水稻新生組織特異啟動子p-EMA1及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種水稻新生組織特異啟動子p-EMA1及其應用。本發明提供的啟動子，來源于普通野生稻（O.rufipogon?Griff.），為如下1）或2）或3）或4）：1）序列1自5’末端第1至1841位核苷酸所示的DNA分子；2）序列1所示的DNA分子；3）與1）或2）限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；4）與1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動子功能的DNA分子。本發明對于水稻早熟分子機制的研究，水稻早熟品種的選育具有重要的理論及實際意義。本發明對于水稻新生組織特異表達的分子機制的研究，以及水稻新生組織特異表達特征分子育種具有重要的理論及實際意義。本發明在農業領域將具有廣闊的應用和市場前景。
【專利說明】水稻新生組織特異啟動子P-EMA1及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種水稻新生組織特異啟動子P-EMAl及其應用。
【背景技術】
[0002]植物新生組織(器官)均由原基分化發育而成，并且植物具有持續發育新生組織(器官)的能力，因此新生組織的生長發育狀況對于整個植株的生長發育至關重要。
[0003]水稻是世界上最重要的糧食作物之一，其種子可供人類食用。水稻籽粒產量的決定因素主要包括有效穗、結實率、每穗粒數和粒重，而有效穗數和每穗粒數均于新生組織的生長狀態緊密相關。因此，設計水稻新生組織特異表達的啟動子對于水稻產量分子育種至關重要。
[0004]普通野生稻是亞洲栽培稻的祖先種，野生稻在演化成栽培稻的過程中，經過自然選擇和人工選擇，基因多樣性降低，等位基因數減少。據統計，栽培稻的等位基因數約為野生稻的60%,從而導致當前水稻品種選育所面臨的遺傳瓶頸(geneticbottleneck)問題。因此從水稻的近緣野生種(普通野生稻Oryza rufipogon Griff.)基因組中發掘和利用在栽培稻中已丟失或削弱的優異基因，并把它們應用于水稻育種生產中具有十分重要的理論意義和實踐價值，也是解決當前水稻育種難題的一條行之有效的途徑。
[0005]我國野生稻資源豐富，從野生稻中發掘、定位、克隆水稻新生組織特異啟動子，將對水稻生產具有重要意義。[0006]云南元江普通野生稻是中國生長位置海拔最高(780m)的普通野生稻，其生長環境與栽培稻的隔離條件好，沒有栽培稻基因的滲入。Sun等(2002)對元江普通野生稻核基因組及線粒體、葉綠體基因組的遺傳分化的研究表明，元江普通野生稻是一個非常特殊的普通野生稻群體，是研究亞洲野生稻起源演化和拓寬水稻遺傳基礎的重要材料。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種水稻新生組織特異啟動子P-EMAl及其應用。
[0008]本發明提供了一種具有啟動子功能的DNA片段，命名為P-EMAl (或ρ_ΕΜΑ1)，來源于普通野生稻(0.rufipogon Griff.),為如下I)或2)或3)或4):
[0009]I)序列表中序列I自5’末端第I至1841位核苷酸所示的DNA分子；
[0010]2)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0011]3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；
[0012]4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動子功能的DNA分子。
[0013]上述嚴格條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0014]含有所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。[0015]所述重組載體可為在植物表達載體pCambial381的多克隆位點插入所述DNA片段得到重組質粒。所述重組載體具體可為將所述DNA片段插入植物表達載體pCambial381的BamHI和HindIII酶切識別位點間得到的重組質粒。
[0016]擴增所述DNA片段的全長或其任意片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。
[0017]本發明還保護所述DNA片段在啟動目的基因表達中的應用。所述啟動目的基因表達可為啟動目的基因的特異性表達。所述特異性表達具體可為組織特異表達。所述組織特異表達可為新生組織特異表達。所述新生組織為幼芽(特別是幼芽基部)、根的生長點，新生葉或新生穗。
[0018]本發明還保護所述DNA片段在培育轉基因植物中的應用。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為水稻，如水稻品種“日本晴”。
[0019]本發明還保護一種培育轉基因植物的方法，是在出發植物中用所述DNA片段啟動目的基因的表達，得到表達所述目的基因的轉基因植物。所述出發植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為水稻，如水稻品種“日本晴”。所述目的基因具體可為GUS基因。所述方法具體可為將所述重組載體導入所述出發植物，從而在所述出發植物中用所述DNA片段啟動⑶S基因的表達。
