專利名稱：破骨細胞培養試劑盒及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種破骨細胞培養試劑盒及其制備方法和應用，具體地說涉及一種利用細胞凍存技術長期保持骨髓單核巨噬細胞向破骨細胞分化的能力；在此基礎上，再聯合細胞因子誘導培養破骨細胞的方法。屬于醫學與生物技術領域。
背景技術：
目前，破骨細胞(0steOClast，0C)是機體內唯一具有骨吸收功能的細胞。在骨代謝過程中，破骨細胞與成骨細胞相互協作，保障骨重建順利進行，維持骨代謝的動態平衡。破骨細胞缺失或功能異常均能導致骨代謝疾病，如骨質硬化和骨質疏松等；除此之外，破骨細胞還參與腫瘤、炎癥和自身免疫性疾病的發生、發展，影響疾病的轉歸和預后。近二十年來，體外培養破骨細胞方法主要應用于如下研究領域一、研發破骨細胞生成和功能促進劑和抑制劑，人們正在不斷努力嘗試把上述發現應用到代謝性和免疫性骨病的臨床治療；二、將破骨細胞引入骨組織工程領域，將其與成骨細胞共同種植于礦化支架上，改善了組織工程化骨的重建結構；三、不斷發現新的破骨細胞生物標志物應用于臨床，用來監測骨吸收狀態，反映機體骨代謝穩態；四、應用于代謝性和免疫性骨病的發病機制研究中，極大的促進了骨骼疾病分子發病機制研究進展。綜上所述，建立體外破骨細胞培養方法是在細胞與分子水平研究各種因素(激素、細胞因子和環境元素等)影響骨吸收機制的基礎，也是研究代謝性骨病(骨硬化癥、骨質疏松癥等)、腫瘤、炎癥和自身免疫性疾病發病機制和治療藥物的有效手段。破骨細胞體外培養開始于20世紀80年代，Chambers首先成功地從兔四肢骨分離培養出成熟破骨細胞(呂明波，陳克明，劉興炎.國際骨科學雜志，2006年9月，第27卷，第5期308頁-310頁)。但是，由于破骨細胞在動物體內數量少、體積大、緊貼骨髓腔內表面生長、胞體分離時容易損傷，分離后不易培養；而且，分離法獲得的是終末期破骨細胞，難以用于進行分化和增殖方面的研究。近年來，隨著分子生物學和干細胞技術等領域的進展，發現破骨細胞由造血干細胞系中的單核巨噬細胞分化發育而來。人們進一步研究發現，骨髓、脾臟和外周血來源的單核細胞在含有誘導劑核因子kB受體活化子配體(RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)培養基中培養就能誘導生成破骨細胞。培養法所得細胞具有破骨細胞的典型特征單個細胞所含細胞核數> 3個；抗酒石酸性磷酸酶(TRAP)組化陽性；在體外破骨細胞可以降解骨片、象牙片或者人工骨組織等鈣化成分，形成吸收性陷窩(DuplombL, Dagouassat M, Jourdon P, Heymann D. Stem Cells. 2007Mar;25(3):544-52.)。但是，誘導培養法也有如下缺點(I)外周血單核細胞誘導培養法。外周血中造血干祖細胞細胞數目極少，破骨細胞的獲得效率較低。(2)脾臟細胞誘導培養法。該法操作步驟繁瑣，需要無菌摘取脾臟，研磨后獲取脾細胞懸液，然后使用淋巴細胞分離液制備單核細胞懸液，但其中所含的造血祖干細胞含量很少，需要進一步在細胞因子作用增殖數天后獲得足夠數量的單核細胞用于破骨細胞誘導實驗。(3)骨髓誘導培養法。近年來，人們通過細胞差異貼壁法，把骨髓細胞中的內皮細胞、脂肪細胞、成纖維細胞等雜細胞剔除，獲得純度較高的骨髓單核細胞，從而使破骨細胞純度和數量有了顯著提高，可以模擬骨髓微環境對破骨細胞分化發育的影響。但是，骨髓細胞的獲得需剝離動物肌肉，分離出長骨，然后反復沖洗骨髓，操作費時費力。除了上述細胞培養方法外，還有把骨髓間充質干細胞與單核細胞聯合細胞因子共培養破骨細胞的方法。該法是先提取骨髓中的間充質干細胞，經過4至6代的增殖(大概需要12天)，然后與從脾臟分離獲得的單核細胞在含有細胞因子的培養基中共培養，再經過3至15天，才能獲得破骨細胞。該法實質是把骨髓誘導破骨細胞培養法和脾細胞誘導法相結合，使破骨細胞培養步驟更加繁瑣，實驗周期延長(專利申請號200710120072.X)。目前，誘導培養法由于其能觀察處理因素對破骨細胞分化、生長和增殖的作用，是進行破骨細胞研究主流細胞培養方法。但由于其實驗操作步驟繁瑣，對實驗操作者有較高的實驗技能要求，限制了該技術的廣泛應用。因此，開發一種操作簡捷、長期穩定和經濟實用的破骨細胞培養試劑盒是開展破骨細胞相關研究的迫切需要。經檢索，到目前為止，還沒有發現一種操作簡捷、破骨細胞得率高的培養試劑盒及其制備方法。
