一種α-氨基酸酯水解酶固定化方法
【專利摘要】本發明公開了一種獲得固定化α-氨基酸酯水解酶的方法；本發明所使用的酶來源于含有重組質粒pET28a-aeh的大腸桿菌BL21(DE3)；所使用的載體為含環氧基活性基團的珠狀聚合物；固定化酶活力為550-800U/g，固定化酶活回收率達到52%。
【專利說明】一種α-氨基酸酯水解酶固定化方法【技術領域】:
[0001]本發明屬于生物酶工程【技術領域】，提供了一種α-氨基酸酯水解酶(AEH)的固定化方法。
【背景技術】:
[0002]由于游離酶的不穩定性，限制了其在工業上的應用。而將其進行固定化處理后，所得到的固定化酶不但提高了對熱、酸堿等的穩定性，而且還使得其能夠回收重復使用，從而大大降低工業應用的成本。對于AHl酶的固定化，已經有些報道，其中固定化方法涉及交聯聚集體(CLEA)。中國專利申請號200810044881.1報道了一種固定化工藝。該工藝采用紅紋黃單胞菌發酵獲得菌體，然后采用分步破碎的方式進行細胞破碎，先將菌體于-25'30°C條件下利用低溫效應破壞細胞，再用乙酸丁酯處理解凍的懸浮液，用絮凝劑除去細胞殘片，離心獲得無細胞提取液。向無細胞提取液中加入聚乙二醇沉淀目標蛋白，再加入戊二醛進行交聯，制得交聯蛋白聚集體形態的固定化α-氨基酸酯水解酶。其中蛋白含量為95%(干重)，合成酶 活力為2200U/g干重。中國專利申請號200910058710.9在此基礎上對工藝進行了改進，該工藝同樣采用紅紋黃單胞菌發酵獲得菌體，去除了對菌體進行低溫凍融的步驟，而是直接用乙酸丁酯進行細胞破碎，然后加入絮凝劑，離心分離獲得高純度的無細胞提取液，其比活力為5.5-9.5U/mg蛋白。在2_4°C條件下加入分子量為6000-8000的聚乙二醇進行沉淀，再加入25%戊二醛水溶液進行交聯，制得無載體固定化的α -氨基酸酯水解酶。其干重含量為21.7%，合成酶活力達到3680U/g干重。
[0003]上述2種固定化工藝極為相似，后者對前者進行了改進，都屬于是無載體固定化形式。所得的固定化酶為酶蛋白交聯聚集體，主要缺點有:
[0004]1、所制得的固定化酶顆粒大小不一，形狀各異，不均勻。
[0005]2、蛋白聚集體顆粒強度低,易碎,不利于工業化應用。
[0006]3、所得固定化酶為蛋白聚集體，其中蛋白含量占其干重的95%，不易于長時間儲存，影響工業化應用。
[0007]相對于交聯聚集體的固定化形式，在載體上固定化的酶更穩定，強度更高，不易破碎，具有更高的循環使用次數。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供一種α -氨基酸酯水解酶在一種含環氧基活性基團載體上的固定化方法。本發明所提供的固定化方法有以下優點:
[0009]1、所制得的固定化酶顆粒大小均勻，有利于工業化催化反應進行。
[0010]2、所制得的固定化酶顆粒機械強度高，不易破碎，有利于工業化生產中的反復利用，降低成本。
[0011]3、所制得的固定化酶由載體表面結合酶蛋白組成，蛋白與載體間以形成共價鍵方式結合，結合牢固，蛋白不易脫落，具有更高的循環使用次數。[0012]4、相對于游離酶和無載體固定化酶，本方法所制得固定化酶易于儲存和運輸，更有利于工業化應用。
[0013]本發明提供的α -氨基酸酯水解酶固定化方法如下:
[0014]發酵含有重組質粒pET28a_aeh的大腸桿菌BL21 (DE3)，離心收集菌體，稱重。按照4ml/g菌體的添加量，用pH為7.8的緩沖液(含50mmol/lNaH2P04和300mmol/l的NaCl)重懸菌體，攪拌均勻。向上述菌懸液中加入溶菌酶，其終濃度為80000-100000U/ml，間歇攪拌20分鐘。之后向其中加入1%的曲拉通X-100，繼續攪拌，體系變粘稠。向其中加入DNA酶和RNA酶，添加量分別為10ug/ml和20ug/ml。攪拌I小時，至體系不粘稠。在4°C條件下，8000r/min，離心lOmin。保留離心上清液，為無細胞提取液。于冰水浴中向其中加入硫酸銨至20%飽和度。緩慢攪拌2小時。然后在4°C條件下，9000r/min，離心25min，除去沉淀的雜蛋白，向離心上清液中繼續加入硫酸銨至60%飽和度，保持冰水浴條件下緩慢攪拌2小時，沉淀目標蛋白。于4°C條件下，9000r/min，離心30min，所得沉淀為粗酶。活力為2000-3000U/g。 [0015]用去離子水將上述得到的粗酶溶解制得粗酶液，備用。配制乙酸鉀溶液，用稀氨水調節PH為6.8-7.0備用。用去離子水洗滌含環氧基活性基團的樹脂載體，除去懸浮于水面的破碎顆粒，按照QE=400-1000的量加入粗酶液，并向其中加入上述乙酸鉀緩沖液，使得乙酸鉀的終濃度為0.8-3.0mol/1, α -氨基酸酯水解酶活力為5_100U/ml，控制體系的pH為
6.5-7.0,于搖床上100-150r/min轉速震搖，搖床溫度為10-25°C。振搖2_8小時后取出，用去離子水反復洗滌，至洗出液無酶活力。玻沙漏斗抽濾，得固定化α-氨基酸酯水解酶，活力為550_800U/g干重。
