一種α-淀粉酶Amy16及其基因和應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及淀粉酶，尤其是涉及分離自太平洋火色桿菌（Flammeovirga Pacifica) H2具有熱穩定性和強堿耐受性的一種α -淀粉酶Amyl6及其基因和應用。
【背景技術】
[0002] 淀粉酶是一類能夠水解淀粉產生糊精以及更小的多糖單位或單糖的酶類總稱。根 據作用方式的不同，淀粉酶可以分為α -淀粉酶和β -淀粉酶。α -淀粉酶（EC. 3. 2. I. 1) 屬于糖苷水解酶13家族，能夠通過隨機酶切α-1，4-糖苷鍵來降解長鏈淀粉。基于序列和 底物特異性的不同，還可以將α -淀粉酶進一步地分為35個α -淀粉酶亞家族。α -淀粉 酶廣泛分布于動物、植物和微生物中，但目前應用于工業的α -淀粉酶大多來自于微生物。
[0003] 對α -淀粉酶的研宄已經有半個多世紀，目前，α -淀粉酶已是最重要的工業酶制 劑之一，已被廣泛應用在食品、洗滌劑、發酵、紡織、造紙和制藥等諸多行業。α -淀粉酶的 一個重要工業應用是在食品加工行業中被用來處理降解淀粉類物質。目前在工業上大量使 用的α-淀粉酶主要來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)、角軍淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)、黑曲霉（Aspergillus niger)和米曲霉（Aspergillus oryzae)。這些酶大多具有耐高溫甚至耐超高溫的特性， 它們的應用可以簡化淀粉加工工藝，降低加工成本；另一方面，高溫發酵罐的高生產成本 和設備、發酵技術等瓶頸也嚴重限制了高溫α-淀粉酶的大規模發酵以及在淀粉加工行業 的進一步應用（Van Der Maarel, Μ. J.，Β. Van Der Veen, et al. (2〇〇2) · "Properties and applications of starch-converting enzymes of the a -amylase family. "Tournal of Biotechnology 94(2) : 137-155)。因此近年來，中溫淀粉酶也受到了越來越多的關注。雖 然我國上世紀70年代已有了 α -淀粉酶工業化生產，相繼開發出多種中溫淀粉酶，但大部 分淀粉酶的酶學性質仍無法完全滿足現代工業的需求。
[0004] 中國專利CN 102925420Β公開一種α淀粉酶及表達α淀粉酶的重組菌株，所述 的α淀粉酶的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。用于表達 α淀粉酶的黑曲霉P15,其保藏編號為CGMCC No. 6434。該發明所得到的重組菌種能夠表達 棒曲霉α淀粉酶AclaP15,其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉 自身表達的淀粉酶的酶活力。同時，所得重組α淀粉酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得， 擴大了 AclaP15的應用領域。
[0005] 中國專利CN 102827816B公開一種α -淀粉酶及其應用，所述的α -淀粉酶的核 苷酸序列為SEQ ID NO :2,氨基酸序列為SEQ ID NO :1。該發明篩選出的α-淀粉酶在淀粉 水解為麥芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的過程中發揮了十分重要的作用，可以用來生產高 麥芽糖漿、作為添加劑用于焙烤制品如面包的生產，以及在啤酒、黃酒和生料酒精行業等行 業均有不同程度的應用，具有工業生產應用價值。而且篩選出的α-淀粉酶可以用來轉化 工程菌，從而獲得具有表達α-淀粉酶的重組菌。
【發明內容】
[0006] 本發明的第一目的是提供一種能夠應用的具有熱穩定和堿耐受性強等特性的新 型α -淀粉酶Amy 16。
[0007] 本發明的第二目的是提供編碼α -淀粉酶的基因 amyl6。
[0008] 本發明的第三目的是提供包含基因 amyl6的重組載體。
[0009] 本發明的第四目的是提供包含基因 amyl6的重組菌株。
[0010] 本發明的第五目的是提供α -淀粉酶Amyl6的制備方法。
[0011] 本發明的第六目的是提供α -淀粉酶Amyl6的應用。
[0012] 所述α -淀粉酶Amy 16分離自太平洋火色桿菌H2 (Flammeovirga Pacifica) H2,該菌株已于2012年6月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC N0:M2012229,地址為中國.武漢.武漢大學，郵編430072。
