用于高密度葡萄糖漿的淀粉液化和糖化的單pH工藝的制作方法

用于高密度葡萄糖漿的淀粉液化和糖化的單pH工藝的制作方法
【專利摘要】本發明的實施例涉及在所述糖化步驟之前，在不進行pH調節的情況下由含淀粉的底物制備下游產品的工藝，所述下游產品為例如高密度葡萄糖漿和高葡萄糖發酵原料。所述糖化由葡糖淀粉酶在5.2至5.6范圍內的pH下有效地催化。
【專利說明】用于高密度葡萄糖漿的淀粉液化和糖化的單pH工藝
[0001]優先權
[0002]本專利申請要求提交于2011年4月29日的美國臨時申請序列號61/481，084的優先權，該臨時申請據此全文以引用方式并入本文。
[0003]序列表
[0004]附件是包括SEQ ID NO:1_3的序列表，其以引用方式整體并入本文。
【技術領域】
[0005]一種用于由含淀粉材料(如谷物)制備下游產品(例如高密度葡萄糖漿和發酵原料)的方法，該方法無需在液化和糖化之間進行PH調節。
[0006]發明背景
[0007]通常，葡萄糖可以是淀粉加工的產物，淀粉加工可以是催化淀粉降解的、涉及液化和糖化的兩步酶促過程。在液化過程中，不溶性顆粒淀粉通常在水中調成漿液，經加熱糊化，并被熱穩定性α-淀粉酶水解。目前在大多數商業液化過程中使用的α-淀粉酶在ρΗ4.8至ρΗ5.2的酸性水平下不穩定，因此使用合適的堿(如，氫氧化鈉或氫氧化鈣、碳酸鈉或氨水)將漿料的PH調節至約 pH5.6至6.0。因此，通常在約5.6至6.0的pH下進行液化。
[0008]在糖化期間，進一步通過葡糖淀粉酶水解液化過程中制備的可溶性糊精以生成糖。葡糖淀粉酶為外切作用糖酶，能夠水解淀粉(如直鏈淀粉和支鏈淀粉)的直鏈和支鏈糖苷鍵。市售的葡糖淀粉酶通常具有在酸性PH范圍內(低于5.0)的最適pH。因此，通常使用例如稀酸(如，硫酸)將液化物的pH調節至在約4.2-4.5范圍內的酸性pH，以執行糖化。因此，目前用于獲得所需終產物(例如高密度葡萄糖漿和高葡萄糖發酵原料)的液化和糖化過程在不同的pH水平下執行。可發酵糖，例如低分子糖如葡萄糖，然后可通過其他酶(如葡萄糖異構酶)轉化為果糖；可進行結晶；或者可用于發酵以生產多種終產物(如醇、谷氨酸一鈉、琥珀酸、維生素、氨基酸、1，3-丙二醇和乳酸)。
[0009]由于在液化之后和糖化之前必須調節pH水平，因此，目前可用的處理含淀粉材料的方法需要使用額外的化學品，這增加了生產成本。在液化步驟之后需要的用于為糖化提供合適條件的PH調節也可導致反應介質中出現高鹽積聚和高硫含量，從而產生環境處理問題。因此，存在對這樣一種制備終產物(例如高密度葡萄糖漿和高葡萄糖發酵原料)的方法的需要，所述方法在商業上不必以不同的PH水平執行液化和糖化。

【發明內容】

[0010]提供了一種通過單pH工藝來制備高密度葡萄糖漿和高葡萄糖發酵原料的方法，其不必在液化之后和糖化之前調節pH。該方法利用了某些葡糖淀粉酶的區分性質。葡糖淀粉酶例如灰腐質霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)及其變體具有高于已知葡糖淀粉酶(GA)的最適pH,所述已知葡糖淀粉酶(GA)為例如得自黑曲霉(Aspergillus niger)的GA(AnGA)和得自埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)的GA(TeGA)。因此,本發明方法所用的葡糖淀粉酶能夠有效地在5.2-5.6范圍內的pH和約58°C至約62°C范圍內的溫度下糖化淀粉底物以制備高密度葡萄糖漿和高葡萄糖發酵原料。HgGA葡糖淀粉酶的該性質使其可用于淀粉液化和糖化的單PH工藝以制備高密度葡萄糖漿和高葡萄糖發酵原料。本發明所公開的方法還可將葡糖淀粉酶與支鏈淀粉酶結合以提高過程效率。
[0011]在一個方面，葡糖淀粉酶選自包含SEQ ID NO:3的親本灰腐質霉葡糖淀粉酶(HgGA)及其變體，其中所述變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%同一性。在另一方面，與親本葡糖淀粉酶相比，葡糖淀粉酶具有一個氨基酸修飾。在又一方面，葡糖淀粉酶為具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的HgGA。任選地,葡糖淀粉酶在里氏木霉(Trichoderma reesei)宿主細胞中產生。
[0012]在一個實施例中，葡糖淀粉酶以至少約0.15GAU/克干物質淀粉或至少約0.20GAU/克干物質淀粉的劑量添加。
[0013]在一個方面，糖化在pH5.35至5.5下執行。在另一方面,糖化所用的淀粉底物為液化淀粉。在又一方面，糖化在約70小時獲得至少95%的DPl濃度。
[0014]在一個實施例中，淀粉底物為約30%至約50%、或約30%至約35%干固體(DS)。
[0015]在另一方面，淀粉底物為顆粒淀粉，糖化在約28小時獲得至少95%的DPl濃度，并且淀粉底物的淀粉溶解度為至少90%。
[0016]在一個實施例中，糖化在約50小時獲得至少96%的DPl濃度，并且淀粉底物的淀粉溶解度為至少97%。
[0017]另外，高級糖 的含量可低于I %。此外，淀粉底物可為約28%干固體(DS)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]將附圖并入本說明書中，提供多個實施例的非限制性例證。在附圖中:
[0019]圖1示出了糖化期間累積的葡萄糖(DPI)濃度的時間進程。使用以0.18葡糖淀粉酶單位(GAU) /克干物質淀粉的劑量添加的HgGA執行單pH糖化，如實例I和表1中所述。
[0020]圖2示出了單ρΗ(α-活性)糖化過程期間累積的DPl濃度的時間進程。使用如實例2和表2 (燒瓶1-4)中所述的酶濃度并在其描述的條件下，使用HgGA或在存在支鏈淀粉酶的情況下使用HgGA執行所述糖化。
[0021]圖3示出了糖化過程期間累積的DPl濃度的時間進程，其中α -淀粉酶通過在糖化之前將液化物pH降至低于4.0而失活(α -滅活)。使用實例2和表2 (燒瓶5-8)中所述的酶濃度并在其描述的條件下，使用HgGA或在存在支鏈淀粉酶的情況下使用HgGA執行所述糖化。
【具體實施方式】
[0022]本發明涉及葡糖淀粉酶，該葡糖淀粉酶能夠在介于約5.2-5.6之間的pH下有效地使淀粉底物糖化，而不必在液化步驟之后調節pH。
