專利名稱：水稻工程保持系的培育方法及其在水稻普通核不育系繁殖中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及作物不育系的繁殖技術領域，具體涉及一種自花授粉類作物雄性不育系的繁殖方法。
背景技術：
利用植物的雄性不育性培育雄性不育系，再借助這種遺傳工具來大量生產雜交種子，能使許多作物特別是自花授粉作物的雜種優勢得以在生產上應用。按照三型學說，植物的雄性不育分為細胞質雄性不育、細胞核雄性不育和質核互作型雄性不育三種遺傳類型。 細胞質雄性不育指不育性狀僅受細胞質基因控制，與細胞核無關，單純由細胞質控制的不育性狀由于找不到恢復系，所以在生產上還沒有應用實例。細胞核雄性不育指不育性狀僅受控于細胞核基因，與細胞質無關，分為顯性核不育和隱性核不育。目前已發現的核不育大多是隱性核不育。質核互作型雄性不育由細胞質基因和細胞核基因共同控制，既有保持系使其不育性得以保持，又能在恢復系的幫助下恢復F1雜交種的育性，這種類型的不育系與保持系、恢復系形成三系配套，是目前生產上最經典、最成熟的方法，即三系法。但是三系法的育種程序和生產環節較復雜，以致選育新組合的周期長、效率低、推廣環節多、速度慢，同時種子成本高、價格貴。在細胞核雄性不育類型中，隱性核不育依據不育性是否對環境因子敏感，又分為環境敏感核不育和普通核不育。環境敏感核不育，目前主要指光溫敏核不育，其育性既受核不育基因控制，又受外界光照長短和溫度高低的調控，在一定的發育時期，長日、高溫導致不育，短日、低溫導致可育，具有育性轉換的特征，可以一系兩用，比三系減少一系，也即常說的兩系法。光溫敏不育系除了不需要保持系、繁育簡易且效率更高外，還具有1)恢復譜廣，幾乎所有同亞種的正常品種都能使其育性恢復正常；2)遺傳行為簡單，不育性由I 2對隱性基因控制，容易轉育和穩定，有利于培育多種類型的不育系。但是也應當指出，由于光溫敏不育系的育性受外界光照和溫度調控，如果在不育系繁殖過程中光照和氣溫變化不在控制范圍內，將導致光溫敏不育系繁殖減產甚至失敗。普通核不育一般不受外部環境因子的影響，不管環境條件怎樣變化，總是表現為不育，這種不育類型在自然界中比較常見。與質核互作型不育和光溫敏核不育相比，普通核不育具有以下特點1)由于只受一對隱性核基因的控制，且育性不受環境影響，容易選育出不育率和不育株都為100%的普通核不育系；2)育性正常的品種都是它的恢復系，恢復譜及其廣泛，配組自由使得選育優良組合的幾率大增；3)能緊跟常規稻的選育步伐，開辟秈粳亞種間雜種優勢新領域，使水稻產量在現有雜交水稻基礎上實現更高產目標。因此，普通核不育是一種理想的不育材料。但由于這種類型的不育系沒有相應的保持系，且自身不能進行育性轉換，繁殖非常困難，暫未能在生產上大面積應用。目前，普通核不育系主要采用回交和無性繁殖來繁殖后代，例如，CN102121052A號中國專利文獻記載了利用分子標記輔助選擇通過回交來創制和繁殖水稻隱性核不育系。CN101946715A號中國專利文獻中記載了利用小孢子培養和無性克隆技術選育和繁殖甘藍型油菜隱性核不育系。另外，有文獻報道水稻的普通核不育系還可以再生繁殖，棉花的普通核不育系可以扦插繁 殖。通過上述方法，科研工作者可以繁殖得到少量的普通核不育系用于科研和實驗，但是繁殖得到的普通不育系數量稀少，而且需要花費大量的人力物力。如果能解決普通核不育系大規模繁殖的問題，將普通核不育系這一類型大規模應用于雜交制種，將極大地釋放雜種優勢的利用潛力。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種水稻工程保持系的培育方法及培育后產品在水稻普通核不育系繁殖中的應用，培育后的水稻工程保持系產品可機械化、規模化應用于水稻普通核不育系的繁殖制種，且能夠使繁殖制種過程的步驟簡單、操作方便。為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種水稻普通核不育系的工程保持系的培育方法，包括以下步驟
