專利名稱：一株能防治植物細菌病害的產酶溶桿菌無標記工程菌株構建與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一株能防治植物細菌病害的產酶溶桿菌無標記工程菌株構建與應用。
背景技術：
產酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes)是溶桿菌屬(Lysobacter)的模式種，屬于黃單胞科(Xanthomonadaceae),該菌菌落黏性、黃色、富含G+C%、有滑行能力，能產生蛋白酶、幾丁質酶、β -I, 3-葡聚糖酶，纖維素酶等多種胞外酶,對真菌、卵菌和線蟲等多種植物病原物都有很好的拮抗活性。
OHl I菌株分離于辣椒根際土壤，是國內首次報道的一株生防細菌菌株。該菌株對水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、黃瓜腐霉(Pythium ultimum)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麥赤霉病菌(Fusarum solani)、南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)等多種植物病原物均具有強烈的拮抗活性。在溫室盆栽試驗中，OHll對辣椒疫病防治效果達到了 83.6%。然而，到目前為止，仍未見產酶溶桿菌防治植物細菌病害的報道。細菌的QS (Quorum sensing)系統是細菌通過分泌可溶性信號分子(autoinducer, Al)來監測群體密度并調控細菌生物功能的信息交流機制。植物病原細菌產生的Al多數為酰基高絲氨酸內酯(AHL)，該分子由一個可變的酰基鏈(ayslside chain)尾部與一個穩定的高絲氨酸內酯(HSL)頭部相連。不同的AHL分子其酰基鏈的長度為4至18個碳。大量研究證實植物病原細菌的QS系統調控細菌在寄主植物上的致病性，破壞細菌的QS系統，可以顯著降低病菌的致病性或使病菌完全喪失致病性。破壞植物病原細菌QS系統的方法有兩種，一種是將Al的合成酶基因敲除，使細菌無法產生Al，導致QS系統完全破壞。另外一種是利用相關外源蛋白(也稱為降解酶)來降解細菌QS信號分子，起到干擾或破壞細菌QS的目的,這種機制稱為群體淬滅(Quorum quenching, QQ)。在現有報道的降解酶中，研究最為透徹的是AiiA蛋白。該蛋白最早分離于Bacillus sp. 24菌株,能夠降解不同碳鏈分子的AHL類信號分子。在前期工作中，我們將外源的ai iA基因克隆到廣宿主載體PBBRI-MCS5，并導入OHll菌株。轉化后的OHll菌株能顯著降解軟腐病菌(Pectobacteriumcarotovorum)產生的AHL信號分子，并顯著降低該病菌在大白菜和馬鈴薯上的致病性，表明基于質粒表達的外源AiiA降解酶有助于實現產酶溶桿菌防治植物細菌病害。然而，含有外源質粒的工程菌株，因為質粒上往往含有抗生素編碼基因，導致這類工程菌株在田間應用存在一定的風險，如抗性基因可能會水平轉移，也可能會破壞土壤或植物根圍的微生物群落組成。針對這種情況，替代的方案是將外源優良基因整合到生防細菌的染色體上，構建出無抗生素標記的工程菌株。無標記工程菌株的構建一般需要兩個條件，一是尋找或克隆一個組成型表達的強啟動子，便于在染色體上高強度啟動外源基因的表達，二是尋找一個合適的整合靶標。因為當外源基因整合到靶基因后，靶基因會被插入突變失活，導致靶基因的功能喪失。因此，我們需要找到一個對產酶溶桿菌生防效果具有負向調控的功能基因來作為外源基因整合的靶標基因。在前期工作中，我們構建了一個新型、有效的啟動子探針，并從OHll菌株中克隆了一個組成型表達的強啟動子PB500。同時，我們又從產酶溶桿菌中克隆了一個色素合成相關基因hmgA(基因登錄號EU717786)。該基因突變后，OHll菌落在LB平板上會產生黑色素，但突變株對水稻紋枯病菌等植物真菌病害的防治效果提高近20%，表明hmgA是一個合適的外源基因整合靶標。