[0023]在一些方面，本發明的實施例依賴于遺傳工程和分子生物學領域中使用的常規技術和方法。以下資料包括對可根據本發明使用的一般方法學的描述=SambiOOk等人，《分子克隆實驗指南》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)(第 2 版，1989 年)；Kreigler,《基因轉移和表達實驗指南》(GENE TRANSFER AND EXPRES SION ；A LABORATORYMANUAL)，1990年；以及Ausubel等人編輯，《分子生物學實驗手冊》(CURRENT PROTOCOLSIN MOLE⑶LAR BIOLOGY) (1994年)。除非本文另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。以下文獻向技術人員提供本發明所使用的許多術語的通用詞典:Singleton等人，《微生物學和分子生物學詞典》(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)，第 2 版，約翰威立父子出版公司，紐約(John Wiley and Sons, New York), 1994 年；以及 Hale & Markham,《哈普克林生物學詞典》(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY), Harper Perennial 出版社，紐約(Harper Perennial,N.Y.), 1991年。本文描述了代表性的方法和材料，但任何與本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于實施或測試本發明。數值范圍包括限定該范圍的數值。本文提供的標題并非對各個方面或實施例的限制，這些方面或實施例可以通過參閱本說明書全文而獲得。
[0024]1.定義和縮寫
[0025]根據此詳細描述，應用下面的縮寫和定義。應該指出的是，如本文所使用，除非上下文另有明確指明，否則單數形式“一個”、“一種”和“該”包括多個指代物。因此，例如，提及“一種酶”則包括多個這種酶。
[0026]1.1.定義
[0027]本文所用的“氨基酸序列”與術語“多肽”和/或術語“蛋白質”同義。在一些情況中，術語“氨基酸序列”與術語“肽”同義；在一些情況中，術語“氨基酸序列”與術語“酶”同義。
[0028]本文所用的“核苷酸序列”或“核酸序列”指基因組來源、合成來源或重組來源的序列，且不論代表正義鏈還 是反義鏈都可以是雙鏈的或單鏈的。如本文所用，術語“核酸”可以指基因組DNA、cDNA、合成DNA或RNA。核酸的殘基可含有本領域中通常已知和使用的任何化學修飾。
[0029]“分離的”意指該材料至少基本上不含有至少一種與其天然相關且天然存在的其他組分。
[0030]“純化的”意指該材料處于相對純的狀態，例如至少約90%純的、至少約95%純的或至少約98%純的。
[0031]“寡糖”意指由3-20個單糖構成的碳水化合物分子。
[0032]如本文所用，“轉化的細胞”包括已通過使用重組DNA技術進行轉化的細胞。通常通過向細胞插入一個或多個核苷酸序列而進行轉化。所插入的核苷酸序列可以是異源核苷酸序列，即這樣的序列，其對于待轉化的細胞而言可以是并非天然的，例如融合蛋白。
[0033]如本文所用，“淀粉”指由植物的復雜多糖碳水化合物構成的任何材料，由具有式(C6HltlO5)x(其中“X”可以是任何數字)的直鏈淀粉和支鏈淀粉構成。具體地講，該術語指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、草、塊莖和根，更具體地講，指小麥、大麥、玉米、黑麥、稻米、高粱、糠、木薯、小米、馬鈴薯、甘薯和木薯粉。
[0034]如本文所用，“顆粒淀粉”指未經過糊化的未蒸煮過(生)的淀粉。
[0035]如本文所用，“淀粉糊化”意指使淀粉分子增溶形成粘性懸浮液。
[0036]如本文所用，“糊化溫度”指淀粉底物發生糊化時的最低溫度。確切溫度取決于具體的淀粉底物，還可取決于淀粉得自的植物物種的特定品種和生長條件。[0037]“DE”或“葡萄糖當量”為用于度量總還原糖的濃度的行業標準，計算為已轉化為還原糖的總固形物的百分數。尚未被水解的顆粒淀粉的DE為約零(O)，而D-葡萄糖的DE為約 100。
[0038]如本文所用，“淀粉底物”指使用精制淀粉、全磨谷粒或分級的谷粒的顆粒淀粉或液化淀粉。
[0039]如本文所用，“液化淀粉”指已經歷過增溶處理，例如常規的淀粉液化處理的淀粉。
[0040]“聚合度(DP) ”是指給定糖中脫水吡喃葡萄糖單位的數目(η)。DPl的實例是單糖，如葡萄糖和果糖。DP2的實例是二糖，如麥芽糖和蔗糖。DP4+( > DP4)表示聚合度大于4的聚合物。
[0041]本文所用的“可發酵糖”指能夠在發酵條件下被代謝的糖類。這些糖類通常指葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖(DP1、DP2和DP3)。
[0042]如本文所用，“總糖含量”是指淀粉組合物中存在的總糖含量。
[0043]如本文所用，“ds”是指溶液中溶解的固形物。
[0044]如本文所用，“淀粉液化酶”是指催化顆粒淀粉的水解或分解的酶。示例性的淀粉液化酶包括α -淀粉酶(EC3.2.1.1)。
[0045]除了其他方面，“淀粉酶”意指能夠催化淀粉降解的酶。
[0046]“ α -淀粉 酶(EC3.2.1.1) ”是指以隨機方式裂解淀粉分子內部的a-D-(l — 4)0-糖苷鍵的內切作用酶。相反，外切作用淀粉分解酶如淀粉酶(EC3.2.1.2 ；a -D-(I — 4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)和一些產物特異性淀粉酶如產麥芽糖α -淀粉酶(EC3.2.1.133)從底物的非還原端切割淀粉分子。這些酶也被描述成在含有1，4-α-連接的D-葡萄糖單位的多糖中實現1，4-α -D-糖苷鍵的外切水解或內切水解的酶。用于描述這些酶的另一術語是糖原酶。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。
[0047]如本文所用，“葡糖淀粉酶”是指淀粉葡糖苷酶類的酶(EC3.2.1.3，葡糖淀粉酶，a -1,4-D-葡聚糖葡糖水解酶)。這些酶是從直鏈淀粉和/或支鏈淀粉分子的非還原端釋放葡萄糖殘基的外切作用酶。這些酶也能夠水解α-1，6和α-1，3鍵，但是水解速率要比α-1，4鍵的水解慢得多。
[0048]本文所用的“最高活性”指在最有利的條件下例如在最佳pH下測量的酶活性。本文所用的“最佳pH”指在其他條件相等的情況下酶表現出最高活性時的pH值。
[0049]詞語蛋白質或多肽的“成熟形式”指該蛋白質或多肽的最終功能形式。葡糖淀粉酶的成熟形式可例如缺乏信號肽和/或起始甲硫氨酸。葡糖淀粉酶的成熟形式可從其天然宿主例如通過內源表達來產生。或者,葡糖淀粉酶的成熟形式可從其非天然宿主例如通過外源表達來產生。外源表達的葡糖淀粉酶與內源表達的對等物相比可具有改變的糖基化模式。
[0050]術語“親本”或“親本序列”指天然的或自然存在的序列。
[0051]本文所用的術語“變體”用來指與親本葡糖淀粉酶序列具有一定程度的氨基酸序列同一性的葡糖淀粉酶。變體與親本序列相似，但在其氨基酸序列中具有至少一個使其在序列上與親本葡糖淀粉酶不同的置換、缺失或插入。在一些情況中，變體經過了操縱和/或工程改造以在其氨基酸序列中包括至少一個使其在序列上與親本不同的置換、缺失或插入。另外，葡糖淀粉酶變體可保留親本葡糖淀粉酶的功能特性，例如保持的葡糖淀粉酶活性達親本葡糖淀粉酶活性的至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、98 %或99 %。