(1)準備基因型為SS的水稻普通核不育系，采用圖位克隆的方法定位并克隆所述水稻普通核不育系的不育基因s(通過同源比對預測不育基因功能，并通過基因敲除和過表達技術驗證該不育基因s的功能)；
(2)根據上述不育基因的序列設計引物，克隆出上述水稻普通核不育系來源親本(基因型為SS)的等位基因，即野生型基因S，由于不育基因s是從野生型基因S突變得到，因此，該野生型基因S即能夠恢復所述水稻普通核不育系育性的可育基因；不育基因s與可育基因S之間一般僅有一個堿基或幾個堿基的差異，也可以是一個DNA片段的缺失或插入；可育基因S以其自身啟動子驅動(啟動子為編碼區的前2kb的序列)；
(3)將顏色標記基因C與上述的可育基因S連接到同一個雙元表達載體上，使顏色標記基因C與可育基因S在導入植物后能連鎖遺傳、共分離(在水稻中，如果連鎖率為99%，則顏色標記基因C與可育基因S的物理距離相隔250X IO3堿基，本發明中C與S中間沒有間隔堿基，連鎖為100%，兩者共分離)，得到雙元表達載體pSe ；
(4)采用現有的轉基因方法(優選為農桿菌介導法或基因槍轉化法)將所述雙元表達載體PSe轉入所述的水稻普通核不育系中，通過PCR篩選得到帶有顏色標記基因C的水稻普通核不育系的育性恢復株系(Ttl代轉基因株系)；本發明培育的育性恢復株系中由于導入有可育基因S，而可育基因S對不育基因s為顯性，因此Ttl代轉基因株系及其后代株系將恢復育性；又由于顏色標記基因C與可育基因S共分離，T0代轉基因株系及其后代株系的可育性狀與顏色標記將連鎖遺傳，因此收獲該育性恢復株系種子后，可以根據結實率和顏色標記并輔助PCR檢測結果，通過不斷地自交繁殖(一般通過2 5代的自交繁殖即可)，可獲得育性穩定、結實率高且帶有顏色標記基因C的純合株系(通過測交驗證其基因型為SeSe)；
(5)將所述純合株系(基因型為SeSe)與普通核不育系(ss)回交，根據是否發熒光或PCR檢測確定回交后代是否攜帶顏色標記基因C，并通過southern blot檢測回交后代顏色標記基因的拷貝數，獲得單拷貝插入的工程保持系(基因型sSe)。上述的培育方法中，所述的水稻普通核不育系可以是通過遺傳選育、物理化學誘變、基因工程及其他各種手段或正規途徑獲得，優選物理化學誘變方法。所述水稻普通核不育系的不育性狀是由單基因控制的隱性性狀，所述可育基因S對不育基因s為顯性，且不育性狀不受外界環境條件影響。在優選的方案中，由于不育性狀只受一對隱性核基因的控制，且育性不受環境影響，因此更容易選育出不育率和不育株都為100%的普通核不育系。上述的培育方法，所述步驟(3)中，所述雙元表達載體優選為植物雙元表達載體，具體優選為 pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA1390、pCAMBIA3301、pBI121 中的任意一種(特別優選為 PCAMBIA1300 或 pCAMBIA1390)。上述的培育方法，所述步驟(3)中，顏色標記基因C能在種子中表達，使種子帶有顏色標記，以便于后續應用中色選出帶有該顏色標記基因的種子。所述的顏色標記基因優選為紅色熒光蛋白基因(GenBank: DQ493888. 2)、紅色熒光蛋白標記基因似P(GenBank: GQ495894. 1)、綠色熒光蛋白基因^FKGenBank: AF286456. 1)、綠色熒光蛋白基因從F/7 (GenBank: JX445134. 1)或藍色熒光蛋白基因屈尸產(GenBank: EF030494.1)，其中更優選為紅色熒光蛋白基因或綠色熒光蛋白基因從F/7。根據所述顏色標記基因C在種子中的表達部位，可以選擇合適的特異性表達啟動子，例如，顏色標記基因C在胚乳表達就選擇胚乳特異性表達啟動子，胚乳特異性啟動子有=Petl (GenBank: EU264103. I)和Pelum(GenBank: AY427569. I 或 GenBank: JN389781. I)。