發明內容
本發明將以hmgA為祀標基因，SacB為反向篩選標記,將融合基因PB500_aiiA無標記整合到OHll的染色體上，構建無標記、穩定遺傳，并具有降解AHL類信號分子能力的產酶溶桿菌工程菌株OHl 1PA。工程菌株OHllPA對細菌性軟腐病具有較好的生防效果。 有益效果本發明提供的無標記遺傳工程菌的構建策略可為后續將其他優良的外源基因定向整合到產酶溶桿菌中提供了技術參考。同時，本發明提供的多功能工程菌株OHllPA既能防治植物真菌病害，又具有了防治植物細菌病害的能力，拓寬了產酶溶桿菌的生防范圍，為進一步實現該菌的產業化發酵和田間應用奠定了堅實的基礎。
圖I工程菌株OHllPA的構建示意 2 PB500、ai iA 及 PB500_ai iA 的 PCR 擴增圖3 DNA 片段 hmgA-F、hmgA-R、PB500-aiiA 和 pEX18GM 的電泳檢測圖4重組載體pEX18PAT的酶切驗證圖5質粒pEX18PAT的圖譜圖6疑似工程菌株OHl IPA的抗性和表型圖7疑似工程菌株OHl IPA的PCR驗證圖8葡萄糖對OHllPA黑色素產生的抑制現象圖9菌株OHl IA對信號分子AHLA的降解活性圖10菌株OHllPA對大白菜軟腐病的離體生防效果
具體實施例方式以下通過具體實施對本發明作進一步闡述，但不限制本發明實施例I :含PB500-aiiA的產酶溶桿菌無標記工程菌株的構建I材料和方法I. I試驗材料本試驗所用的大腸桿菌菌株DH5a購置大連寶生物公司(TaKaRa)，SMlO λ pir和DH5a λ pir菌株由南京農業大學生命科學學院朱軍教授惠贈。產酶溶桿菌由發明人分離并保存。載體pE)(18GM由南京農業大學生命科學學院朱軍教授惠贈。質粒pME6863由SwissFederal Institute of Technology的Molina教授惠贈。大腸桿菌菌株的培養使用LB培養基，培養溫度為37°C，液體培養的轉速為225 rpm / min。產酶溶桿菌的培養使用LB培養基，培養溫度為30°C，液體培養的轉速為225rpm / min。抗生素慶大霉素(Gm)、鏈霉素(Sm)、5_溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷(X_gal)均購置南京助研生物公司。I. 2 PB500_aiiA融合片段的構建根據PB500和aiiA序列，設計如下引物PBA-I 5’ -AAGGATCCTGCGAGACAACTTTTTTCCG-3,(下劃緯為 BamHI) ;PBA_2 5’-GAAATAAAGCTTCTTTACTGTCATGGATCGAATATTCCTGGTTTTTC-3’ ；PBA-3 :5’-GAAAAACCAGGAATATTCGATCCATGACAGTAAAGAAGCTTTATTTC-3’ ；PBA_4:5’-AAAAGCTTCTATATATATTCAGGGAACAC-3’(下劃線為Hindlll)。以OHll菌株的基因組DNA為模板，利用引物PBA-I / PBA_2，PCR擴增啟動子PB500 ;以質粒PME6863為模板，利用引物PBA-3 / PBA-4，PCR擴增aiiA基因。之后，將PB500和aiiA的PCR產物按照mol比I : I混合，并以此混合液為模板，利用引 物 PBA-I / PBA-4，通過重疊 PCR 將 PB500 與 aiiA 連接成為 PB500-aiiA。PB500_aiiA 回收純化后進行“TA”克隆，測序驗證序列的正確性。I. 3hmgA-F 和 hmgA-R 的 PCR 擴增根據hmgA 的序列.