用于裂解細胞的方法
【專利摘要】本發明涉及用于裂解細胞尤其是細菌細胞和分離核酸的方法。將樣品用包含與水不能混溶的至少一種液體的裂解溶液處理且加熱。然后將混合物冷卻并且加入水，使得在冷卻后生成兩相系統。核酸可以在水相中找到。
【專利說明】用于裂解細胞的方法
[0001]本發明涉及用于裂解細胞尤其是細菌細胞和分離核酸的方法。將樣品用包含與水不能混溶的至少一種液體的裂解溶液處理且加熱。然后將混合物冷卻并且加入水，使得在冷卻后生成兩相系統。核酸可以在水相中找到。
[0002]發明背景
核酸例如DNA廣泛用于分子生物學領域中用于研究和臨床分析。用于分析DNA的常見方法是DNA印跡、通過諸如聚合酶鏈反應(PCR)的方法擴增、和測序。使用這些方法，測定DNA序列中的差異，以幫助基因鑒定、群體篩選、病原體鑒定和診斷測試。所有這些分析都需要純化的DNA樣品作為一致和有效結果的基礎。
[0003]核酸分離步驟一般在核酸的分析和體外操作前，以便使核酸不含不需要的污染物，所述污染物可以干擾后續處理程序。對于研究和診斷分子生物學的絕大多數程序，需要提取的核酸作為第一個步驟。在一般的DNA提取方案中，收獲且裂解含有目的核酸的細胞。
[0004]細胞裂解是在用基于核酸的方法例如PCR和克隆技術進一步處理前，通過破壞細胞膜從細胞中釋放材料的過程，并且特別是從細胞中提取細胞內材料以分離DNA或RNA的過程。
[0005]通過細胞破裂的細胞裂解方法可以分類成機械方法和非機械方法。
[0006]機械方法包括超聲破碎、使用勻漿器的破壞、使用例如弗氏壓碎器等的擠壓、減壓、粉碎等。非機械方法包括化 學方法、熱方法、酶促方法等。
[0007]其為非機械方法的化學方法使用例如酸、堿、去污劑、溶劑、離液試劑等。尤其地，使用去污劑的化學方法被廣泛使用。去污劑破壞脂質雙膜以釋放細胞內容物且裂解膜蛋白質。去污劑最常用于裂解動物細胞。大多數去污劑使蛋白質變性。然而，用于細胞裂解的試劑是分開添加的，并且因此需要去除試劑的后續過程。可以發生PCR抑制，并且該過程花費長時間。
[0008]酶促方法使用溶菌酶、蛋白酶等。
[0009]熱方法包括凍融、加熱、滲透沖擊、電沖擊等。例如，細胞裂解通過使細胞與熱物體例如熱板接觸或通過重復冷凍至-70°C和解凍至室溫的循環來實現。
[0010]在US 2006/0141556中，通過將微波輻射到樣品上升高樣品的溫度來執行細胞裂解。蒸氣壓中的增加通過將兩性離子化合物或離子液體加入樣品得到預防。
[0011]仍存在快速和有效裂解方法的需要。
[0012]發明概沭
已發現細胞尤其是細菌細胞可以通過下述有效裂解:向樣品中加入包含水不混溶的液體的裂解溶液，加熱混合物且在冷卻后加入水或含水緩沖液以生成兩相系統。核酸可在水相中找到，并且可直接轉移至進一步的下游操作如PCR。
[0013]因此，本發明涉及通過下述用于裂解細胞的方法
a)提供包含細胞的樣品
b )向樣品中加入至少包含水不混溶的液體的裂解溶液
c)將步驟b)中獲得的混合物加熱至高于80°C的溫度d)在步驟c)中的溫度高于100°C的情況下，將樣品冷卻至低于100°C的溫度
e)將水或含水緩沖溶液加入混合物中，從而生成水不混溶的液相和水相。
[0014]在優選實施方案中，細胞是細菌細胞。
[0015]在優選實施方案中，將混合物加熱至100 - 150°C。
[0016]在優選實施方案中，在步驟d)中，將樣品冷卻至20 - 40°C。
[0017]在優選實施方案中，在步驟b)中加入的裂解溶液包含至少一種油或至少一種離子液體。在非常優選的實施方案中，它包含至少一種離子液體。
[0018]在優選實施方案中，在步驟b)中加入的裂解溶液包含至少一種基于雙(三氟甲基磺酰基)酰亞胺[Ntf2]的離子液體。這意指離子液體的陰離子是雙(三氟甲基磺酰基)酰亞胺[Ntf2]。
[0019]在優選實施方案中，在步驟b)中加入的裂解溶液包含三己基(十四烷基)鱗三(五氟乙基)三氟磷酸酯[Ttp] [Fap]和/或1-丁基-1-甲基吡咯烷雙(三氟甲基磺酰基)酰亞胺[bmpyrr] [Ntf2]。
[0020]在對于革蘭氏陽性細胞尤其優選的一個實施方案中，在步驟bl)中加入裂解溶液前，使樣品與至少一種基于N，N-二甲基乙醇銨[DMAE]的離子液體預溫育。這意指離子液體的陽離子是N，N- 二甲基乙醇銨[DMAE]。
