專利名稱：一種空間環境下大腸桿菌lct-ec52菌株的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種空間環境下的大腸桿菌生物特性、全基因組測序、轉錄組測序和差異蛋白組學分析。
背景技術：
隨著人類空間探索活動的日益頻繁，宇宙空間成為了人類活動的一個重要領域。微生物是自然環境中的一部分，其存在于空氣、水、土壤等生物圈的各個部分。因此，人類的空間活動不可避免的將微生物也帶上了太空。盡管外層空間具有極端和復雜的環境，然而這些微生物都能夠適應這些諸如微重力、宇宙射線、溫度、壓力等的改變并表現出相應的形態和生理學的變化。尤其是有研究發現在模擬微重力條件下培養的鼠傷寒沙門氏菌對小鼠 感染的毒力會增強；肺炎鏈球菌等機會致病菌在模擬微重力條件下毒力增強。目前，在空間站中已檢測出包括肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙雷氏菌、蠟狀芽孢桿菌和腸球菌等多種細菌。對這些細菌進行深入研究有助于了解空間環境對這些細菌的影響以及這些細菌的致病力和耐藥性的改變機制，為載人航天提供醫學保障基礎。大腸桿菌是存在于恒溫動物腸道中的一種革蘭氏陰性圓形桿菌。大多數的大腸桿菌的菌株是沒有危害的，但是一些血清型可以導致人類嚴重的食物中毒。沒有危害的大腸桿菌是腸道的正常菌群的一部分，其產生維生素K2對宿主是有益的，而且還能防止腸道中其他致病性病源菌的生成。大腸桿菌占整個腸道菌群的0. 1%，糞口傳播途徑是該病原菌致病的重要途徑。同時大腸桿菌是被廣泛研究的原核模式生物，因其可作為重組DNA的宿主，是微生物學和生物技術領域的一個重要的細菌。正因為大腸桿菌具有如此重要的作用，通過表型研究空間環境下的細菌突變株，并利用基因組、轉錄組、蛋白質組三大組學研究方法，研究細菌對空間環境的適應性變化，關注其致病性、耐藥性的變化，為預防感染性疾病在空間站中的發生奠定基礎。
發明內容
本發明的目的是提供一種太空環境下的大腸桿菌菌株LCT-EC52。通過表型檢測、全基因組測序，并結合轉錄組學和蛋白組學闡明該細菌受空間影響的變化機制。本發明提供的菌株LCT-EC52，其保藏號為CGMCC6518。所述的大腸桿菌LCT-EC52，其表型特征為革蘭氏陰性桿菌，無芽孢，菌體單個排列；對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢三嗪、阿奇霉素的耐藥性出現了完全耐藥；不能利用D-水楊、甲基丙酮酸、亞碲酸鉀、溴酸鈉等。所述的大腸桿菌LCT-EC52進行全基因組測序和比較基因組學分析得出突變基因，見表1，空間環境導致LCT-EC52菌株基因組上SNP的變化，包括SNP在基因組上的位置，突變位點及編碼蛋白以及注釋出的基因。表I空間環境導致LCT-EC52菌株基因組上SNP的變化SNP位置突變位點參考基因ID 注釋庫ID
Scaffold24_201 G —A UW5_002160 gi|191173110 D—NScaffold2_48865 A—G UW5_001214 gi|315286846 Q —QScaffold2—527671 C —TUW5_001695 gi|371610913 P—P
Scaffold3—383994 A—GUW5_001094 gi|377982598 Q^R
Scaffold3_383995 A—GUW5_001094 gi|377982598 K—K
ScaffOId3—384004 T—CUW5_001094 gi|377982598 卜 I
Scaffold4_573 G^A UW5_002922 gi| 161506001 G —RScaffold4_310249 C —T UW5_003213 gi|26250246 P—PScaffold4_310264 A—G UW5_003213 gi|26250246 K^KScaffold4_310300 T—C UW5_003213 gi|26250246 V —VScaffold4_310687 T—G UW5—003213 gi|26250246 L^LScaffold4_613919 T—CUW5—003501 gi|377923244 S-^P
Scaffold5_565481 G —A UW5_004160 gi|307553022 R-RScaffold7_4900 G->A UW5_004570 gi|260845835 R—R所述的大腸桿菌LCT-EC52，通過轉錄組測序鑒定獲得差異表達基因，(FDR ( 0. 001 和 I Iog2RatioI 彡 2)見附表 I。所述的大腸桿菌LCT -EC52，利用蛋白組學方法鑒定得出差異表達蛋白分子(蛋白豐度差異倍數超過2倍以上時；經統計檢驗其p-value值小于0. 05 ;三次重復中至少兩次重復中達到上述要求)見附表2。
圖1大腸桿菌LCT-EC52革蘭氏染色圖2大腸桿菌空間菌株LCT-EC52的Biolog生化特征圖3大腸桿菌LCT-EC52菌株與地面對照株LCT-EC106的生長曲線圖4大腸桿菌空間環境下菌株LCT-EC52的轉錄組基因覆蓋度統計圖5大腸桿菌空間環境下菌株LCT-EC52的轉錄組差異表達基因圖6大腸桿菌空間環境下菌株LCT-EC52的蛋白組差異表達蛋白附件說明附件I大腸桿菌LCT-EC52轉錄組測序差異表達基因信息附件2大腸桿菌LCT-EC52蛋白組差異表達蛋白信息
具體實施例方式下述實施實例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施實例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。具體實施實例一 LCT-EC52的表型1.菌種大腸桿菌LCT-EC52保藏號為CGMCC