[0013] 所述α -淀粉酶Amyl6的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，SEQ ID NO. 1如下：
[0014] I MEDNESSIPE HEPKANMELQ VTTHDGAPFN KNESSNKRYS GSPGGPVMMQ AFYWDVPAGG 61 TWNTVKGKL NNWSNQGIGS IWLPPASKAQ NGPFSMGYDP MDYFDFGDYN QMGSKETRFG 121 SGTELRSLVG EAHNQNMEVY ADIVINHNSG GQLEANPYTG TDTffTKFNPA SGKFNRTYND 181 FHPNLDANND EGVFGGFPDL SHKKSYVQDW LWKKSNSVGK YYKNDVGFDG WRFDYVKGFG 241 AWVVKDWVNN VGGFAVGELff DGNASTLKW VDNTDRKSSA FDFAAYYAMD RAFDGNNLNE 301 LNGDMLWKKD SQRAVTFVAN HDTDEIWRKN LAYAYILTHE GYPCIFYRDY EDWLDKSMMN 361 NLLffIHKSYA TGNTSILHVD NDEYIARRNG YNGNPGLVVY INNSDNWKER WVPTNWSNKK 421 IKDYTGHSOT EPfTQGGTW KIQCPPRSYS IffTLK
[0015] α-淀粉酶基因編碼455個氨基酸，該酶基因表達的Amyl6蛋白分子量約為 52kDa。本發明的淀粉酶Amyl6同時具有較好的熱穩定性、中溫條件下在中性和堿性范圍內 均具有高活性等特征。本發明篩選到的Amyl6最適溫度為50°C，在60°C下仍具有60 %的 活力，且在60 °C下孵育20min后保有80 %的起始活力，40min之后仍保有65 %的起始活力， 表明本發明的淀粉酶Amyl6具有良好的熱穩定性。Amyl6的最適pH為6. 5,在pH 5. 5?9 之間的范圍內維持50%以上的酶活性。此外α-淀粉酶Amyl6在pH 6,7,8條件下孵育Ih 活力基本保持不變，在pH 9條件下孵育Ih保有70%的起始活力，在pH 10條件下孵育Ih 后仍保有40%的起始活力，表明了該酶具有較強的堿耐受性。由于本發明的淀粉酶具有良 好的熱穩定性和堿耐受性，且可有效地與糖化酶協同作用降解淀粉產生葡萄糖，因此可以 廣泛地用于食品加工、飼料、輕工等領域，具有良好的工業應用前景。
[0016] 編碼α -淀粉酶Amyl6的基因 amyl6的基因序列如SEQ ID NO. 2所示，SEQ ID NO. 2如下：
[0017] I ATGGAGGACA ATGAGAGTTC TATTCCTGAA CATGAGCCAA AAGCCAATAT GGAGTTGCAA 61 GTAACCACTC ATGATGGTGC TCCTTTTAAT AAGAATGAAT CTTCTAATAA AAGATACTCA 121 GGTAGTCCGG GAGGACCTGT GATGATGCAG GCATTTTACT GGGACGTTCC TGCGGGGGGT 181 ACTTGGTGGA ATACCGTGM AGGAAMTTG AATAATTGGA GTAATCAAGG AATTGGATCC 241 ATTTGGTTAC CTCCTGCTTC AAAAGCTCAA AATGGACCTT TCTCTATGGG GTATGACCCA 301 ATGGATTATT TTGATTTTGG TGATTATAAC CAAATGGGTT CAAAAGAAAC AAGGTTTGGA 361 TCTGGTACAG AATTAAGATC TCTTGTTGGG GAAGCACACA ATCAAAATAT GGAAGTGTAT 421 GCTGATATAG TGATCAACCA TAATAGTGGT GGACAACTAG AAGCAAACCC TTATACAGGT 481 ACAGATACAT GGACAAAGTT TAATCCGGCT TCGGGTAAGT TTAATAGAAC ATATAATGAT 541 TTCCACCCTA ACCTTGATGC AAATAATGAT GAAGGTGTTT TTGGAGGTTT TCCAGACTTA 601 AGCCATAAAA AAAGTTATGT GCAAGATTGG TTATGGAAAA AAAGTAACTC TGTAGGAAAA 661 TACTATAAAA ATGATGTCGG TTTTGATGGA TGGAGATTTG ATTACGTGAA AGGCTTTGGT 721 GCATGGGTGG TCAAAGATTG GGTCAATAAT GTAGGTGGAT TTGCTGTAGG TGAATTATGG 781 GACGGTAATG CCAGCACCTT AAAGTGGTGG