發明內容
本發明的目的在于克服了現有技術中操作步驟繁瑣，費時費力等缺點，提供了一種操作簡捷、長期穩定和經濟實用的破骨細胞培養試劑盒及制備方法和應用。發明人經研究發現骨髓單核巨噬細胞在_80°C凍存I年內，其向破骨細胞分化能力未有改變，即一次性獲取足夠數量骨髓單核巨噬細胞后，即可分裝凍存，根據實驗需要隨時復蘇細胞用于破骨細胞培養，省去了現有破骨細胞誘導法的動物原代取材步驟。本發明提供的一種破骨細胞培養試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括如下三個試劑試劑A，即凍存的骨髓單核巨噬細胞；試劑B，即骨髓單核巨噬細胞培養液和試劑C，即破骨細胞誘導培養液；其中，試劑A為-80°c凍存的雄性C57BL/6小鼠骨髓單核巨噬細胞；其中，試劑B是通過將M-CSF、胎牛血清和青鏈霉素溶于a -MEM培養液中制備得到；其中，試劑C是通過將RANKL、M-CSF、胎牛血清和青鏈霉素溶于a -MEM培養液中制備得到。在本發明中，優選的，試劑B中各組分終濃度為M-CSF 30ng/ml，胎牛血清的體積百分數為10%,青鏈霉素濃度為100U/ml。在本發明中，優選的，試劑C中各組分終濃度為RANKL 100ng/ml, M_CSF30ng/ml，胎牛血清的體積百分數為10%,青鏈霉素濃度為100U/ml。在本發明中，優選的，試劑A，即凍存的骨髓單核巨噬細胞，是按照以下方法的制備得到從已脫頸處死的雄性C57BL/6小鼠身上無菌取出股骨和脛骨，剝凈其上軟組織，減去骨兩端，用吸滿a -MEM培養液的5ml注射器從骨的一端插入骨髓腔，沖洗出腔內紅色骨髓塊；用玻璃吸管輕輕吹打骨髓細胞液以獲得單一細胞懸液；用含10%胎牛血清和100U/ml青鏈霉素的a -MEM培養液清洗2次，重懸后，接種于6孔培養板內，培養條件為37°C，5%C02,孵育24小時，收集未貼壁細胞，將所得細胞懸液，800轉/min，離心5min，棄去上清液，根據細胞團大小添加適量凍存液，重懸后，分裝于細胞凍存管內，所得細胞即為骨髓單核巨噬細胞；細胞凍存管在4°C，放置2h，然后轉到-20°C，凍存4h，最后于-80°C長期保存。進一步的，本發明還提出了以上任一項所述的破骨細胞培養試劑盒在誘導或培養破骨細胞中的應用。一種利用本發明所述的試劑盒誘導或培養破骨細胞的方法，其特征在于包括以下步驟(I)復蘇試劑A中的細胞；(2)將復蘇的試劑A中的細胞，即骨髓單核巨噬細胞以I X IO5個/孔接種于96孔板內，用試劑B培養3天后，換液，更換為試劑C，每3天使用試劑C換液一次，即可達到誘導或培養破骨細胞的目的。在本發明中，優選的，步驟(I)中所述的復蘇包括將試劑A的凍存管置于42°C水 浴中，并不時搖動，使其快速解凍融化，然后在無菌條件下取出細胞，1000轉/min，離心5分鐘，棄去上清液，加入適量a-MEM培養液，重懸細胞，重復上述步驟一次，以達到去除細胞凍存液以及復蘇細胞的目的。按照本發明方法在試劑C培養3天時即有破骨細胞出現，培養5-6天就能獲得大量體積較大、成熟的破骨細胞。上述細胞因子RANKL(Receptor Activator for Nuclear Factor- k B Ligand,核因子K B受體活化因子配體)和M-CSF (macrophage colony stimulating factor,巨卩遼細胞集落刺激因子)均能在市場上購得。干粉狀細胞因子的溶解方法，按試劑生產廠家說明書操作。上述培養液、青鏈霉素及培養板等均可以從市場上購買。相較于現有技術，本發明所具有的優點和有益效果是(I)本發明方法簡化了破骨細胞誘導法操作步驟。一次性獲取足夠數量骨髓單核巨噬細胞后，即可分裝凍存，根據實驗需要隨時復蘇細胞用于破骨細胞培養；(2)本發明方法所得破骨細胞數量多，可以滿足相關細胞生物學和分子生物學實驗的要求；(3)本發明方法培養的破骨細胞分化成熟度高，骨片吸收能力強，能夠用于進行破骨細胞功能的研究；(4)本發明方法所用試劑和材料均可在市場上購得，簡便易行。
