專利名稱：一種大批量快速分離昆蟲圍食膜的方法
技術領域：
本發明涉及一種昆蟲組織的分離技術，具體涉及一種大量快速地分離昆蟲圍食膜的新方法。
背景技術：
圍食膜(Peritrophic membrane,PM)是昆蟲中腸細胞分泌的一層厚薄均勻的非細胞結構薄膜，由中腸前端一直延伸至后腸。圍食膜主要由蛋白質和幾丁質組成。具有保護中腸上皮細胞，阻止病原物入侵等多種功能，是昆蟲抵御隨食物攝入的病原微生物入侵的第一道天然保護性屏障，凡是能破壞蛋白與幾丁質高度結合的位點都可能成為害蟲防治的靶標位點。所以，近年來對圍食膜幾丁質與蛋白質的組裝機制、病原微生物與圍食膜相互作用的分子機理、避免昆蟲對病原微生物產生抗性等方面的研究已成為學者們普遍關注的新執占。蛋白質是昆蟲圍食膜的主要成分，約占圍食膜的35%_55%。其中糖蛋白能增加圍食膜的致密性、堅韌性及半滲透性，蛋白多糖形成圍食膜其余部分，它的多聚糖側鏈形成高度伸展的纏繞結構。蛋白質對于維持圍食膜的致密結構至關重要，一般研究昆蟲圍食膜都是因為分離圍食膜很困難，而且獲得的量很少，無法滿足圍食膜蛋白所需的量，而且方法很費時費力，通常是將圍食膜分離出來后，用充滿濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水注射器反復清洗掉里面的食物，獲得一條昆蟲圍食膜需約10分鐘時間。因此，研究昆蟲圍食膜蛋白對于以圍食膜為靶標的昆蟲 生物防治具有重要的指導價值。目前，關于圍食膜中蛋白研究比較少，大部分蛋白結構和功能還不清楚。目前研究圍食膜蛋白種類的基本方法都是采用單向SDS-PAGE或雙向電泳技術獲得的。在這些研究中，關鍵的問題就是要獲得和快速分離大批量的圍食膜組織才能保證后續試驗研究順利進行。然而，昆蟲圍食膜非常薄，而且一頭昆蟲的圍食膜要把它從中腸中解剖和分離出來也需要相當熟練和有耐心才行，分離出來的圍食膜組織里面還有食物，如何在保證圍食膜蛋白不被降解的情況下，快速清洗掉里面的食物，又是一個技術難關，并且一頭像棉鈴蟲大小的五齡幼蟲圍食膜分離后僅僅才有53. 45 μ g干重，工作量相當大。因此，迫切需要一種能夠快速而大批量地分離昆蟲圍食膜的新方法，以便研究昆蟲圍食膜的功能和作用。
發明內容
鑒于以上研究背景和存在問題，本發明的目的在于，提供一種大批量快速分離昆蟲圍食膜的方法，該方法能夠快速從昆蟲中腸中分離圍食膜組織，并快速清洗掉里面的食物殘渣，得到大量純凈的圍食膜組織。為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案—種大批量快速分離昆蟲圍食膜的方法，其特征在于，按照下列步驟進行步驟一，取昆蟲幼蟲標本100頭 200頭，將放在冰浴上冷卻；步驟二，取與昆蟲幼蟲標本數量相對應2mL的EP管，每管中加入2mL在(TC下提前冷卻的濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水，將所有裝有生理鹽水的EP管也放在冰浴上冷卻；步驟三，依次取昆蟲幼蟲標本，用解剖針將其固定在塑料泡沫板上，用剪刀沿昆蟲幼蟲的腹中線剪開體壁，暴露出整個消化道組織，用手術刀片從前腸前端切斷消化道，再切斷后腸后端的消化道，然后從后腸后端用鑷子分離出整個含有食物的圍食膜組織，立即將其放入EP管中，每EP管放一條圍食膜，繼續放在冰浴上冷卻，直至所有的EP管全部裝有昆蟲幼蟲的圍食膜組織；步驟四，將步驟三取出的全部含有圍食膜的EP管，在冰浴上放到96孔塑料板上，再將另一 96孔塑料板壓在上面，用橡皮筋將兩個塑料板緊固，然后，將緊固后塑料板放在可控溫搖床搖床中，將可控溫搖床的溫度設置為0°C，轉速為200轉/分鐘；步驟五，開啟可控溫搖床搖床15分鐘，將EP管中的圍食膜組織中的食物清洗出來；步驟六，取IOOmL的燒杯2 3個，加入在0°C下提前冷卻的濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水IOOmL,放在冰浴上，將上述步驟五中每個EP管中的圍食膜用鑷子夾出來，立即依次逐一放在燒杯中清洗2-3次，直到圍食膜透明漂浮，無任何食物附著為止；步驟七，將分離和清洗干凈的圍食膜收集，放在干凈的EP管中，并立即放在液氮中快速冷卻后，置-80 V冰箱保存。本發明的大批量快速分離昆蟲圍食膜的方法，比一般的方法效率約提高了 16倍，為昆蟲圍食膜中蛋白的后續研究提供了方便。