[0052]如本文所用，“淀粉的水解”是指加入水分子時糖苷鍵裂解。
[0053]本文所用的“終產品”或“期望的終產品”指酶和/或微生物將淀粉底物轉化成的分子或化合物。
[0054]本文所用的“接觸”或“混合”指將相應的酶設置成與相應的底物充分靠近，使得該酶能夠將該底物轉化為終產品。本領域技術人員將認識到將酶溶液與相應底物混合可實現接觸或混合。
[0055]1.2.縮寫
[0056]除非另有指明，否則應用下述縮寫:
[0057]AAα -淀粉酶
[0058]AmyE枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) α -淀粉酶
[0059]AnGA黑曲霉葡糖淀粉酶
[0060]cDNA互補 DNA
[0061]DE葡萄糖當量
[0062]DNA脫氧 核糖核酸
[0063]DP3具有三個亞單位的聚合度
[0064]DPn具有η個亞單位的聚合度
[0065]DS或ds干固體
[0066]dss干固體淀粉
[0067]EC進行酶分類的酶學委員會
[0068]g克
[0069]GAU葡糖淀粉酶單位
[0070]H-GA灰腐質霉葡糖淀粉酶
[0071]HgGA灰腐質霉葡糖淀粉酶
[0072]HPLC高壓液相色譜法
[0073]MOPS3- (N-嗎啉代)丙磺酸
[0074]PEG聚乙二醇
[0075]RNA核糖核酸
[0076]RO反滲透
[0077]TeGA埃默森籃狀菌葡糖淀粉酶
[0078]TrGA里氏木霉葡糖淀粉酶
[0079]μ m微米
[0080]2.淀粉加工中的酶
[0081]2.1.葡糖淀粉酶
[0082]2.1.1.具有期望的PH譜的葡糖淀粉酶
[0083]葡糖淀粉酶由細菌、真菌、酵母和植物的許多菌株(株系)產生。許多真菌葡糖淀粉酶是胞外產生的真菌酶，例如來自以下各屬的菌株:曲霉屬(Aspergillus) (Svensson等人，《嘉士伯研究通訊》(Carlsberg Res.Commun.)，第 48 卷，第 529-544 頁，1983 年；Boel等人，《歐洲分子生物學組織雜志》(EMBO J.)，第3卷，第1097-1102頁，1984年；Hayashida等人，《農業生物化學》(Agric.Biol.Chem.)，第53卷，第923-929頁，1989年；美國專利 N0.5，024，941 ;美國專利 N0.4，794，175 和 W088/09795);籃狀菌屬(Talaromyces)(美國專利N0.4，247，637 ;美國專利N0.6，255，084 ;和美國專利N0.6，620，924)；根霉屬(Rhizopus) (Ashikari 等人,《農業生物化學》(Agric.Biol.Chem.)，第 50 卷，第 957-964 頁，1986年；Ashikari等人，《應用微生物學和生物技術》(App.Microbi0.Biotech.),第32卷，第 129-133 頁，1989 年;和美國專利 N0.4，863，864);腐質霉屬(Humicola) (W005/052148 和美國專利N0.4, 618, 579)；以及毛霉屬(Mucor) (Houghton-Larsen等人，《應用微生物學和生物技術》(App1.Microbiol.Biotechnol.)，第 62 卷，第 210-217 頁，2003 年)。許多編碼這些酶的基因已被克隆并在酵母、真菌和/或者細菌細胞中表達。
[0084]在商業上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶，已被用于許多需要水解淀粉(例如用于從淀粉產生葡萄糖和其他單糖)的應用中。葡糖淀粉酶被用來生產高果糖玉米甜味劑，其占美國甜味劑市場的50%以上。一般而言，葡糖淀粉酶可以并且通常與α-淀粉酶一起在淀粉水解過程中使用，以將淀粉水解成糊精，然后水解成葡萄糖。然后葡萄糖可通過其他酶(如，葡萄糖異構酶)轉化為果糖；可進行結晶；或者可用于發酵以生產各種各樣的終產物(如乙醇、檸檬酸、琥珀酸、抗壞血酸中間體、谷氨酸、甘油、1，3-丙二醇和乳酸)。
[0085]本發明的實施例采用了能夠在某pH下(例如在5.2和5.6之間)有效糖化淀粉底物的葡糖淀粉酶。具有所需PH譜的葡糖淀粉酶包括(但不限于)灰腐質霉葡糖淀粉酶(HgGA)。
[0086]HgGA可以是包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的葡糖淀粉酶，其在美國專利N0.4，618，579和N0.7，262，041中進行了詳細描述。這個HgGA還被描述為顆粒淀粉水解酶(GSHE)，因為它能夠水解顆粒形式的淀粉。編碼來自灰腐質霉高溫變種(Humicola griseavar.thermoidea)的HgGA的基因組序列以SEQ ID NO:1示出，其含有三個推定的內含子(位置233-307、752-81 7和950-1006)。來自灰腐質霉高溫變種的天然HgGA具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其包括含有30個氨基酸殘基的信號肽(SEQ ID NO:2的位置I至30)。切割信號肽即得到具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的成熟HgGA。本發明的實施例還包括從木霉屬(Trichoderma)宿主細胞例如里氏木霉細胞產生的HgGA。參見美國專利N0.7，262，041。
[0087]2.1.2.結構和功能
[0088]本發明實施例的葡糖淀粉酶也可以是HgGA的變體。變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性。任選地，該變體與親本葡糖淀粉酶的成熟形式相比具有一個、兩個、三個、四個、五個或六個氨基酸修飾。在一個實施例中，葡糖淀粉酶是包含SEQ ID NO:3的親本HgGA的變體，其中所述變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%的同一性。該變體在
5.2-5.6范圍內的pH下具有期望的pH譜和糖化淀粉底物的能力。在一些實施例中，該變體可具有其他改進的性質，例如改進的熱穩定性和改進的特異性。
[0089]葡糖淀粉酶由多達三個不同的結構域組成:一個是在所有葡糖淀粉酶中結構上保守的、大約450個殘基的催化域，通常接著是一個由30-80個殘基組成的接頭區域，該接頭區域連接到一個大約100個殘基的淀粉結合域。所有三個區域均完整的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)的結構被測定至1.8埃分辨率。參見W02009/048488和W02009/048487。采用測得的坐標，將結構與來自之前測定的泡盛曲霉(Aspergillus awamori)菌株XlOO的葡糖淀粉酶的催化域的坐標(Aleshin, A.E.，Hoffman, C.，Firsov, L.M.和 Honzatko R.B.，“來自泡盛曲霉XlOO變種的葡糖淀粉酶的精修晶體結構”(Refined crystal structuresof glucoamylase from Aspergillus awamori var.X100.),《分子生物學雜志》(J.Mol.Biol.)，第238卷，第575-591頁，1994年)進行比對。參見同上文獻。TrGA和泡盛曲霉葡糖淀粉酶的催化域的結構重疊得非常緊密，可以基于這個結構重合來鑒定對等的殘基。參見同上文獻。還認為所有的葡糖淀粉酶都具有基本的結構。參見同上文獻。
