11/10GK102994489SQ20121038006
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月9日 優先權日2012年10月9日
發明者侯紅萍 申請人:山西農業大學