圖I為試劑A(凍存的骨髓單核巨噬細胞)在-80°C凍存0月、3月、6月和12月時，誘導培養獲得的破骨細胞形態比較；圖2為試劑A(凍存的骨髓單核巨噬細胞)在-80°C凍存0月、3月、6月和12月時，誘導培養獲得的破骨細胞骨片吸收實驗結果。
具體實施例方式下面通過實驗并結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。實施例I破骨細胞培養試劑盒的制備
I、藥品及其來源a-MEM 培養液(a-Minimal essential medium,貨號SH3O265. 01B)、青鏈霉素(貨號:SV30010)、胎牛血清(fetal bovine serum (FBS)貨號SV30087. 01)購自 ThermoScientific HyClone Company(USA)；M-CSF (貨號315-02)、RANKL (貨號315-11)購自美國 p印rotech 公司。2、方法(I)試劑A，即凍存的骨髓單核巨噬細胞的制備從已脫頸處死的雄性C57BL/6小鼠身上無菌取出股骨和脛骨，剝凈其上軟組織，減去骨兩端，用吸滿a -MEM培養液的5ml注射器從骨的一端插入骨髓腔，沖洗出腔內紅色骨髓塊；用玻璃吸管輕輕吹打骨髓細胞液以獲得單一細胞懸液；用含10%胎牛血清和100U/
ml青鏈霉素的a -MEM培養液清洗2次，重懸后，接種于6孔培養板內，培養條件為37°C，5%C02,孵育24小時，收集未貼壁細胞，將所得細胞懸液，800轉/min，離心5min，棄去上清液，根據細胞團大小添加適量凍存液，重懸后，分裝于細胞凍存管內，所得細胞即為骨髓單核巨噬細胞；細胞凍存管在4°C，放置2h，然后轉到_20°C，凍存4h，最后于-80°C長期保存。(2)試劑B，即骨髓單核巨噬細胞培養液的制備將M-CSF、胎牛血清和青鏈霉素溶于a -MEM培養液，使得試劑B中各組分終濃度為M-CSF 30ng/ml，胎牛血清的體積百分數為10%，青鏈霉素濃度為100U/ml。(3)試劑C，即破骨細胞誘導培養液的制備將RANKL、M-CSF、胎牛血清和青鏈霉素溶于a -MEM培養液中，使得試劑C中各組分終濃度為RANKL 100ng/ml, M-CSF 30ng/ml，胎牛血清的體積百分數為10%，青鏈霉素濃度為 100U/ml。(4)將試劑A、試劑B以及試劑C組裝成試劑盒，-80°C保存。實施例2用本發明試劑盒培養的破骨細胞的抗酒石酸性磷酸酶(TRAP)染色實驗試劑A (凍存的骨髓單核巨噬細胞)分別在_80°C凍存0月、3月、6月和12月時，分別將試劑A的凍存管置于42°C水浴中，并不時搖動，使其快速解凍融化，然后在無菌條件下取出細胞，1000轉/min，離心5分鐘，棄去上清液，加入適量a -MEM培養液，重懸細胞，重復上述步驟一次，以達到去除細胞凍存液的目的；將復蘇的試劑A中的細胞，即骨髓單核巨噬細胞以I X IO5個/孔接種于96孔板內，用試劑B培養3天后，換液，更換為試劑C，每3天使用試劑C換液一次。在培養第5天時，終止實驗，每組做5個平行孔。使用TRAP染色試劑盒(購自中國上海太陽生物公司)進行破骨細胞TRAP染色。TRAP染色陽性細胞表現為含有紅色顆粒狀物質。TRAP染色陽性并且細胞核大于等于3個的細胞計數為破骨細胞。光學顯微鏡下觀察形態并拍照。結果本發明方法凍存的骨髓單核巨噬細胞在_80°C凍存12個月內向破骨細胞的分化能力無差異。由圖I可以看到，各時間點破骨細胞形態無差別，均表現為細胞體積大，所含細胞核數可達數十個，TRAP染色陽性。由表I可見，各時間點破骨細胞形成數量無統計學差異(F=3. 345，P=O. 064)。表I破骨細胞計數結果