[0090]鑒于各種葡糖淀粉酶的公知的結構和功能關系，已成功產生和表征了具有改變的性質的葡糖淀粉酶變體。所述變體與親本葡糖淀粉酶相比可表現出改善的性質。改善的性質可包括(但不限于)提高的熱穩定性和提高的比活性。例如，W02009/067218中描述了制備和表征具有改變的性質的TrGA變體的方法。已發現功能性TrGA變體具有一個或多個具體的序列修飾。例如，一些TrGA變體具有多個序列修飾。例如，W02009/067218公開了具有六個或更多個氨基酸修飾的TrGA變體。這些TrGA變體顯示了至少與親本TrGA —樣多的活性，并且在許多情況下，顯示了改善的性質。預期HgGA中對應殘基的改變將產生具有葡糖淀粉酶活性的變體。本發明方法中可用的葡糖淀粉酶變體可以在5.2至5.6范圍內的PH下有效地水解淀粉。
[0091]2.1.3.葡糖淀粉酶的產生
[0092]適合于本發明的實施例的葡糖淀粉酶可用重組DNA技術在各種宿主細胞中產生。
[0093]在一些實施例中，宿主細胞選自細菌細胞、真菌細胞、植物細胞和酵母細胞。術語宿主細胞包括用來產生根據本發明的變體葡糖淀粉酶的細胞、所述細胞的子代和從所述細胞產生的原生質體。在一些實施例中，宿主細胞是真菌細胞，通常是絲狀真菌宿主細胞。術語“絲狀真菌”指真菌亞門的所有絲狀形式(參見Alexopoulos，C.J.，1962年，《真菌學概論》(INTRODUCTORY MYCOLOGY)，威利出版社，紐約(Wiley，New York))。這些真菌的特征是其營養菌絲體 的細胞壁由幾丁質、纖維素和其他復合多糖構成。本發明的絲狀真菌在形態學上、生理學上和遺傳學上與酵母不同。絲狀真菌的營養生長是通過菌絲伸長來進行，并且碳分解代謝是專性好氧的。在本發明的實施例中，絲狀真菌親本細胞可以是以下各屬(但不限于以下各屬)的物種的細胞:木霉屬(例如里氏木霉(其為之前歸類為長梗木霉(T.1ongibrachiatum)的紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的無性形式)、綠色木霉(Trichoderma viride)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)) (Sheir-Neirs等人，1984年，《應用微生物學和生物技術》(Appl.Microbiol.Biotechnol)，第 20 卷，第 46-53 頁；ATCC N0.56765 和 ATCC N0.26921)；青霉屬(Penicillium sp.);腐質霉屬(例如e.g特異腐質霉(H.1nsolens)、柔毛腐質霉(H.lanuginosa)和灰腐質霉(H.grisea);金孢子菌屬(Chrysosporium sp.)(如C.1ucknowense);粘帚霉屬(Gliocladiurm sp.);曲霉屬(Aspergillus sp.)(例如米曲霉(A.0ryzae)、黑曲霉(A.niger)、醬油曲霉(Asojae)、日本曲霉(A.japonicus)、構巢曲霉(A.nidulans)和泡盛曲霉(A.awamori) (Ward等人，1993年，《應用微生物學和生物技術》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)第 39 卷，第 738-743 頁；以及 Goedegebuur 等人，2002 年，《遺傳學》(Genet),第41卷,第89-98頁);鐮刀菌屬(Fusarium sp.)(例如粉紅色鐮刀菌(F.roseum)、禾谷鐮刀菌(F.graminum)、F.cerealis、尖孢鐮刀菌(F.0xysporuim)和腐皮鐮刀菌(F.venenatum));脈胞菌屬(Neurospora sp.)(粗糙脈胞菌(N.crassa));肉座菌屬(Hypocrea sp.);毛霉屬 Mucor sp.)(米黑毛霉(M.miehei));根霉屬(Rhizopus sp.)和裸孢殼屬(Emericella sp.)(另參見Innis等人，1985年，《科學》(Sc1.),第228卷,第21-26 頁)ο 術語木霉屬(“Trichoderma”或“Trichoderma sp.”或“Trichoderma spp.，，)指之前或目前被歸類為木霉的任何真菌屬。在其他實施例中，宿主細胞將是經遺傳工程改造的宿主細胞，其中天然基因已例如通過在真菌細胞中進行缺失而被失活。在期望獲得具有一個或多個失活的基因的真菌宿主細胞的情況中，可使用已知的方法(例如美國專利N0.5，246，853和N0.5，475，101以及W092/06209中公開的方法)。可通過完全或部分缺失、通過插入失活或者通過任何其他能使基因對其預定目的而言無功能的手段(使得防止該基因表達功能蛋白)，來實現基因失活。在一些實施例中，當宿主細胞是木霉屬細胞尤其是里氏木霉宿主細胞時，cbhl基因、cbh2基因、egll基因和egl2基因將被失活和/或通常被缺失。代表性地，具有quad缺失蛋白的里氏木霉宿主細胞在美國專利N0.5，847，276和W005/001036中給出并描述。在其他實施例中，宿主細胞是蛋白酶缺陷株或蛋白酶欠缺株。
[0094]為用重組DNA技術產生本發明的實施例的葡糖淀粉酶，可構建包含編碼該指定葡糖淀粉酶的氨基酸序列的核酸的DNA構建體，并轉移到例如里氏木霉宿主細胞中。載體可以是任何當被引入到里氏木霉宿主細胞中時能整合到宿主細胞基因組中并能被復制的載體。有關載體名單可參見真菌遺傳學原種中心(Fungal Genetics Stock Center,FGSC,〈www.fgsc.net>)菌株目錄。合適的表達和/或整合載體的另外的例子在以下文獻和專利中提供:Sambrook等人，1989年，出處同上；Ausubel, 1987年，出處同上；van denHondel等人，1991年，載于Bennett和Lasure編輯，“真菌中的更多基因操縱”(MORE GENEMANIPULATIONS IN FUNGI)，學術出版社(Academic Press)，第 396-428 頁；以及美國專利N0.5，874，276。可將編碼葡糖淀粉酶的核酸有效連接到在里氏木霉宿主細胞中顯示轉錄活性的合適啟動子。該啟動子可衍自編碼該宿主細胞的同源或異源蛋白質的基因。啟動子的合適的非限制性例子包括cbhl、cbh2、egll、egl2。在一個實施例中，啟動子可以是天然的里氏木霉啟動子。通常，啟動子可以是里氏木霉cbhl，其是誘導型啟動子并已寄存在GenBank中，登記號為D86235。“誘導型啟動子”可指在環境調節或發育調節下有活性的啟動子。在另一個實施例中，啟動子可以是里氏木霉宿主細胞的異源啟動子。有用的啟動子的其他例子包括來自泡盛曲霉和黑曲`霉葡糖淀粉酶基因的啟動子(參見例如Nunberg等人，1984年，《分子與細胞生物學》(Mol.Cell Biol.)，第4卷，第2306-2315頁;和Boel等人，1984年，《歐洲分子生物學組織雜志》(EMBO J.)，第3卷，第1581-1585頁)。另外，里氏木霉xlnl基因和纖維二糖水解酶I基因的啟動子也可能是有用的。