2.形態學原樣品進行稀釋涂布，進行革蘭氏染色。LCT-EC52為革蘭氏陰性桿菌，無芽孢，菌體單個排列，如圖1。3. LCT-EC52 菌株 16s rDNA 鑒定16S rDNA 是 16S rRNA 序列的基因，長約 1.5kb。將已分純的單菌直接經菌液PCR擴增16S rDNA，部分通過菌液PCR較難擴增的單菌經擴大培養后提取基因組后擴增，擴增所用引物序列如下SgF (AGAGTTTGATCATGGCTCAG)，SgR(TAGGGTTACCTTGTTACGACTT)，16S rDNA PCR產物用 96 孔millpore 純化系統純化后準確定量，經AB13730xl全自動序列分析儀測序,測序結果使用Seq uence scanner> Seqman等序列分析軟件，將兩向測序結果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的約1350bp (雙向測序)即用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxon server2.1數據庫中進行比對,確定菌株大致的分類地位。所有單菌16S序列全部導入seqman,輸出singlefile (fasta)后，經Mega5. 0軟件clusterW多重比對，輸出meg文 件重新導入構建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method為bootstrap參數設置為1000。16s rDNA鑒定結果顯不LCT-EC52 與 Escherichia coliKCTC2441 (T)的相似性為 99. 826%。4.耐藥性檢測配制菌懸液后稀釋涂布，粘貼藥敏片，選擇的抗生素為青霉素G、氨芐青霉素、頭孢唑林、復達欣(頭孢他啶)(頭孢噻甲羧肟)、菌必治(頭孢三嗪)、阿奇霉素(泰力特)、環丙沙星(奔克)(悉復歡)(丙氟哌酸)、潔霉素(林可霉素)、萬古霉素、復方新諾明、氯霉素、舒普深(先鋒必/舒巴坦)、丁胺卡那(阿米卡星)、鏈霉素、美滿霉素(二甲胺四環素)(米諾環素)、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦(特治星)。培養24h后觀察抑菌圈大小。結果發現與地面對照株相比較，大腸桿菌LCT-EC52對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢三嗪、阿奇霉素的耐藥性出現了明顯的增強，出現了完全耐藥。而地面對照菌株LCT-EC106對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢三嗪、阿奇霉素的抑菌圈大小分別為 2. 4cm、2. 5cm、3cm、3. 4cm、L Icm05.溶血試驗采用點種法，將太空株和地面株點種于同一血瓊脂培養基上，培養溫度37°C，培養24小時后觀察結果顯示空間誘變大腸桿菌LCT-EC52無溶血圈出現。6.生化代謝(Biolog)實驗制備菌懸液，接種至Biolog96孔板，37°C培養24_48h觀察結果(見圖2)。該菌株生化代謝較地面株差別較大如表2，由此得出LCT-EC52菌株不能利用D-水楊、甲基丙酮酸、亞碲酸鉀、溴酸鈉等。表2大腸桿菌空間菌株LCT-EC52的biolog生化特征代謝底物 LCT-EC52LCT-EC106
糊精+/-+/-
D-纖維二糖-+/-
庶-+1-
D-松二糖-+/-
水辦糖-+/_
D-棉子糖-+1-
D-水楊-+
8 % 的 NaCI+/-+
3 -曱基葡萄糖-+/-
D-巖藻糖-+/-
1%乳酸鈉++(棕黃)
D-絲氨酸++ (黃)
D-阿拉伯糖醇 -+/-
肌醇 -+/-
D-天門冬氨酸 -+/-
米諾環素+/-+
明膠 -+/-
權利要求
1.一種空間環境下的大腸桿菌LCT-EC52，其保藏號為CGMCC6518。
2.根據權利要求1所述的大腸桿菌LCT-EC52，其表型特征為革蘭氏陰性桿菌，無芽孢，菌體單個排列；對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢三嗪、阿奇霉素的耐藥性出現了完全耐藥；不能利用D-水楊、甲基丙酮酸、亞碲酸鉀、溴酸鈉等。
3.根據權利要求1所述的大腸桿菌LCT-EC52，進行全基因組測序和比較基因組學分析得出突變基因。
4.根據權利要求1所述的大腸桿菌LCT-EC52，通過轉錄組測序鑒定獲得差異表達基因。
5.根據權利要求1所述的大腸桿菌LCT-EC52，利用蛋白組學方法鑒定得出差異表達蛋白分子。
全文摘要
本發明涉及空間環境下大腸桿菌及其基因組序列。既往研究發現空間環境能夠影響微生物的許多特征，例如生長速率、細胞形態、細胞代謝水平、生物被膜的產生、毒力和耐藥性的增加或者降低。本發明利用太空特殊環境，通過搭載神舟八號飛船將大腸桿菌送入太空，歷經398小時、1100萬公里的飛行后返回地面，進行了表型相關實驗，證明了空間環境誘變的大腸桿菌菌株存在明顯的變化。隨后對該菌株進行了基因組測序、轉錄組測序、和蛋白質組學分析，旨在發現發生這些變化的潛在機制及其應用。隨著對這些問題的深入研究，有利于我們發現和了解空間環境對大腸桿菌的影響和致病性機制，為保障航天員安全提供了理論基礎。
文檔編號C12R1/19GK102994412SQ20121038012
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者劉長庭, 李天志, 方向群, 王俊峰, 郭英華, 常德, 蘇龍翔, 王雅娟, 陳振鴻, 劉巖 申請人:中國人民解放軍總醫院