[0021]在一個實施方案中，在步驟e)后，使所得到的混合物與蛋白酶溫育。
[0022]在一個實施方案中，在步驟e )和與蛋白酶的任選溫育后，通過PCR方法特別是通過實時PCR、電泳(瓊脂糖或聚丙烯酰胺)或克隆技術如連接或限制性酶消化，直接分析水相中的核酸。
[0023]本發明還涉及包含具有水不混溶的液體的一個容器和具有蛋白酶的一個容器的試劑盒。
[0024]發明詳沭
如本文使用的術語“核酸”指本領域技術人員已知的任何類型的DNA或RNA。例子是基因組DNA、信使RNA、質粒DNA。
[0025]如本文使用的術語“緩沖液”指水溶液或組合物，當酸或堿加入該溶液或組合物中時，所述水溶液或組合物抵抗pH中的變化。這種對pH變化的抗性是由于此類溶液的緩沖性質。因此，顯示出緩沖活性的溶液或組合物被稱為緩沖液或緩沖溶液。緩沖液一般不具有無限的維持溶液或組合物的PH的能力。相反，它們一般能夠維持在特定范圍內的pH，例如pH7 - pH9。一般地，緩沖液能夠維持在其pKa上和下一個對數內的pH (參見例如，Mohan，Buffers， A guide for the preparation and use of buffers in biological systems,CALB10CHEM, 1999)。緩沖液和緩沖溶液一般由緩沖鹽或優選非離子緩沖液組分如TRIS和HEPES制備。可以在本發明的方法中使用的緩沖液優選選自磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖鹽水緩沖液(PBS)、2-氨基-2羥甲基-1，3-丙二醇(TRIS)緩沖液、TRIS緩沖鹽水溶液(TBS)和TRIS/EDTA (TE)。
[0026]待用根據本發明的方法裂解的細胞是所有類型的細胞，優選包含細胞壁的細胞，最優選細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞或植物細胞。特別優選的細胞是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌細胞，尤其是選自下述的那些:李斯特菌屬物種(Zkteriaspp.)、金黃色葡萄球菌(51 aureus )、Ρ.para tuberculosis、沙門氏菌屬物種 iSalmorwllaspp.)、空腸彎曲桿菌(C jejuni )、婁地青霉菌iPenicillum roquefortii )和大腸桿菌iE.Coli) 0
[0027]根據本發明，樣品可以是包含細胞的任何樣品。樣品可以是例如食物樣品，體液特別是血液、血漿或血清，水或組織樣品。在優選實施方案中，樣品已用包括下述步驟的方法由復雜樣品生成:
a)提供復雜樣品，
b)使所述樣品與下述溫育:
-至少一種離液劑，
-緩沖液和 -至少一種去污劑，
c)通過離心或過濾從所得到的混合物中分離所述細胞。關于這個從復雜樣品中分離細胞的程序的細節公開于EP 2049677中。
[0028]根據本發明的樣品還可以通過下述由復雜樣品生成
a)提供復雜樣品，
b)使所述樣品與包含至少MgCI2和/或離子液體的提取溶液溫育
c)優選通過離心、親和結合和/或過濾，從步驟b)的混合物中分離所述細胞。
[0029]關于這個從復雜樣品中分離細胞的程序的細節公開于WO 2010145754中。
[0030]根據本發明，復雜樣品可以是例如食物樣品，體液特別是血液、血漿或血清，水或組織樣品。一般地，復雜樣品具有復雜基質(即尤其其中包含蛋白質、脂質、碳水化合物等)和/或高粘度。
[0031]根據本發明，水不混溶的液體是水不混溶的油或水不混溶的離子液體。
[0032]適合于根據本發明的方法的油是任何油，其在室溫是液體，并且具有高于150°C、更優選高于200°C的沸點以及閃點。此外，油必須是水不混溶的。這意指適合于根據本發明的方法的油當與水在20 - 80°C混合時形成兩相系統。關于合適油的例子是有機油、礦物油、硅油或精油(essential oil)。
[0033]有機油是包含至少脂肪酸和/或甘油三酯的油。在室溫是液體的有機油一般包含鏈長6 - 30個碳原子的單或多不飽和脂肪酸。合適的有機油的例子是菜籽油和蓖麻油。
[0034]礦物油是包含石蠟油和或環烷油的油和/或芳香油。優選的礦物油是包含較重烷烴的混合物的石蠟油，如重白油(CAS 8012-95-1)。