[0095]在一些實施例中，可將葡糖淀粉酶編碼序列有效連接到信號序列。信號序列可以是葡糖淀粉酶的天然信號肽(例如，對于HgGA而言為SEQ ID NO:2的殘基1_20)。或者，信號序列可與天然信號序列具有至少90%或至少95%序列同一性。在另外的實施例中，構成待引入到里氏木霉宿主細胞中的DNA構建體或載體的信號序列和啟動子序列衍生自相同的來源。例如，在一些實施例中，信號序列可以是有效連接到cdhl啟動子的cdhl信號序列。
[0096]在一些實施例中，表達載體也可包括終止序列。在一個實施例中，終止序列和啟動子序列可衍自相同來源。在另一個實施例中，終止序列可以對宿主細胞而言是同源的。特別合適的終止子序列可以是衍生自里氏木霉的cbhl。其他示例性的真菌終止子包括來自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子。[0097]在一些實施例中，表達載體可包括選擇性標記。代表性的選擇性標記的例子包括賦予抗微生物抗性(例如潮霉素和腐草霉素)的選擇性標記。營養選擇性標記也可用于本發明，包括本領域已知的amdS、argB和pyr4標記。在用于木霉屬的轉化的載體系統中有用的標記是本領域已知的(參見例如Finkelstein，《絲狀真菌的生物技術》(BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI)第 6 章，Finkelstein 等人編輯，美國馬薩諸塞州波士頓的 Butterworth-Heinemann 出版社(Butterworth-Heinemann,Boston,Mass.), 1992年，第6章；和Kinghorn等人，1992年，《絲狀真菌的應用分子遺傳學》(APPLIED MOLE⑶LARGENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI)，倫敦查普曼 & 霍爾公司的 Blackie Academic andProfessional 出版 社(Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall,London)。在一個代表性的實施例中，選擇性標記可以是編碼乙酰胺酶的amdS基因，從而使轉化的細胞能以乙酰胺作為氮源生長。使用構巢曲霉amdS基因作為選擇性標記在例如以下文獻中有描述=Kelley等人，1985年，《歐洲分子生物學組織雜志》(EMBO J.)，第4卷，第475-479 頁；和 Penttila 等人，1987 年，《基因》(Gene)，第 61 卷，第 155-164 頁。
[0098]包含具有編碼葡糖淀粉酶的多核苷酸的DNA構建體的表達載體，可以是任何能夠在給定的真菌宿主生物中自主復制或能夠整合到宿主的DNA中的載體。在一些實施例中，表達載體可以是質粒。在典型的實施例中，設想到兩種類型的用于獲得基因的表達的表達載體。
[0099]第一個表達載體可包含這樣的DNA序列，其中啟動子、葡糖淀粉酶編碼區和終止子均來源于待表達的基因。在一些實施例中，可通過缺失掉不需要的DNA序列(例如編碼不想要的結構域的DNA)以留下待在其自身的轉錄和翻譯調控序列控制下表達的結構域，來獲得基因截短。[0100]第二種類型的表達載體可以是預先裝配的，含有高水平轉錄所需的序列并含有選擇性標記。在一些實施例中，可將葡糖淀粉酶基因的編碼區或其部分插入到這個通用表達載體中，使得它處于表達構建體啟動子和終止子序列的轉錄控制下。在一些實施例中，可將基因或其部分插入在強啟動子如強Cbhl啟動子的下游。
[0101]用于連接包含編碼葡糖淀粉酶的多核苷酸、啟動子、終止子和其他序列的DNA構建體并將它們插入到合適的載體中的方法是本領域公知的。連接通常可通過在便利的限制位點處的連接來完成。如果不存在此類位點，那么根據常規做法使用合成的寡核苷酸接頭。(參見Sambrook, 1989年，出處同上；以及Bennett和Lasure,《真菌中的更多基因操縱》(MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI)，學術出版社，圣地亞哥(Academic Press, SanDiego), 1991年,第70-76頁)。另外,可用已知的重組技術構建載體(如，英杰生命技術公司，Gateway 技術(Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology))。
[0102]將DNA構建體或載體引入到宿主細胞中包括諸如以下的技術:轉化；電穿孔；核顯微注射；轉導；轉染(例如脂轉染介導的和DEAE-Dextrin介導的轉染)；與磷酸鈣DNA沉淀一起溫育；用包被DNA的微粒高速轟擊；及原生質體融合。一般的轉化技術是本領域已知的(參見例如Ausubel等人，1987年，出處同上,第9章；Sambrook, 1989年,出處同上；以及Campbell等人，1989年，《當代遺傳學》(Curr.Genet.),第16卷,第53-56頁)。異源蛋白在木霉屬中的表達在以下專利和文獻中有描述:美國專利N0.6,022, 725 ；N0.6，268，328 ；Harkki 等人，1991 年，《酶微生物技術》(Enzyme Microb.Technol.),第 13 卷，第 227-233頁；Harkki 等人，1989 年，《生物技術》(Bio Technol.)，第 7 卷，第 596-603 頁；EP244, 234 ；EP215, 594 ；以及Nevalainen等人，“木霉屬的分子生物學及其在表達同源和異源基因中的應用，，(“The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to theExpression of Both Homologous and Heterologous Genes，，)，載于《分子工業真菌學》(MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY)，Leong和Berka編輯，馬塞爾.德克爾有限公司，紐約(Marcel Dekker Inc.，NY)，1992 年，第 129-148 頁)。
[0103]在一些實施例中，可用可據以將編碼葡糖淀粉酶的核酸穩定整合到宿主菌株染色體中的載體系統來構建遺傳上穩定的轉化株。然后可通過已知的技術純化轉化株。
[0104]在一個非限制性例子中，包含amdS標記的穩定轉化株與不穩定轉化株的區別在于它們生長速度較快，并且在含有乙酰胺的固體培養基上形成光滑輪廓而不是粗糙輪廓的圓形菌落。此外，在一些情況下，通過以下方式進行進一步的穩定性測試:使轉化株在固體非選擇性培養基(即缺乏乙酰胺的培養基)上生長，從這個培養基收獲孢子，并測定隨后在含有乙酰胺的選擇性培養基上萌發和生長的這些孢子的百分比。或者，可使用本領域知道的其他方法來選擇轉化株。
