專利名稱：一種熱穩定性提高的淀粉酶突變體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種熱穩定性提高的淀粉酶突變體及其方法，具體涉及一種熱穩定性提高的堿性淀粉酶突變體及其制備方法。
背景技術：
淀粉酶是最早用于工業生產的酶制劑，是迄今用途最廣、產量最大的酶制劑產品之一。堿性淀粉酶在高PH環境下具有穩定性和活性，因而在工業生產中有較高的應用價值，現已用于紡織、洗滌劑、制革、造紙、醫藥、食品等行業。但來源于野生菌株未經改造的堿性淀粉酶在熱穩定性等方面存在一定局限性，限制了其應用范圍。因此基于已得到的堿性淀粉酶在大腸中的表達平臺，利用定點突變，對堿性淀粉酶進行分子改造，以期得到酶學性質更適合工業應用的堿性淀粉酶。·
發明內容
本發明提供了一種熱穩定性提高的淀粉酶突變體，其特征在于，對淀粉酶結構域A、B、C內的一個或多個氨基酸進行替換，提高了淀粉酶的熱穩定性。所述淀粉酶突變體是以SEQ ID NO.1為出發序列，將第58位脯氨酸替換成丙氨酸、第199位組氨酸替換成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替換成纈氨酸、第292位天冬酰胺替換成色氨酸、第467位脯氨酸替換成纈氨酸或其任意組合得到的突變體。能表達生產權利要求1所述淀粉酶突變體的載體也屬于本專利要求保護的范圍。能表達生產權利要求1所述淀粉酶突變體的基因工程菌或轉基因細胞系也屬于本專利要求保護的范圍。本發明還提供一種制備所述淀粉酶突變體的方法，是將淀粉酶催化部位一個或多個氨基酸通過PCR或化學全合成的方法進行替換。具體而言，是以SEQ ID NO.1為出發序列，將第58位脯氨酸替換成丙氨酸、第199位組氨酸替換成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替換成纈氨酸、第292位天冬酰胺替換成色氨酸、第467位脯氨酸替換成纈氨酸或其任意組合。所述制備所述淀粉酶突變體的方法，具體步驟如下I)根據嗜堿芽孢桿菌淀粉酶序列SEQ ID NO.1所示，采用化學全合成的方法全合成后克隆到質粒pET-22b(+)中，構建重組質粒pAmyQ (
圖1)；2)利用Swiss-model軟件對源自嗜堿芽孢桿菌淀粉酶(SEQ ID NO.1)進行模擬，獲得淀粉酶空間結構；3)通過對淀粉酶的氨基酸序列以及空間結構進行分析，確定要突變的氨基酸位占.4)設計突變引物，對淀粉酶基因序列進行定點突變，將所述位點的氨基酸進行替換，獲得含有突變淀粉酶序列的重組載體；5)將突變后重組載體轉化大腸桿菌BL21，誘導表達，獲得淀粉酶突變體。
表I淀粉酶突變引物序列
權利要求
1.一種熱穩定提高的淀粉酶突變體，其特征在于以SEQ ID NO.1所示序列為出發序列， 將第58位脯氨酸替換成丙氨酸、第199位組氨酸替換成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替換成纈氨酸、第292位天冬酰胺替換成色氨酸、第467位脯氨酸替換成纈氨酸或其任意組合得到的突變體。
2.權利要求1所述的淀粉酶突變體，其特征在于第216位谷氨酰胺替換成纈氨酸。
3.權利要求2所述的淀粉酶突變體，其特征在于還將第467位脯氨酸替換成纈氨酸。
4.權利要求1所述的淀粉酶突變體，其特征在于第199位組氨酸替換成亮氨酸、第216 位谷氨酰胺替換成纈氨酸、第467位脯氨酸替換成纈氨酸。
5.能表達生產權利要求1所述淀粉酶突變體的載體。
6.能表達生產權利要求1所述淀粉酶突變體的基因工程菌或轉基因細胞系。
7.權利要求1所述淀粉酶突變體的制備方法，其特征在于，將淀粉酶活性位點內的一個或多個氨基酸通過PCR或化學全合成的方法進行替換。
8.權利要求7所述方法，其特征在于，以SEQID NO.1為出發序列，通過PCR或化學全合成的方法，將第58位脯氨酸替換成丙氨酸、第199位組氨酸替換成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替換成纈氨酸、第292位天冬酰胺替換成色氨酸、第467位脯氨酸替換成纈氨酸或其任意組合。
9.權利要求7或8所述方法，其特征在于，具體步驟如下1)根據嗜堿芽孢桿菌淀粉酶序列SEQID NO.1所示，采用化學全合成的方法全合成后克隆到質粒pET-22b (+)中，構建重組質粒；2)利用Swiss-model軟件對源自嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)淀粉酶進行模擬，獲得淀粉酶空間結構；3)通過對淀粉酶的序列以及空間結構進行分析，確定要突變的氨基酸位點；4)設計突變引物，對淀粉酶基因序列進行定點突變，將所述位點的氨基酸進行替換，獲得含有突變淀粉酶序列的重組載體；5)將突變后重組載體轉化大腸桿菌BL21，誘導表達，獲得淀粉酶突變體。
10.權利要求1-4任一所述淀粉酶突變體在紡織、洗滌劑、制革、造紙、醫藥、食品領域的應用。
全文摘要
本發明公布了一種熱穩定性提高的淀粉酶突變體及其應用，屬于遺傳工程領域。本發明以嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)JN21(CCTCC NO:M 2011231)淀粉酶為母本，采用分子生物學技術對嗜堿芽孢桿菌淀粉酶序列進行定點突變。在此改造條件下，嗜堿芽孢桿菌淀粉酶在50°C的半衰期由對照(突變前)例的15.3min提高到43.8min。利用此策略可以顯著提高淀粉酶的熱穩定性，為其工業化生產提供了基礎。此策略對其它酶的性質改造具有重要的指導意義。
文檔編號C12N15/10GK102994474SQ20121059320
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者陳堅, 堵國成, 劉龍, 李江華, 楊海泉, 鄧壯梅 申請人:江南大學