[0035]合適的硅油優選是通式R (R2SiO) nSiR3的線性硅油，R彼此獨立的但優選在整個分子中等同的是直的或分支Cl - CS烷基殘基。合適硅油的一個例子是聚(二甲基硅氧烷)(CAS 63148-62-9)。
[0036]關于精油的例子是萜烯或類萜。
[0037]如本發明中使用的離子液體或液體鹽是由一般的有機陽離子和陰離子組成的離子種類。它們不含任何中性分子且通常具有低于373 K的熔點。
[0038]離子液體的領域目前被廣泛研究，因為潛在應用是各種各樣的。關于離子液體的綜述文章是例如
【權利要求】
1.用于裂解細胞的方法，通過下述 a)提供包含細胞的樣品 b)向所述樣品中加入至少包含與水不混溶的液體的裂解溶液 c)將步驟b)中獲得的混合物加熱至高于80°C的溫度 d)在步驟c)中的溫度高于100°C的情況下，將所述樣品冷卻至低于100°C的溫度 e)將水或含水緩沖溶液加入所述混合物中，由此獲得與水不混溶的液相和水相。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于所述細胞是細菌細胞。
3.根據權利要求1或2的方法，其特征在于在步驟c)中，將所述混合物加熱至100-150。。。
4.根據權利要求1- 3中任一項的方法，其特征在于在步驟d)中，將所述樣品冷卻至20 - 40。。。
5.根據權利要求1- 4中任一項的方法，其特征在于在步驟b)中加入的所述裂解溶液包含與水不混溶的離子液體。
6.根據權利要求5的方法，其特征在于所述離子液體的陰離子是雙(三氟甲基磺酰基)酰亞胺[Ntf2]。
7.根據權利要求1- 5中任一項的方法，其特征在于在步驟b)中加入的所述裂解溶液包含三己基(十四烷基)鱗三(`五氟乙基)三氟磷酸酯[Ttp] [Fap]和/或1-丁基-1-甲基吡咯烷鎗鹽雙(三氟甲基磺酰基)酰亞胺[bmpyrr] [Ntf2]。
8.根據權利要求1- 7中任一項的方法，其特征在于加入所述裂解溶液前，在步驟bl)中使所述樣品與至少一種包含銨陽離子[NR4]+的物質預溫育 其中 在每種情況下，R彼此獨立地指示
H, 具有1-20個C原子的直鏈或分支烷基， 具有2-20個C原子和一個或多個雙鍵的直鏈或分支烯基， 具有2-20個C原子和一個或多個三鍵的直鏈或分支炔基， 具有3-7個C原子的飽和、部分或完全不飽和的環烷基，其可以通過具有1-6個C原子的烷基取代，其中一個或多個R可以部分或完全由鹵素特別是-F和/或-Cl取代，或部分由-OH、-OR，、-CN、-C (O) OH、-C (O) NR，2、-SO2NRj 2、-C (O) X、-SO2OH, -SO2X, -NO2 取代，并且其中R中不處于α-位置中的一個或兩個不鄰近的碳原子可以替換為選自下述的原子和 / 或原子團:-0-、-S-、-S (O)-、-S02-、-S020-、-C (O)-、-C (O) O-、-N+R，2-、-P (O)R，O-、-C (O) NR，-、-SO2NRj -、-OP (0) R，0-、-P (0) (NR，2) NR，-、-PR，2=N_ 或-P (0)R’-，其中R’可以是=H，非、部分或全氟化的C1-至C6-烷基，C3-至C7-環烷基，未取代或取代的苯基，并且X可以是=鹵素。
9.根據權利要求1- 8中任一項的方法，其特征在于加入所述裂解溶液前，在步驟bl)中使所述樣品與至少一種基于N，N-二甲基-2-羥乙基銨[DMAE]的離子液體預溫育。
10.根據權利要求1- 9中任一項的方法，其特征在于在步驟e)后，使所述所得到的混合物與蛋白酶溫育。
11.根據權利要求1- 10中任一項的方法，其特征在于在步驟e)和與蛋白酶的任選溫育后，通過實時PCR直接分析所述水相。
12.試劑盒，其包含具有與水不混溶的離子液體或與水不混溶的油的一個容器和具有蛋白酶的一個 容器。
【文檔編號】C12N1/06GK103492550SQ201280020268
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年3月28日 優先權日:2011年4月27日
【發明者】J.斯拉格休斯, P.羅斯馬尼特, S.富克斯, P.J.梅斯特, M.瓦格納 申請人:默克專利股份公司