[0105]DNA向木霉屬菌株宿主中的攝取取決于鈣離子濃度。通常，在攝取溶液中可使用約IOmM CaCl2至50禮CaCl20攝取溶液中除了需要鈣離子外，其他通常包括的化合物是緩沖系統如TE緩沖液(IOmM Tris, pH7.4 ；lmM EDTA)或IOmM MOPS, pH6.0緩沖液(嗎啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。據認為，聚乙二醇的作用是融化細胞膜，從而讓該介質的內容物得以遞送到木霉屬菌株的細胞質中，并且質粒DNA得以轉移到細胞核。這個融化在很多情況下使質粒DNA的多個拷貝整合到宿主染色體中。
[0106]通常，在轉化中使用含有密度為IO5至107/mL、通常2 X IOfVmL的經歷過滲透性處理的木霉屬原生質體或細 胞的懸浮液。將這些原生質體或細胞在適當的溶液(例如，1.2M山梨糖醇；50mM CaCl2)中的100 μ L體積與所需DNA混合。通常，可將高濃度的PEG加入到攝取溶液。可向原生質體懸浮液加入0.1-1體積的25% PEG4000。還通常向原生質體懸浮液加入約0.25體積。也可向攝取溶液加入添加劑例如二甲基亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀等，幫助轉化。有類似的程序可用于其他的真菌宿主細胞。參見例如，美國專利N0.6，022，725和 N0.6，268，328。
[0107]通常，然后可將混合物在大約0°C下溫育10至30分鐘的一段時間。然后可向混合物加入另外的PEG以進一步增強所需的基因或DNA序列的攝取。25% PEG4000的加入體積通常可為轉化混合物的體積的5-15倍；但是，更大和更小的體積都可以是適合的。25%PEG4000通常可為轉化混合物的體積的約10倍。在加入PEG后，接著可將轉化混合物在室溫下或在冰上進行溫育，然后再加入山梨糖醇/CaCl2溶液。然后可將原生質體懸浮液進一步加到生長培養基的熔化等分試樣。這個生長培養基僅允許轉化株的生長。
[0108]通常，在含有生理鹽和營養物的標準培養基中培養細胞(參見例如，Pourquie,J.等人，《纖維素降解的生物化學和遺傳學》(BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSEDEGRADATION), Aubert, J.P.等人編輯，學術出版社(Academic Press)，第 71-86 頁，1988年；以及Ilmen,M.等人，1997年，《應用環境微生物學》(Appl.Environ.Microbiol.),第63卷，第1298-1306頁)。常見的商業制備的培養基(例如酵母麥芽浸膏(YM)肉湯、LuriaBertani (LB)肉湯和Sabouraud右旋糖(SD)肉湯也可用于本發明的實施例。[0109]培養條件也是標準的，例如，培養物在搖瓶培養或發酵罐中在適當培養基中于大約28°C下進行溫育，直到達到所需的葡糖淀粉酶表達水平。在真菌生長建立后，使細胞暴露于能有效促使或允許葡糖淀粉酶的表達的條件。在葡糖淀粉酶編碼序列處于誘導型啟動子的控制下的情況中，可將誘導劑(例如糖、金屬鹽或抗微生物劑)以能有效誘導葡糖淀粉酶表達的濃度加到培養基。
[0110]通常，細胞培養物中產生的葡糖淀粉酶可分泌到培養基中，并可例如通過將不想要的組分從細胞培養基中去除來進行純化或分離。在一些情況中，葡糖淀粉酶可以細胞形式產生，這就需要從細胞裂解物中回收在此類情況下，使用本領域的技術人員通常采用的技術從產生該酶的細胞純化該酶。這些技術的例子包括但不限于親和層析(Tilbeurgh等人，1984年，《歐洲生物化學學會聯盟通訊》(FEBS Lett.),第16卷,215頁)、離子交換色譜方法(Goyal等人，1991年，《生物資源技術》(Biores.Technol.)，第36卷，第37頁；Fliess等人，1983年，《歐洲應用微生物學與生物技術雜志》(Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.),第 17 卷，第 314 頁；Bhikhabhai 等人，1984 年，《應用生物化學雜志》(J.Appl.Biochem.)，第6卷,第336頁；以及Ellouz等人，1987年，《色譜》(Chromatography)，第396卷,第307頁),包括使用具有高拆分能力的材料進行的離子交換(Medve等人，1998年，《色譜雜志A)) (J.ChromatographyA)，第808卷,第153頁)、疏水相互作用色譜(參見Tomaz和Queiroz, 1999年，《色譜雜志A》(J.Chromatography A)，第865卷,第123頁；兩相分配(參見Brumbauer等人，1999年,《生物分離》(Bioseparation),第7卷，第287頁)；乙醇沉淀；反相HPLC、在二氧化硅上或在陽離子交換樹脂如DEAE上進行的色譜、色譜聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀和凝膠過濾(例如S印hadex G-75)。
[0111]2.2.α -淀粉酶
[0112]α -淀粉酶構成一組存在于微生物和來自動植物的組織中的酶。它們能夠水解糖原、淀粉、相關多糖和一些寡糖的α-1，4-糖苷鍵。盡管所有α-淀粉酶都具有相同的催化功能，但是它們的氨基酸序 列有很大差異。不同的淀粉酶之間的序列同一性可能實質上是不存在的，例如低于25 %。盡管存在相當大的氨基酸序列變異，但是α -淀粉酶具有共同的整體拓撲學模式，該拓撲模式是在測定了來自不同物種的α -淀粉酶的三維結構后得到確定的。該共同的三維結構揭示了三個結構域:(I)稱為結構域A的“ TIM”桶，(2)稱為結構域B的長環區域，其插入于結構域A中，和(3)稱為結構域C的接近C端的區域，其含有具有Greek-key基序的特征性β _結構。
[0113]“Termamyl樣” α -淀粉酶是指一組廣泛用于淀粉加工產業的α -淀粉酶。具有美國專利N0.6，440, 716的SEQ ID NO:2氨基酸序列的地衣芽孢桿菌(Bacillus
licheniformis) α -淀粉酶以商品名Termamyl*市售。τermamyI樣α -淀粉酶通常指
芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)產生的一組高度同源的α-淀粉酶。該組的其他成員包括來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophiIus)(之前稱為脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus);這兩個名稱在本說明書中可互用)和解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的α -淀粉酶以及衍自芽抱桿菌屬NCIB12289、NCIB12512、NC皿2513和DSM9375的α -淀粉酶，所有這些在美國專利N0.6，440，716和W095/26397中有詳細描述。