[0020]本發明公開了一個水稻新生組織特異啟動子P-EMAl及其應用。本發明提供的DNA片段具有啟動子的功能，具有特異表達的特性。本發明對于水稻早熟分子機制的研究，水稻早熟品種的選育具有重要的理論及實際意義。本發明對于水稻新生組織特異表達的分子機制的研究，以及水稻新生組織特異表達特征分子育種具有重要的理論及實際意義。本發明在農業領域將具有廣闊的應用和市場前景。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為目的片段在滲入系YIL23和特青不同生長發育時期的表達譜分析。
[0022]圖2A為融合⑶S基因載體不意圖。
[0023]圖2B為P-EMAl的PCR擴增策略。
[0024]圖3為轉基因植株⑶S組織染色結果；a為5d幼苗；b為15天苗的幼葉；c_i為穗發育不同時期的染色結果。
【具體實施方式】
[0025]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。所用引物合成及測序工作均由北京奧科生物科技有限責任公司完成。
[0026]水稻品種“日本晴”:中國作物種質資源信息網(http://icgr.caas.net.cn/),庫編號為I1A13071。
[0027]水稻品種“特青”:中國作物種質資源信息網(http://icRr.caas.net, cn/),庫編號為 I1A40810。
[0028]植物表達載體pCambial381 即 NCBI 中的 Binary vector pCAMBIA-1381,為環形質粒，其核苷酸序列見NCBI中的如下序列:GenBank:AF234302.1 ;VERSION:AF234302.1 ；G1:7638091 ο植物表達載體pCambial381的核苷酸序列中，第9810至10590位核苷酸為CaMV35S啟動子(組成型啟動子)，用來啟動潮霉素基因；第2-1855位核苷酸為GUS基因(質粒中沒有用于啟動GUS基因的啟動子)；第7214-8008位核苷酸為aadA基因(卡那霉素抗性基因)；第8749-9774位核苷酸為hptll基因(潮霉素抗性基因)。
[0029]實施例1、水稻新生組織特異啟動子P-EMAl的發現
[0030]一、EMAl基因的發現
[0031]從以云南元江普通野生稻(Orzya rufipogon Griff.)為供體親本和秈稻品種特青(Oryza sativa ssp.1ndica)為受體親本構建的滲入系群體中分離了一個早熟滲入系HL23，比特青提前約28天抽穗，通過圖位克隆的策略克隆了該早熟基因EMA1。分析雙親EMAl基因的表達顯示，苗期EMAl基因在葉中的表達量逐漸升高，到頂點后迅速降低，但EMAl基因在滲入系HL23中表達量升高的速度比在特青中要快(見圖1，TQ代表特青，YIL23代表早熟滲入系YIL23)。即在苗期，滲入系YIL23中EMAl的表達比特青中EMAl的表達更強，且隨著幼苗長大，雙親中EMAl的表達量逐漸升高。
[0032]二、水稻新生組織特異啟動子P-EMAI的發現
[0033]由于候選基因EMAl的第I內含子長約30kb，因此無法直接從基因組序列擴增目的基因。我們采取如下策略進行擴增(見圖2B):(1)用P1/P2引物從YIL23的基因組DNA擴增片段1，該片段包含EMAl的啟動子區域(約ATG上游2kb)、5’UTR和第I外顯子的部分序列。其中，P2引物位于第I外顯子；(2)以P3/P4引物從HL23的第I鏈cDNA擴增片段2，該片段包含EMAl ORF的大部分序列和3’UTR的部分序列。其中，P3引物與P2引物反向互補；(3)將擴增的片段I和片段2混合，加入除引物外的PCR反應組分進行如下程序:預變性95° C 5分鐘；變性95° C I分鐘，退火55° C I分鐘，延伸72° C I分鐘，循環5次；過度延伸7分鐘；然后加入`引物P1/P4進行正常的PCR擴增獲得片段3，該片段包含EMAl的啟動子區域、5’ UTR和ORF序列。其中，Pl和P4引物的5’端分別含有內切酶BamHI和HindIII的識別位點。將PCR產物進行測序，測序結果表明，PCR產物具有序列表的序列I所示的DNA片段。
[0034]將序列表的序列I所示的DNA片段命名為P-EMAl (新生組織特異啟動子)(序列I中，第I至1841位核苷酸為預測的啟動子序列，余下的核苷酸為CDNA序列)。
[0035]實施例2、P-EMAl轉基因水稻的獲得及其鑒定
[0036]一、植物表達載體的構建
[0037]1、合成序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子。
[0038]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用Pl和P4組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0039]Pl:5，-ATGGATCC ATCACCGCAAATACTCTCCC-3，；
[0040]P4:5，-GCAAGCTT ACGCAGAGATCCAGCTTATTCC-3，。
[0041 ] Pl中，帶下劃線堿基為限制性內切酶BamHI識別位點；
[0042]P4中，帶下劃線堿基為限制性內切酶HindIII的識別位點。
[0043]3、用限制性內切酶BamHI和HindIII雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0044]3、用限制性內切酶BamHI和Hindi 11雙酶切植物表達載體pCambial381，回收載體骨架(約 10650bp)。
[0045]4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒pCambial381-pEMAlo根據測序結果,對重組質粒pCambial381_pEMAl進行結構描述如下:在植物表達載體pCambial381的BamHI和HindIII酶切位點之間插入了序列表的序列I所示的DNA片段。