上述的培育方法中，所述不育基因S優選為mspl、pairl、pair2、zepl、mell、pssl、tdr、udtl、gamyb4、ptcl、api5、wdal、cyp704B2、dpw、tmds3、osc6、ripl、csa 或 ait/Z,所述可育基因S為對應的水稻野生型基因(可根據登錄號可以在NCBI上獲得相應基因序列，所述步驟(2)中的引物根據相應基因序列設計即可)。作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述培育方法獲得的工程保持系在水稻普通核不育系繁殖中的應用，所述工程保持系為帶有單拷貝顏色標記基因C且基因型為sSc的株系，該工程保持系是通過將共分離的可育基因S和顏色標記基因C導入普通核不育系受體(SS)后，與普通核不育系(SS)回交選育所得，因此所述工程保持系的遺傳背景與水稻普通核不育系(SS)基本一致，唯一差別在于工程保持系的基因組中插入了共分離的顏色標記基因C與可育基因S ;繁殖普通核不育系時，將該工程保持系與基因型為SS的水稻普通核不育系雜交，在雜交后代中同時獲得工程保持系種子和水稻普通核不育系種子(二者的比例一般為I : I左右);此時，顏色標記基因C在種子特異性表達啟動子驅動下，特異地在工程保持系種子中表達，通過色選機即可將所述工程保持系種子分選出來，依據顏色分選出來的基因型為sSe的工程保持系種子，可以繼續與基因型為ss的水稻普通核不育系雜交，繁殖基因型為sSe的雜合種子與基因型為ss的普通核不育系種子；剩下的種子即為基因型為ss的水稻普通核不育系種子，不含轉基因成分，可以與恢復系雜交用于雜交制種，也可以與基因型為sSe的雜合種子雜交，用于自身材料的繁殖和延續。與現有技術相比，本發明的優點在于
(I)通過轉基因手段創制工程保持系來繁殖水稻普通核不育系，繁殖得到的水稻普通核不育系不含轉基因成分；且育性正常的品種都是該水稻普通核不育系的恢復系，恢復譜極其廣泛，配組自由，使得選育優良組合的幾率大增；能緊跟常規稻的選育步伐，開辟秈粳亞種間雜種優勢新領域，使水稻產量在現有雜交水稻基礎上實現更高產目標；
(2)繁殖過程簡單，繁殖效率高不育系繁殖不受環境條件制約，種子純度高；雖然比兩系法多了一個工程保持系，但該工程保持系不需要額外繁殖，在繁殖水稻普通核不育系的同時，可由機器色選出工程保持系；
(3)智能分選，操作方便采用機器智能分選代替人工控制，為大規模機械化制種提供了可能。
圖I為本發明實施例中普通核不育系繁殖的工藝流程圖。圖2為本發明實施例中構建的胚乳特異性紅色熒光蛋白表達載體VTDIfsRed。
圖3為本發明實施例中southern blot檢測4個純合單株(TDfed / TD嚴、與普通核不育系(ss)回交后代的插入拷貝數,其中，I為Marker ；2和4為單拷貝插入；5為雙拷貝插入；3為無雜交信號。
具體實施例方式以下結合說明書附圖和具體優選實施例對本發明作進一步描述，但并不因此而限制本發明的保護范圍。實施例
水稻切/ (Tapetum Degradation Retardation)基因編碼的蛋白控制水稻絨粘層的降解，是水稻絨氈層發育和降解調控網絡中的重要因子。如果TS/ 基因發生突變，水稻花藥絨粘層將退化，導致水稻花粉敗育，產生一種水稻普通核不育系(參見CN1884541A號中國專利文獻)。一種本發明的水稻普通核不育系的工程保持系在水稻普通核不育系繁殖中的應用，其應用的具體對象即為本實施例上述的Wr基因突變體的普通核不育系，具體包括以下步驟(工藝流程可參見圖I)
I.60Co-Y射線誘變，獲得一株水稻不育突變體，根據遺傳分析表明該不育性狀由一個隱性單基因(即不育基因)控制，屬于一種水稻普通核不育系(基因型為tdr/tdr、。我們也可從突變體庫RiceGE購買水稻普通核不育突變體，網址http://signal. salk. edu/cgi-bin/RiceGE ;常見的可適用于本發明方法的核不育基因如下表I所示
表I :水稻普通核不育突變體列表
權利要求