[0114]盡管α-淀粉酶普遍含有上述的三個結構域，但是一些α-淀粉酶(如來自枯草芽孢桿菌的AmyE)的三維結構不同于Termamyl樣α -淀粉酶。這些酶統稱為非Termamyl樣α-淀粉酶。出于本發明的目的，“AmyE”意指來自枯草芽孢桿菌的天然α -淀粉酶(EC3.2.1.1 ;1，4- a -D-葡聚糖葡聚糖水解酶)。代表性的AmyE酶及其變體在2009年6月4日提交的美國專利申請12/478，266和12/478，368以及2009年6月5日提交的美國專利申請12/479,427中公開。
[0115]2.3.其他酶
[0116]在本發明的實施例中，在淀粉處理中的糖化和/或發酵過程中也可加入其他的酶作為補充。這些輔助性的酶可包括蛋白酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、環糊精糖基轉移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角質酶、木聚糖酶、支鏈淀粉酶和/或α -葡萄糖苷酶。參見例如W02009/099783。本領域技術人員熟知使用以上所列的酶的方法。
[0117]3.淀粉加工
[0118]3.1.淀粉底物和原料
[0119]本領域技術人員熟知可供用于制備在本文公開的過程中使用的淀粉底物的方法。例如，可用的淀粉底物可獲自塊莖、根、莖、豆類、谷類或全谷。更具體而言，顆粒淀粉來自能生產大量淀粉的植物。例如，顆粒淀粉可獲自玉米、小麥、大麥、黑麥、買羅高梁、西米、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、高粱、大米、豌豆、豆(bean)、香蕉或馬鈴薯。玉米含有約60-68%淀粉；大麥含有約55-65%淀粉；小米含有約75-80%淀粉；小麥含有約60-65%淀粉；精白米含有約70-72%淀粉。具體設想到的淀粉底物有玉米淀粉、小麥淀粉和大麥淀粉。來自谷類的淀粉可以是磨碎的或者是完整的，包括玉米固形物，如玉米籽粒、麩皮和/或穗軸。淀粉可以是來自淀粉精制過程的高度精制的生淀粉或原料。各種淀粉也可市售獲得。例如，玉米淀粉可獲自賽力斯達公司(Cerestar)、西格瑪公司(Sigma)和日本片山化學工業株式會社(Katayama `Chemical Industry C0.);小麥淀粉可獲自西格瑪公司(Sigma)；甘薯淀粉可獲自日本的和光純藥工業株式會社(Wako Pure Chemical Industry C0.);馬鈴薯淀粉可獲自日本的 Nakaari Chemical Pharmaceutical C0.。
[0120]3.2.碾磨
[0121]淀粉底物可以是來自經碾磨的全谷的粗淀粉，全谷含有非淀粉級分例如殘胚和纖維。碾磨可包括濕磨或干磨。在濕磨中，可將全谷浸泡在水或稀酸中，以將谷粒分離為其組分，例如淀粉、蛋白質、胚芽、油、籽粒纖維。濕磨能有效地分離胚芽和粗粉(即淀粉顆粒和蛋白質)，并可能尤其適合于生產糖漿。在干磨中，將全籽粒研磨成細粉并在不將谷粒分級為其組分的情況下進行加工。干磨谷粒因此除了包含淀粉外還將包含大量的非淀粉碳水化合物。大部分的乙醇來自干磨。或者，待加工的淀粉可以為高度精制的淀粉質量，例如至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99.5%純。
[0122]3.3.糊化和液化
[0123]本文所用的術語“液化”意指將淀粉轉化為粘性較小且鏈長較短的可溶性糊精的過程。該過程涉及在進行淀粉糊化的同時添加α-淀粉酶或者隨后添加α-淀粉酶。可任選地添加另外的液化誘導酶，如植酸酶。
[0124]在一些實施例中，可將如上所述制備的淀粉底物用水調成漿液。淀粉漿液含有的淀粉以干物質重量百分比計可為約10-55%、約20-45%、約30-45%、約30-40%或約30-35%。為優化α -淀粉酶穩定性和活性，可將漿液的pH調整至α-淀粉酶的最適pH。液化后在漿液中剩余的α -淀粉酶可通過在后一反應步驟中降低PH或者通過從漿液移除鈣來使其失活。
[0125]可將淀粉加α -淀粉酶的漿液連續泵送經過噴射蒸煮器，該噴射蒸煮器可被蒸汽加熱到約85°C至最高約105°C。在這些條件下糊化發生得非常快，并且酶活性與極大的剪切力相結合開始淀粉底物的水解。在噴射蒸煮器中的停留時間可非常短暫。可使經部分糊化的淀粉穿過維持在約85-105°C下的一系列保持管并保持約5分鐘以完成糊化過程。這些罐可具有擋板以阻止回流混合。本文所用的術語“第二液化”指跟在第一液化后面的液化步驟，此時讓漿液冷卻到室溫。這個冷卻步驟可為約30分鐘至約180分鐘，如約90分鐘至120分鐘。經碾磨和液化的谷粒也被稱為醪液。
[0126]34 糖化
[0127]在液化后，可將醪液通過糖化進一步水解為在下游應用中可容易使用的高密度葡萄糖漿。本發明實施例的糖化可通過使用如上所述的葡糖淀粉酶在5.2至5.6范圍內的pH下進行。葡糖淀粉酶的用量可在約0.15至2.0GAU/g dss (干物質淀粉)、約0.20至1.5GAU/g dss或1.0至1.5GAU/gdss的范圍內。糖化可在約58°C至約62°C下進行。
[0128]完整的糖化步驟通常可在24至96小時、24至72小時或24至48小時的范圍內。
[0129]3.5.發酵
[0130]在本發明的一些實施例中，可使可發酵糖經歷分批或連續發酵條件。傳統的分批發酵是在封閉系統中進行，其中培養基的組成在發酵開始時設定，并且在發酵過程中不進行人為改變。因此， 在發酵開始時，可用所需的生物體接種培養基。在這個方法中，可在不向系統中添加任何組分的情況下讓發酵進行。通常，分批發酵是就添加碳源而言謂之“分批”，而常常會嘗試對諸如PH和氧濃度的因素進行控制。直到發酵停止之時，分批系統的代謝物和生物量組成都不斷地變化。在分批培養物內，細胞經靜息遲滯期進入高速對數生長期，最終到達生長速率降低或停止的穩定期。穩定期的細胞如果不加以處理就會最終死亡。一般而言，是對數期的細胞導致終產品的大量產生。
[0131]標準分批系統的一種變型是“補料分批發酵”系統，其可在本發明的一些實施例中使用。在典型的分批系統的這個變型中，可隨著發酵的進行以增量的形式添加底物。在分解代謝物阻遏傾向于抑制細胞的代謝時和在需要在培養基中具有有限量的底物的情況下，補料分批系統特別有用。補料分批系統中實際底物濃度的測量可能是困難的，因此根據諸如pH、溶氧、廢氣(如CO2)分壓的可測量因素的變化進行估計。分批發酵和補料分批發酵都是本領域普通且公知的。