具體實施例方式為了清楚的理解本發明，以下結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。本實施例以棉 鈴蟲圍食膜的大批量快速分離為例，需要說明的是，本發明不限于該實施例。在以下的實施例中，棉鈴幼蟲標本的制作是選擇健康5齡棉鈴幼蟲，在0°C條件下快速冷凍(15分鐘或15分鐘以上)所得到。具體實施步驟如下1、取5齡棉鈴幼蟲標本100頭 200頭，將放在冰浴上冷卻；2、取與5齡棉鈴幼蟲標本數量相對應2mL的EP管，每個EP管中加入2mL在0°C下提前冷卻好的濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水，將這些裝有生理鹽水的EP管也放在冰浴上冷卻；3、依次取5齡棉鈴幼蟲標本，用解剖針將其固定在塑料泡沫板上，用剪刀沿5齡棉鈴幼蟲的腹中線剪開體壁，暴露出整個消化道組織，用手術刀片從前腸前端切斷其消化道，再切斷后腸后端的消化道，然后從后腸的后端用鑷子拉出整個含有食物的圍食膜組織，立即將其放入上面的EP管中，每EP管放一條圍食膜，繼續放在冰浴上冷卻，直至所有的EP管全部裝有5齡棉鈴幼蟲的圍食膜組織。4、將可控溫搖床設置在0°C，轉速設置在200轉/分鐘，等待后續操作使用。5、將步驟3中解剖取出的全部含有圍食膜的EP管，在冰浴上放到96孔塑料板上，再將另一 96孔塑料板壓在上面，用橡皮筋將兩個96孔塑料板緊固，然后，將96孔塑料板放在上面已經設好的可控溫搖床中，打開可控溫搖床15分鐘，就可以將EP管中的圍食膜組織中的食物清洗出來。
6、取IOOmL的燒杯2-3個，加入在(TC下提前冷卻好的濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水IOOmL,放在冰浴上，將上述步驟5中每個EP管中的圍食膜用鑷子夾出來，立即逐一放在燒杯中清洗2-3次，直到圍食膜透明漂浮，無任何食物附著為止。7、將分離和清洗干凈的圍食膜收集，放在干凈的EP管中，每個EP管中放的圍食膜的數量根據試驗不同而不同，一般每10條圍食膜放在一個EP管中，并立即放在液氮中快速冷卻后，置_80° C冰箱保存備用。采用本發明的方法，可在1-2小時內獲得100-200條昆蟲的圍食膜，其效率是一般方法的16倍以上。
權利要求
1.一種大批量快速分離昆蟲圍食膜的方法，其特征在于，按照下列步驟進行 步驟一，取昆蟲幼蟲標本100頭 200頭，將放在冰浴上冷卻； 步驟二，取與昆蟲幼蟲標本數量相對應2mL的EP管，每管中加入2mL在(TC下提前冷卻的濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水，將所有裝有生理鹽水的EP管也放在冰浴上冷卻； 步驟三，依次取昆蟲幼蟲標本，用解剖針將其固定在塑料泡沫板上，用剪刀沿昆蟲幼蟲的腹中線剪開體壁，暴露出整個消化道組織，用手術刀片從前腸前端切斷消化道，再切斷后腸后端的消化道，然后從后腸后端用鑷子分離出整個含有食物的圍食膜組織，立即將其放入EP管中，每EP管放一條圍食膜，繼續放在冰浴上冷卻，直至所有的EP管全部裝有昆蟲幼蟲的圍食膜組織； 步驟四，將步驟三取出的全部含有圍食膜的EP管，在冰浴上放到96孔塑料板上，再將另一 96孔塑料板壓在上面，用橡皮筋將兩個塑料板緊固，然后，將緊固后塑料板放在可控溫搖床搖床中，將可控溫搖床的溫度設置為0°C，轉速為200轉/分鐘； 步驟五，開啟可控溫搖床搖床15分鐘，將EP管中的圍食膜組織中的食物清洗出來；步驟六，取IOOmL的燒杯2 3個，加入在0°C下提前冷卻的濃度為O. 7%的NaCI生理鹽水IOOmL,放在冰浴上，將上述步驟五中每個EP管中的圍食膜用鑷子夾出來，立即依次逐一放在燒杯中清洗2-3次，直到圍食膜透明漂浮，無任何食物附著為止； 步驟七，將分離和清洗干凈的圍食膜收集，放在干凈的EP管中，并立即放在液氮中快速冷卻后，置_80°C冰箱保存。
全文摘要
本發明公開了一種大批量快速分離昆蟲圍食膜的方法，該方法可在短時間內從昆蟲中腸中分離圍食膜組織，然后再快速清洗掉里面的食物殘渣，得到大量純凈的圍食膜組織，比一般的方法效率提高了16倍，為昆蟲圍食膜中蛋白的后續研究提供了方便。
文檔編號C12N5/07GK103060261SQ20121059217
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月29日 優先權日2012年12月29日
發明者梁革梅, 李怡萍, 郭予元, 魏紀珍 申請人:中國農業科學院植物保護研究所, 西北農林科技大學