設計引物EHmgA-1 5, -AAGAATTCCGGCGCGTTCTCGCCGTTCG-3，(下劃線為酶切位點 EcoRI) ；BhmgA-2 5, -AA GGATCCCGGCCCCAGATCCGGCAGCC-3，(下劃線為BamHI) ;HhmgA_3 :5’ 一 AAAAGCTTATCGGTTCCAACGGCCTGGC-3，(下劃線為 HindIII );PhmgA_4 5’ -AACTGCAGCCCGGGGCGAAGCCGCCGGC-3,(下劃線為酶切位占PstI)。以OHll菌株的基因組DNA為模板，利用引物EhmgA-I / BhmgA_2，PCR擴增hmgA基因5’端420bp的DNA片段，命名為HmgA-F ;同樣，以OHl I基因組DNA為模板，利用引物HmgA-I / PhmgA-4，PCR擴增hmgA基因3’端430bp的DNA片段，命名為hmgA-R。I. 4重組載體的pEX18PAT的構建及驗證建立200 μ L的酶切體系。分別使用內切酶EcoRI/BamHI、BamHI / Hindi 11、HindIII / PstI、EcoRI / PstI 對 hmgA-F、PB500_aiiA、HmgA-R 和 pEX18GM 進行雙酶切，回收純化。之后，將純化后的hmgA-F、PB500-aiiA、hmgA-R、pEX18GM在T4 DNA連接酶的作用下于16°C進行連接，反應20h后，轉化大腸桿菌DH5 λ pir感受態細胞，在LA平板(含20 μ g / ml Gm)上篩選轉化子。陽性轉化子的篩選首先使用aiiA的特異性引物(PBAT3 /PBAT4)進行PCR擴增，之后，培養PCR陽性克隆，并提取質粒，用EcoRI / PstI進行雙酶切驗證，觀察hmgA-F、PB500-aiiA、hmgA-R能否同時連接到pEX18GM載體上。最后，攜帶有3個外源插入片段(hmgA-F、PB500-aiiA、hmgA-R)的 pEX18GM 被命名為 pEX18PAT。I. 5無標記工程菌株OHllPA的構建及驗證無標記工程菌株0H11PA的構建過程見圖I。將ρΕΠ8ΡΑΤ電擊轉化SMlO λ pir感受態細胞，挑取陽性轉化子SM / PEX18PAT，將分別處于對數生長期的0H11(0D_=0. 5)與SM / PEX18GMPAT進行兩親接合，在LA平板(100 μ g / mL Sm+200 μ g / mL Gm)上篩選單交換子。選取10個單交換子分別在空白LA培養基上劃線后2天后，再次劃線于含有10%蔗糖的LA(無Nacl)培養基中，培養2-3天后生長出來的單菌落(產可溶性黑色素)初步判定為“hmgA-disruption突變體”即工程菌株0H11PA。用滅菌牙簽將初步判定的工程菌株OHlIPA平行劃線接種于LB平板(100 μ g / mLSm)、LB 平板(100 μ g / mL Sm+200 μ g / mL Gm)，篩選在 LB 平板(100 μ g / mL Sm+200 μ g /mL Gm)中無法生長同時在LB平板(IOOyg / mL Sm)上生長，并在菌落周圍產生黑色暈圈的菌落，將這些菌株活化后，提取DNA，利用aiiA的特異性引物PBAT3 / PBAT4進一步對篩選的疑似突變株進行PCR驗證，將陽性突變株命名為OHl 1PA。2結果顯示通過PCR擴增，如圖2所示，成功獲得了 PB500_aiiA的融合片段(1434bp)、hmgA-F(420bp)和hmgA-R(430bp)。隨后通過酶促連接反應，成功將hmgA-F、hmgA-R和PB500-ai iA克隆到自殺載體PEH8GM中，構建成重組載體pEX18PAT (圖3 ;圖4)。通過接合作用，將pEX18PAT導入0Hll中，在LA平板(IOOyg / mLSm+200 μ g / mL Gm)上篩選產生可溶性黑色素的菌落(即hmgA第一次交換接合子)。將接合子在空白LB上劃線后，重新劃線于10%蔗糖的2YT平板上，在22°C培養2天后，將產生可溶性黑色素的單菌落挑出，驗證對Gm的敏感性。