1.一種水稻工程保持系的培育方法，包括以下步驟 (1)準備基因型為SS的水稻普通核不育系，通過采用圖位克隆的方法定位并克隆所述水稻普通核不育系的不育基因s ； (2)根據上述不育基因的序列設計引物，克隆出上述水稻普通核不育系來源親本的可育基因S，該可育基因S能夠恢復所述水稻普通核不育系育性； (3)將顏色標記基因C與上述的可育基因S連接到同一個雙元表達載體上，使顏色標記基因C與可育基因S在導入植物后能連鎖遺傳、共分離，得到雙元表達載體pSe ； (4)采用現有的轉基因方法將所述雙元表達載體pSe轉入所述的水稻普通核不育系中，最后得到水稻普通核不育系的育性恢復株系SeSe ； (5)將所述育性恢復株系的純合株系與普通核不育系ss回交，獲得基因型為sSe單拷貝插入的株系，即為工程保持系。
2.根據權利要求I所述的培育方法，其特征在于所述水稻普通核不育系的不育性狀是由單基因控制的隱性性狀，所述可育基因S對不育基因s為顯性，且不育性狀不受外界環境條件影響。
3.根據權利要求I所述的培育方法，其特征在于所述步驟(3)中，所述雙元表達載體為植物雙元表達載體，具體為 pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA1390、pCAMBIA3301 或pBI121。
4.根據權利要求3所述的培育方法，其特征在于所述植物雙元表達載體為PCAMBIA1300 或 pCAMBIA1390。
5.根據權利要求I所述的培育方法，其特征在于所述步驟(3)中，所述的顏色標記基因為紅色熒光標記基因紅色熒光蛋白標記基因似P、綠色熒光蛋白基因ffP、綠色熒光蛋白基因EGFP或藍色熒光蛋白基因EBFP。
6.根據權利要求5所述的培育方法，其特征在于所述的顏色標記基因為紅色熒光蛋白基因DsRed或綠色熒光蛋白基因EGFP。
7.根據權利要求2 6中任一項所述的培育方法，其特征在于所述不育基因s為mspl、pairl、pair2、zepl、mell、pssl、tdr、udtl、gamyb4、ptcl、api5、wdal、cyp704B2、dpw、mads3、osc6、ripl、csa或ait/Z,所述可育基因S為對應的水稻野生型基因。
8.根據權利要求2 6中任一項所述的培育方法，其特征在于所述步驟(4)中的轉基因方法為農桿菌介導法或基因槍轉化法。
9.一種如權利要求I 8中任一項所述培育方法獲得的工程保持系在水稻普通核不育系繁殖中的應用，其特征在于所述工程保持系為帶有單拷貝顏色標記基因C且基因型為sSe的株系，所述工程保持系是在所述水稻普通核不育系的基因組中插入了共分離的顏色標記基因C與可育基因S，在繁殖水稻普通核不育系時，將該工程保持系與基因型為ss的水稻普通核不育系雜交，在雜交后代中同時獲得工程保持系種子和水稻普通核不育系種子，再通過色選機將所述工程保持系種子分選出來，剩下的種子即為基因型為ss的水稻普通核不育系種子。
全文摘要
本發明公開了一種水稻工程保持系的培育并將培育的工程保持系應用于水稻普通核不育系繁殖的方法，包括以下步驟先采用圖位克隆的方法定位并克隆水稻普通核不育系的不育基因s和不育系來源親本的可育基因S；將顏色標記基因C與可育基因S連接到同一個雙元表達載體上，使二者在導入植物后能連鎖遺傳、共分離；采用轉基因方法將表達載體轉入普通核不育系中，得到育性恢復株系；再將其與普通核不育系回交，獲得工程保持系。本發明培育的工程保持系與水稻普通核不育系雜交，在雜交后代中可同時獲得工程保持系種子和水稻普通核不育系種子。本發明可機械化、規模化應用于水稻普通核不育系的繁殖制種，且能夠大大簡化普通核不育系的繁殖過程。
文檔編號C12N15/82GK102876711SQ201210426678
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者袁定陽, 李新奇, 李莉, 段美娟, 余東, 鄺翡婷, 宋書鋒, 李娜, 譚炎寧, 孫志忠, 袁光杰, 袁貴龍, 符習勤, 趙炳然, 張大兵, 袁隆平 申請人:湖南雜交水稻研究中心