一種α-淀粉酶基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程和酶工程技術領域，具體設及一種a-淀粉酶，編碼該酶的 基因，含有其編碼基因的重組載體、基因工程菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 淀粉根據結構的差異可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種。二者都是D-啦喃葡萄糖 通過a -1，4巧鍵相連而成；與直鏈淀粉不同的是，支鏈淀粉每隔20~25個葡萄糖單元，就有 一個W a-1,6巧鍵相連的支鏈。在淀粉的水解途徑中，需要a-淀粉酶、P-淀粉酶和極限 胡精酶等的共同作用。
[0003] a-淀粉酶是淀粉水解的起始酶，可隨機降解直鏈淀粉和支鏈淀粉非末端的 a-1,4糖巧鍵，稱為內切淀粉酶；它作用于直鏈淀粉的產物是麥芽糖和麥芽=糖，作用于 支鏈淀粉的產物中除葡萄糖、麥芽糖外，還有一系列具有a-1,6糖巧鍵的低聚糖。P-淀粉 酶也作用于a -1，4糖巧鍵，但它的作用是從非還原性末端開始，按兩個葡萄糖單位降解直 鏈淀粉，被稱為外切淀粉酶，它作用于直鏈淀粉的產物是麥芽糖，作用于支鏈淀粉時，只能 水解外圍碳鏈的a -1，4糖巧鍵，而不能超越分支點的a -1，6糖巧鍵去水解分支點內側的 a -1，4糖巧鍵，所W它對支鏈淀粉的水解是不完全的，當作用至a -1，4糖巧鍵時生成極限 糊精，需要極限胡精酶的進一步作用。極限糊精酶的作用對象是a-1,6糖巧鍵，可將支鏈 淀粉轉變為直鏈形式后再被a -淀粉酶、P -淀粉酶水解而且它要求a -1，6糖巧鍵的兩側 至少各有一個a-1,4鍵連接的D-葡萄糖殘基。極限糊精酶對a-1,6糖巧鍵起專一性作 用，但它不能直接降解淀粉粒，只有當a -淀粉酶作用后才起作用。
[0004]目前淀粉酶在食品、造紙、紡織、釀造發酵業、醫藥行業及煙草行業等都發揮著重 要作用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種a -淀粉酶，編碼該酶的基 因，含有其編碼基因的重組載體、基因工程菌及其應用。
[0006]本發明采用的技術方案如下： 本發明旨在提供一種從芽抱桿菌《acinus SP. 65#中分離得到的a-淀粉酶基因，該 基因核巧酸序列或核巧酸序列的片段如SEQ ID NO. 2所示，或與SEQ ID NO. 2互補的核巧 酸序列，該基因序列長度為1980bp (堿基)。
[0007]本發明的核巧酸序列是DNA形式的，包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA，可 W是單鏈的或是雙鏈的。由于核巧酸序列的特殊性，任何與SEQ ID NO. 2所示的核巧酸序 列具有80% W上同源性且具有相同功能的多核巧酸變體，均在本發明的保護范圍之內。所 述多核巧酸變體是指一種具有一個或多個核巧酸改變的多核巧酸序列，可W使用本領域所 熟知的取代、缺失或插入變異來獲得。
[0008] 本發明中的a -淀粉酶基因編碼的氨基酸序列是具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸 殘基序列的多膚或蛋白質。由于氨基酸序列的特殊性，只要是含有SEQ ID NO. 1所示氨基 酸序列的多膚片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物與SEQ ID NO. 1所示 的氨基酸殘基序列具有90% W上同源性且具有相同活性的蛋白質，均在本發明的保護范圍 之內。運些方法包括氨基酸序列中氨基酸殘基的缺失、插入、化學修飾或替換，所述蛋白可 W是重組蛋白、天然蛋白或合成蛋白。
[0009] 本發明的另一目的是提供一種含有a-淀粉酶基因的重組表達載體，是將SEQ ID NO. 2所示基因直接與不同表達載體連接所構建的重組載體。
[0010] 本發明中，編碼a-淀粉酶的多核巧酸序列可W插入到載體中，W構成含有本發 明所述的重組載體。載體是指本領域所熟知的質粒、病毒或其他載體，建議優選祀T載體系 列及其他原核表達載體。可用本領域技術人員熟知的方法來構建含編碼a-淀粉酶的核巧 酸序列和合適的轉錄/翻譯調控元件的表達載體。運些方法包括體外重組DNA技術、DNA 合成技術、體內重組技術等。所述編碼淀粉酶的核巧酸序列可W有效連接到表達載體中的 適當啟動子上，W指導mRNA的合成。運些啟動子的代表性例子有：大腸桿菌的知C或化口 啟動子；A隧菌體的化啟動子；真核啟動子包括CMV早期啟動子、HSV胸巧激酶啟動子、早 期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真 核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終 止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉錄得到增強。增強子是 DNA表達的順式作用因子，通常大約有10-300bp，作用于啟動子W增強基因的轉錄，如腺病 毒增強子。
[0011] 本發明中，編碼a-淀粉酶的多核巧酸或含有該多核巧酸的重組載體可W用本領 域的技術人員熟知的方法轉化或者導入到宿主細胞中，該細胞可W是細菌細胞、真菌細胞、 植物細胞或動物細胞，或運些宿主細胞的后代，代表性例子有：大腸桿菌；真菌細胞或酵 母準物細胞如油菜、煙草、大豆；昆蟲細胞如果蛹S2或S巧；動物細胞如C冊、COS或Bowes 黑色素瘤細胞等。
[0012] 本發明還設及所述編碼基因在制備重組a-淀粉酶中的應用，通過常規的重組 DNA技術，利用本發明的多核巧酸序列可W構建表達或生產重組的a -淀粉酶。一般來說可 W通過W下步驟實現：構建重組載體，轉化入宿主細胞構建重組細胞，在合適的培養基中培 養宿主細胞，從培養基或細胞中分析、純化蛋白質。
[0013] 本發明與現有技術相比，其有益效果為： 本發明利用大腸桿菌表達系統構建了 a -淀粉酶的工程菌，與該產酶菌株本身相比， 能更快速、大量的表達出目的蛋白。而且所需培養基及培養條件簡單，工藝簡單，周期短， 在工業應用中可W大大降低生產成本。另外在構建重組載體時所用載體末端帶有組氨酸 化is)標簽，可與儀柱特異性結合，便于純化。與產酶菌株本身相比，該工程菌所產a -淀粉 酶酶量更大、純度更高、酶活性質更高、更穩定，能夠更有效的應用于煙葉工業，提高煙葉質 量。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發明構建的大腸桿菌化21 〇)E3)表達載體65#-pET-30a; 圖2為本發明中重組質粒目的片段的菌落PCR驗證圖，圖中M為大小2000bp的Maker ; 泳道1、2均為目的片段擴增產物(平行重復)。
[0015] 圖3為本發明中重組質粒的單、雙酶切圖譜，圖中：M是Marker;泳道1是重組質粒 采用限制酶化'nd III的單酶切產物；泳道2是重組質粒雙酶切結果；泳道3是實施例1中擴 增得到的片段。
[0016] 圖4是本發明SDS-PAGE檢測誘導效果示意圖，圖中M是Marker，！是未誘導的表 達蛋白；2是誘導后表達的目的蛋白。箭頭指示即為目的蛋白條帶。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。
[0018] 本領域技術人員將會理解，下列實施例