[0046]二、pCambial381_pEMAl 轉基因水稻的獲得
[0047]1、將水稻品種“日本晴”的成熟胚愈傷組織作為基因槍轟擊的受體，用基因槍將重組質粒pCambial381-pEMAl轟擊到愈傷組織,具體步驟如下:
[0048](I)將水稻品種“日本晴”的成熟胚愈傷組織在高滲透培養基(NB培養基+91.2g/L甘露醇)上進行滲透處理4-6h (28°C，暗培養)。
[0049](2)用重組質粒 pCambial381_pEMAl 包裹直徑 110 μ m 金粉，采用 PDS-1000/He 基因槍(Bio-Red公司生產)，選擇IlOOPsi的可裂膜，載樣距靶材料6cm進行轟擊。
[0050](3)轟擊后的愈傷組織繼續在原培養基上培養16h (28°C，暗培養)。[0051]2、將完成步驟I的愈傷組織轉移到恢復培養基(NB培養基+2mg/L 2，4_D)上，恢復培養I周(28°C，暗培養)。
[0052]3、將完成步驟2的愈傷組織轉移到篩選培養基(NB培養基+50mg/L潮霉素)上，28°C暗培養30天。
[0053]4、將完成步驟3的愈傷組織轉移到篩選培養基(NB培養基+50mg/L潮霉素)上，28°C暗培養30天。
[0054]5、將步驟4得到的愈傷組織轉移到預分化培養基上(NB培養基+5mg/L脫落酸+50mg/L潮霉素+2mg/L萘乙酸+lmg/L 6-節氨基嘌呤),28?暗培養15天。
[0055]6、將步驟5得到的愈傷轉到分化培養基上(NB培養基+2mg/L 6_芐氨基嘌呤+lmg/L萘乙酸+lmg/L激動素+50mg/L潮霉素),28°C光照培養15天。
[0056]7、將步驟6中幼苗轉移到生根培養基上(1/2MS培養基+0.5mg/L萘乙酸+0.09g/L肌醇+30g/L蔗糖)，28°C光照培養30天。
[0057]8、將步驟7中苗高7-8cm且根系發達的植株移栽到花盆，放置于溫室中培養3周，成活的植株即為Ttl代植株。Ttl代植株自交產生的種子及由它所長成的植株用T1代表示。
[0058]9、將Ttl代植株進行PCR鑒定(靶序列為潮霉素抗性基因，引物對由IF和IR組成，靶序列約為lOOObp)，PCR鑒定為陽性的植株即為轉基因植株。
[0059]IF:5，-tacttctaca cagccatc-3，；
[0060]IR，5， -cgtctgtcga gaagtttc-3，。
[0061]三、轉空載體植株的獲得
[0062]將植物表達載體pCambial381代替重組質粒pCambial381_pEMAl進行步驟二的操作，得到轉空載體植株。
[0063]四、轉基因水稻的組織表達特異性分析
[0064]取步驟二得到的轉基因植株或步驟三得到的轉空載體植株分別進行如下鑒定:
[0065]觀察染色結果發現，正常培養T1代植株，在不同的發育階段取轉基因植株的幼苗整株、葉片和穗等進行GUS染色分析。萌發5天的幼苗的GUS染色照片見圖3a，轉基因幼苗中呈現了明顯的⑶S染色，且多集中在幼芽基部和根的生長點等部位。觀察第15天(生長15天的幼苗)幼苗的GUS染色結果見圖3b，轉基因幼苗在葉上能觀察到比先前更為明顯的GUS染色，在新生葉上尤為顯著。孕穗期的照片見圖3c-1，在穗發育的不同時期，轉基因植株獲得的小穗(新生穗)均能觀察到明顯的GUS染色。
[0066]因此，無論是在苗期葉片還是在進入孕穗期的穗，P-EMAl在新生組織和細胞旺盛分裂的部位(如生長點、幼穗)表達量較高。
[0067]轉空載體植株在各個相應時期的各個組織部位均不具有GUS表達活性。
[0068]實施例2的實驗重復進行`三次，都得到同樣的結果。
【權利要求】
1.一種DNA片段，為如下I)或2)或3)或4): 1)序列表中序列I自5’末端第I至1841位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列I所不的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動子功能的DNA分子。
2.含有權利要求1所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
3.如權利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為在植物表達載體pCambial381的多克隆位點插入權利要求1所述DNA片段得到重組質粒。
4.如權利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為將權利要求1所述DNA片段插入植物表達載體pCambial381的BamHI和HindIII酶切識別位點間得到的重組質粒。
5.擴增權利要求1所述DNA片段的全長或其任意片段的引物對。
6.權利要求1所述DNA片段在啟動目的基因表達中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于:所述啟動目的基因表達為啟動目的基因特異性表達。
8.一種培育轉基因植物的方法，是在出發植物中用權利要求1所述DNA片段啟動目的基因的表達，得到表達所述目的基因的轉基因植物。
【文檔編號】C12N15/63GK103834655SQ201210482822
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月23日 優先權日:2012年11月23日
【發明者】孫傳清, 謝道昕, 彭文, 譚祿賓, 葉盛, 張永生, 單曉昳, 劉鳳霞 申請人:中國農業大學