權利要求
1.一種破骨細胞培養試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括如下三個試劑試劑么，即凍存的骨髓單核巨噬細胞；試劑B，即骨髓單核巨噬細胞培養液和試劑C，即破骨細胞誘導培養液； 其中，試劑A為-80°C凍存的雄性C57BL/6小鼠骨髓單核巨噬細胞； 其中，試劑B是通過將M-CSF、胎牛血清和青鏈霉素溶于a -MEM培養液中制備得到； 其中，試劑C是通過將RANKL、M-CSF、胎牛血清和青鏈霉素溶于a -MEM培養液中制備得到。
2.如權利要求I所述的破骨細胞培養試劑盒，其特征在于試劑B中各組分終濃度為M-CSF 30ng/ml，胎牛血清的體積百分數為10%，青鏈霉素濃度為100U/ml。
3.如權利要求I所述的破骨細胞培養試劑盒，其特征在于試劑C中各組分終濃度為RANKL 100ng/ml, M-CSF 30ng/ml，胎牛血清的體積百分數為10%，青鏈霉素濃度為100U/ml o
4.如權利要求I所述的破骨細胞培養試劑盒，其特征在于試劑A是按照以下方法的制備得到從已脫頸處死的雄性C57BL/6小鼠身上無菌取出股骨和脛骨，剝凈其上軟組織，減去骨兩端，用吸滿a -MEM培養液的5ml注射器從骨的一端插入骨髓腔，沖洗出腔內紅色骨髓塊；用玻璃吸管輕輕吹打骨髓細胞液以獲得單一細胞懸液；用含10%胎牛血清和100U/ml青鏈霉素的a -MEM培養液清洗2次，重懸后，接種于6孔培養板內，培養條件為37 °C，5%C02,孵育24小時，收集未貼壁細胞，將所得細胞懸液，800轉/min，離心5min，棄去上清液，根據細胞團大小添加適量凍存液，重懸后，分裝于細胞凍存管內，所得細胞即為骨髓單核巨噬細胞；細胞凍存管在4°C，放置2h，然后轉到_20°C，凍存4h，最后于-80°C長期保存。
5.權利要求1-4任一項所述的破骨細胞培養試劑盒在誘導或培養破骨細胞中的應用。
6.一種利用權利要求1-4任一項所述的試劑盒誘導或培養破骨細胞的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)復蘇試劑A中的細胞； (2)將復蘇的試劑A中的細胞，即骨髓單核巨噬細胞以IXIO5個/孔接種于96孔板內，用試劑B培養3天后，換液，更換為試劑C，每3天使用試劑C換液一次，即可達到誘導或培養破骨細胞的目的。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于步驟(I)中所述的復蘇包括將試劑A的凍存管置于42°C水浴中，并不時搖動，使其快速解凍融化，然后在無菌條件下取出細胞，1000轉/min,離心5分鐘,棄去上清液,加入適量a -MEM培養液,重懸細胞,重復上述步驟一次，以達到去除細胞凍存液以及復蘇細胞的目的。
全文摘要
本發明公開了一種破骨細胞培養試劑盒及制備方法和應用。本發明人經研究發現骨髓單核巨噬細胞在-80℃凍存1年內，其向破骨細胞分化能力未有改變，即一次性獲取足夠數量骨髓單核巨噬細胞后，即可分裝凍存，根據實驗需要隨時復蘇細胞用于破骨細胞培養，省去了現有破骨細胞誘導法的動物原代取材步驟。本發明試劑盒操作簡捷，在較短時間內(一周)即可獲得大量具有骨吸收能力的破骨細胞。該試劑盒所培養的破骨細胞可應用于破骨細胞相關的生物學和分子生物學實驗，還可應用于篩選骨吸收的抑制劑和促進劑等藥物的研發以及與破骨細胞相關疾病的發病機制研究。
文檔編號C12N5/077GK102978155SQ20121046397
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者裴俊瑞, 孫殿軍, 高彥輝, 李丙云 申請人:哈爾濱醫科大學