[0132]另一方面，連續發酵是開放系統，其中限定的發酵培養基可連續添加到生物反應器，并可同時移取等量的經調理的培養基進行加工。連續發酵通常以恒定的高密度維持培養物，其中細胞主要處于對數生長期。連續發酵使得可以調節影響細胞生長和/或終產品濃度的一個因素或多個因素。例如，在一個實施例中，可以以固定的速率維持限制性營養物如碳源或氮源，同時讓所有其他參數調節。在其他系統中，可連續地改變多個影響生長的因素，同時可保持細胞濃度(通過培養基濁度測量)恒定。連續系統旨在維持穩態生長條件。因此，必須使由于移取培養基導致的細胞損失與發酵中的細胞生長速率保持平衡。調節連續發酵過程的營養物和生長因子的方法以及使產物形成速率最大化的技術是工業微生物學領域公知的。
[0133]在另外的實施例中，通過使用本領域知道的適當發酵微生物，發酵終產品可包括但不限于酒精、1，3_丙二醇、琥珀酸、乳酸、氨基酸、蛋白質、功能性寡糖以及它們的衍生物。參見例如W02008/086811(甲醇、乙醇、丙醇和丁醇發酵)；W02003/066816、美國專利N0.5，254，467 和 N0.6，303，352 (1,3-丙二醇發酵);美國專利 N0.RE37, 393,N0.6，265，190和 N0.6，596，521 (琥珀酸發酵);美國專利 N0.5，464，760、W02003/095659 ；Mercier 等人，《化工技術與生物技術雜志》(J.Chem.Tech.Biotechnol)，第55卷，第111-121頁；Zhang和 Cheryan,《生物技術通訊》(Biotechnol.Lett.),第 13 卷，第 733-738 頁，1991 年；Linko和 Javanainen,《酶微生物技術》(Enzyme Microb.Technol.),第 19 卷，第 118-123 頁，1996年；以及Tsai和Moon,《應用生物化學與生物技術》(Appl.Biochem.Biotechnol.)，第 70-72 卷，第 417-428 頁，1998 年(乳酸發酵);美國專利 N0.7，320，882,N0.7，332，309、N0.7, 666, 634 ；以及Zhang等人，《應用微生物學與生物技術》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，第77卷，第355-366頁，2007年(各種氨基酸的發酵)。
[0134]以上列舉的列表僅為例子，本領域的技術人員將會知道多種可適當地用于獲得所需終產物的發酵微生物。
[0135]實M
[0136]實例1:使用灰腐質霉葡糖淀粉酶的單PH液化和糖化
[0137]評估灰腐質霉葡糖淀粉酶(HgGA)在5.6的pH下不進行pH調節時水解淀粉底物(液化物)的能力。使用CLEARFLCTW?AA(美國丹尼斯克有限公司杰能科子公司(Danisco US Inc., Genencor Division))按照常規的工作臺烹飪過程液化玉米淀粉,獲得具有DElO的液化物。將 液化物(35% DS) “按原樣”放置在50ml玻璃燒瓶中，在不進行PH調節的情況下使存在于液化物(即α-活性液化物)中的α-淀粉酶失活。在存在OPTIMAX? L-1000支鏈淀粉酶(I 129ASPU/g)的情況下，使用HgGA，通過使玻璃燒瓶在水浴中在60°C下溫育69.5小時而執行液化物的糖化。按以下劑量使用HgGA:0.18GAU/g ds、0.16GAU/g ds和0.14GAU/g ds。在不同的時間間隔提取0.5ml糖化反應混合物的樣品，將其與4.5ml的RO水混合，并通過0.2 μ m Whatman過濾器過濾。然后將樣品放入樣品瓶中并使其經受HPLC分析。使用配有Bio-Rad?脫灰保護柱的Rezex RCM-單糖色譜柱進行HPLC分析。糖化反應混合物中多種糖的組成在表1中呈現。
[0138]表1:糖化期間糖的組成。
[0139]
【權利要求】
1.一種在存在葡糖淀粉酶且不進行PH調節的情況下處理淀粉的方法，所述方法包括將淀粉底物糖化為葡萄糖，其中糖化在PH5.2至5.6以及約58°C至約62°C范圍內的溫度下進行，其中所述葡糖淀粉酶選自包含SEQ ID NO:3的親本灰腐質霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)及其變體，其中所述變體與所述親本葡糖淀粉酶具有至少99%的同一性。
2.根據權利要求1所述的方法，其中糖化在存在支鏈淀粉酶的情況下進行。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中與所述親本葡糖淀粉酶相比，所述變體葡糖淀粉酶具有至少一個氨基酸修飾。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶為具有SEQID NO:3的氨基酸序列的HgGA。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶在里氏木霉(Trichoderma reesei)宿主細胞中制備。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶以至少約0.15GAU/克干物質淀粉的劑量添加。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶以至少約0.20GAU/克干物質淀粉的劑量添加。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中糖化在pH5.35至5.5下進行。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述淀粉底物為液化淀粉。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中糖化在約70小時達到至少95%的DPl濃度。
11.根據權利要求1至10中任一項所述的方法，其中所述淀粉底物為約30%至約50%干固體(DS) ο
12.根據權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述淀粉底物為約30%至約35%干固體(DS) ο
13.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述淀粉底物為顆粒淀粉。
14.根據權利要求13所述的方法，其中糖化在約28小時達到至少95%的DPl濃度。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述淀粉底物的淀粉溶解度為至少90%。
16.根據權利要求13所述的方法，其中糖化在約50小時達到至少96%的DPl濃度。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述淀粉底物的淀粉溶解度為至少97%。
18.根據權利要求16或權利要求17所述的方法，其中所述高級糖的含量低于I%。
19.根據權利要求13至18中任一項所述的方法，其中所述淀粉底物為約28%干固體(DS)。
【文檔編號】C12N9/24GK103732756SQ201280020947
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年4月27日 優先權日:2011年4月29日
【發明者】S·H·李, J·K·謝提, P·J·M·特尼森 申請人:丹尼斯科美國公司