如圖5所示，從含有10%蔗糖的LA平板上生長出來單菌落均對Gm敏感，而且在LA平板上產生可溶性黑色素。提取產可溶性黑色素的菌株的DNA，利用aiiA的特 異性引物PAT-I / PAT-2對疑似雙交換突變株進行驗證，發現所有的疑似突變株均能擴增出一條O. 75kb的特異性條帶(圖6)，以預期相符，表明aiiA已經成功整合到OHll菌株的hmgA基因中，工程菌株OHl IPA構建成功。實施例2 :含PB500_aiiA的產酶溶桿菌無標記工程菌株對細菌性軟腐病的生防應用I材料和方法I. I試驗材料本試驗所用的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)由南京農業大學生命科學學院朱軍教授惠贈。產酶溶桿菌和大白菜軟腐病菌由發明人分離并保存。載體PME6863由 Swiss Federal Institute of Technology 的 Molina 教授惠贈。細菌培養使用 LB 培養基，培養溫度為30°C，液體培養的轉速為225rpm / min。抗生素慶大霉素(Gm)、鏈霉素(Sm)、壯觀霉素(Spe)、四環素(Tc)、5_漠-4-氣-3-卩引噪-β -D-半乳糖昔(X-gal)、SDS>NaC03等化學試劑均購置南京助研生物公司。I. 2 AHL類信號分子的提取和檢測用乙酸乙酯萃取的方法從大白菜軟腐病菌(Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum)中提取AHL類信號分子。將參試細菌進行LB培養(IOOmL)，當細菌培養液濃度達到OD6tltlnm=O. 6時，收集各細菌培養液，離心(12，OOOrpm, IOmin)后收集上清。之后，培養上清用乙酸乙酯萃取兩次，并在旋轉蒸發儀中將萃取液旋轉蒸發，濃縮200倍后于-70°C保存，備用。AHL的定性檢測方法如下在96孔板中加入180 μ L AT培養基(2 μ g/mLTc+100 μ g / mL Spe+100 μ g / mL Gm+300 μ g / mL X-gal)，之后將 20 μ L 107cfu / mL 的超敏感檢測菌株JZAl加入到上述180 μ L AT培養基中，最后加入100 μ L 1%水瓊脂(60°C )，用移液器將培養液均勻混合后，將96孔板放入28°C培養箱培養，10-12h后觀察X-gal的水解結果。如果X-gal水解變藍(即小孔呈藍色)，表明檢測液中存在一定濃度的AHL，顏色越藍，揭示檢測液中AHL的濃度越高；小孔中無藍色，表明檢測液中的AHL被完全降解。AHL的定量檢測采用β -半乳糖苷酶法按I 100的比例將檢測菌株JZAl加入到AT培養基中，分別加入參試菌株的濃縮培養上清(10% )，培養至OD_為O. 2 I. O ;在2mL離心管中加入Z-bufTer，0. 5% SDS, CHCl3及O. 2mL上述培養菌液，充分振蕩。加入顯色底物ONPG，計時至溶液顯黃色，加入IM NaCO3終止反應，計算Miller Units，檢測β-半乳糖苷酶活性。I. 3 AHL類信號分子的降解試驗在5mL液體LB培養基中加入5 μ L濃縮的AHL類信號分子，配成LB-AHL液體培養基。之后，將10 μ L OHll和OHllPA的細菌培養液(OD600nm=O. 6)加入LB-AHL培養液中，過夜培養后，利用AHL類信號分子超敏感檢測菌株JZAl檢測過夜培養中AHL的濃度，通過比較過夜培養液和空白培養液(LB-AHL)中AHL濃度差異(β-半乳糖苷酶的活性)來評價OHl IA菌株對AHL的降解能力。I. 4大白菜軟腐病的離體生防試驗及發病組織中病菌和生防菌的重新分離