[0016]本發明中所提及的酶活力的定義為:含40 mmol/L 7-ACCA和80mmol/L D-PGM的底物溶液在pH 6.0 (0.05 mo I/L磷酸銨)和30°C條件下反應30min，每分鐘生成I μ mo I頭孢克洛所需酶量定義為一個酶活力單位(U)。
【具體實施方式】
[0017]實施例:
[0018]取170g含有重組質粒pET28a_aeh的大腸桿菌BL21(DE3)菌體。向其中加入680ml pH為7.8的緩沖液(含50mmol/lNaH2P04和300mmol/l的NaCl )，攪拌，形成菌懸液，體積880ml。向其中加入Ig溶菌酶(活力為9650U/mg)，室溫下攪拌20分鐘，向體系中加Λ 90ml 10%曲拉通X-100溶液，繼續攪拌，體系變粘稠狀。再向其中加入9.5mg的DNA酶和19mg的RNA酶，繼續攪拌I小時。在4°C條件下，8000r/min，離心lOmin。保留離心上清液，為無細胞提取液，體積825ml，活力為168U/ml。于冰水浴中向其中加入87.45g硫酸銨至20%飽和度。緩慢攪拌2小時。然后在4°C條件下，9000r/min，離心25min，除去沉淀的雜蛋白，向離心上清液中繼續加入205g硫酸銨至60%飽和度，保持冰水浴條件下緩慢攪拌2小時，沉淀目標蛋白。于4<€條件下,90001'/111；[11,離心30min,得47g粗酶,活力為2423U/g°
[0019]取26g上述粗酶，用少許去離子水溶解，向其中加入100ml的乙酸鉀溶液，用稀氨水調節PH為6.8-7.0，控制乙酸鉀的終濃度為1.3mol/l，用1.3mol/l，PH為6.8的乙酸鉀溶液調節體系總體積為150ml，用去離子水洗滌載體3次，去除懸浮于水面的破碎顆粒，用玻沙漏斗抽濾，稱取105g加入上述酶溶液中。保持固定化反應溫度為15°C，搖床轉速為150r/min,反應4小時后，取出載體用去離子水洗滌，玻沙漏斗抽干,如此反復4次，至洗滌液無酶活力。稱重得 固定化α-氨基酸酯水解酶IlOg,酶活力為713U/g干重，固定化酶活回收率為 52%。
【權利要求】
1.一種α-氨基酸酯水解酶固定化方法，按如下步驟進行: (O發酵含有重組質粒pET28a-aeh的大腸桿菌BL21 (DE3)，離心分離獲得菌體； (2)將菌體用溶菌酶、DNA酶和RNA酶處理，離心分離獲得無細胞裂解液； (3)通過鹽析初步去除沉淀雜蛋白和沉淀目的蛋白； (4)將所獲得粗酶和處理后的載體按照一定的比例加入含有鹽的溶液中，控制體系的溫度和pH，進行固定化反應，反應一定時間后，取出用去離子水洗滌至洗滌流出液無酶活力，抽濾去水，獲得固定化的α-氨基酸酯水解酶。
2.如權利要求1所述的固定化方法，其特征在于，鹽析操作中使用的鹽為硫酸銨，其質量百分比濃度為從10%-50%。
3.如權利要求1所述的固定化方法，其特征在于，細胞裂解液為大腸桿菌細胞經過溶菌酶處理后經低溫高速離心后所得的上清液。
4.如權利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所使用的載體為含有環氧基活性基團的圓珠狀聚合物，其粒徑為150 μ m300 μ m,環氧官能團容量不低于50 μ mol/g,含水量 40-70%。
5.如權利要求1所述的固定化方法，其特征在于，其固定化反應溫度為10°C—35°C,固定化反應攪拌速度為100r/min—300r/min。
6.如權利要求 5所述的固定化方法，其特征在于，其固定化反應溫度為10°C-25°C，固定化反應攪拌速度為150 r/min-230 r/min。
7.如權利要求1所述的固定化方法，其特征在于，固定化反應在一定濃度的鹽溶液中進行，所用的鹽包括陰離子為硫酸根、硝酸根、氯離子、乙酸根、碳酸根、碳酸氫根、磷酸根、磷酸一氫根、磷酸二氫根；陽離子包括銨離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子、鈣離子、鋁離子。
8.如權利要求7所述的固定化方法，其特征在于，所用的鹽濃度0.lmol/L2.5mol/
9.如權利要求1所述的固定化方法，其特征在于，固定化反應體系酶與載體的比例按照QE值范圍為1001000加入，QE值為200800，固定化反應體系的pH為5.09.0。
10.如權利要求9所述的固定化方法，其特征在于，固定化反應體系酶與載體的QE值為.300700，固定化反應體系的pH為6.0 — 7.0。
【文檔編號】C12R1/19GK103834633SQ201210484995
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月26日 優先權日:2012年11月26日
【發明者】李端華, 李進軍, 葉麗娟, 潘佳林, 王輅 申請人:中國醫藥集團總公司四川抗菌素工業研究所