用自來水清洗新鮮大白菜的葉片，之后，用70%的酒精進行表面消毒。待葉片表面的酒精揮發后，用滅菌手術刀片將葉片切成10X4cm的小方塊。產酶溶桿菌和軟腐病菌在LB培養液中培養48h后，將菌液濃度調整為IO7 CFU / mL，之后將產酶溶桿菌菌液與軟腐病菌菌液按體積比I : I混合，并在28°C培養箱中放置4h。隨后，用滅菌牙簽在消毒過的葉片表面扎一個2mm深的小孔，將5μ L產酶溶桿菌與軟腐病菌混合菌液接種于小孔中，接種后的葉塊放置在含有無菌濾紙(無菌水濕潤)的培養皿中，并在28°C培養箱中放置12h后，觀察葉塊的發病程度。采用十字交叉法測定病斑的最長直徑和最短直徑，平均值最為有效直徑，利用公式^!※(直徑/ 2)2計算發病面積，并作為發病嚴重度的評價指標。病原真菌或卵菌的平板拮抗活性測定2、結果顯示由于菌株OHllPA在LB-AHLA (LB中含有2% (v / V)信號分子AHLA)中產生可溶性黑色素，使得培養上清變為黑色，這給后續利用JZAl檢測培養液中AHLA的濃度帶來了困難，因為黑色素干擾了小孔中X-gal被水解后藍色的觀察。為了克服這一問題，我們篩選了能抑制黑色素產生的物質。我們發現當培養基含有2%葡萄糖時，OHllPA則不產生黑色素，揭示葡萄糖可以抑制OHlIPA產生黑色素(圖7)。因此，在后續的AHLA降解試驗中，我們在原先的LB-AHLA培養中又額外添加了終濃度為2 %葡萄糖，有效抑制了 OHl IPA產生黑色素。因此，使用LB-AHLA-glucose培養基，并結合AHL超敏感檢測菌株JZAl，可以評價OHl IPA對外源信號分子AHLA的降解效率。如圖8所示，在AHL的定性試驗中，根據每個小孔是否藍色，可以發現菌株OHllPA能顯著降解由A. tumefaciens RlO產生的信號分子AHLA,小孔基本沒有顯藍。在同樣的操作條件下，野生型OHll則無法降解AHLA，導致小孔呈現明顯藍色。為了進一步確定OHllPA對AHLA的降解效率，我們進行了 AHL的定量檢測，如圖9所示，通過測定培養液中半乳糖苷酶的活性，發現在對照培養液(AHLA與LB混合液)中β-半乳糖苷酶的活性(Miller unite) : 1579. I± 111. O。同時，在OHl IPA與AHLA的混合培養液中半乳糖苷酶的活性(Miller unite)為149. 3±7. 8，表明大部分的AHLA已被OHlIPA降解，進一步確認OHlIPA能對AHLA的降解效率。此外，在OHll與AHLA混合培養液中，β-半乳糖苷酶的活性(Miller unite) :1448. 5±34. 7，與對照培養液中β-半乳糖苷酶的活性相似，進一步表明OHll不能降解AHLA。離體試驗表明，菌株OHllPA能顯著降低軟腐病菌在大白菜上的致病性。如圖10所示，接種12h后，在大白菜葉片上，單獨接種軟腐病菌的接種點周圍變得腐爛，腐爛面積達到I. 44±0. 07cm2。同時，OHll與軟腐病菌共同接種的接種點周圍的腐爛面積也達到了
I.51±0. 13cm2，表明OHll不能降低軟腐病菌在大白菜上的致病性。然而，在同樣的操作條件下，OHllPA與軟腐病菌共同接種的接種點周圍腐爛面積最小，僅有O. 38±0. 07cm2，表明OHllPA降低病菌在大白菜上的致病性。
權利要求
1.一株能防治植物細菌病害的產酶溶桿菌無標記工程菌株構建。
2.編碼權利要求I所述的工程菌對細菌性軟腐病菌產生的群體感應信號分子AHL的降解應用。
3.編碼權利要求I所述的工程菌對細菌性軟腐病的生防應用。
全文摘要
本發明涉及一株能防治植物細菌病害的產酶溶桿菌無標記工程菌株構建策略及過程，屬于微生物基因工程領域。本發明提供的產酶溶桿菌無標記工程菌株只是將外源優良基因aiiA定向整合到染色體上，無任何標記基因帶入。該工程菌株能高效破壞植物病原細菌的群體感應系統，顯著降低病原細菌在寄主植物(大白菜)上的致病性，實現對植物細菌病害的生物防治。
文檔編號C12N1/21GK102943061SQ20121049251
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者劉鳳權, 錢國良 申請人:南京農業大學