草甘膦抗性的增強的制作方法

草甘膦抗性的增強的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于提高植物的草甘膦抗性的新方法。該方法包括在該植物的特定核苷酸序列中提供一個或多個特定突變。與沒有根據該方法處理的植物相比，通過該方法獲得的植物表現（提高的）草甘膦抗性。還提供了（轉基因）植物，包括其種子，和根據本發明的方法可以獲得的植物產品。
【專利說明】草甘膦抗性的增強【技術領域】
[0001]本發明涉及一種提供抗草甘膦植物和/或增強植物的草甘膦抗性的方法。該方法包括給植物提供編碼包含特定突變的EPSPS酶的核苷酸序列。與未經修飾的植物相比，通過該方法獲得的該植物顯示了(改善的)草甘膦抗性。本發明還提供了(轉基因)植物，包括其種子，和通過本發明的方法可獲得的植物產品。
【背景技術】
[0002]草甘膦(N-膦酰基甲基-甘氨酸)是農達(Round Up)中的活性成分且是最常用的除草劑。其用于農業、園藝和林業中。通常其被噴灑并通過葉子吸收。
[0003]草甘膦廣泛地作用于植物品種，且通過抑制5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(enzyme 5-eno/pyruvylshikimate_3-phosphate synthase,EPSPS)起作用，該酶是莽草酸途徑中的一種關鍵酶，對芳香族氨基酸的生產至關重要。草甘膦的化學結構與天然EPSPS酶底物磷酸烯醇丙酮酸鹽(PEP)的化學結構相似，因此其與PEP競爭酶活性作用位點。對EPSPS的抑制擾亂了氨基酸的合成，并因此殺死受影響的植物細胞。草甘膦是非選擇性的，它既除草又殺死農作物。
[0004]草甘膦作為除草劑普及的部分原因是由于其對動物的毒性低。該莽草酸途徑只在植物和細菌中發現。孟山都公司(Monsanto)最初在1970年代取得草甘膦專利。
[0005]對某些細菌能在草甘膦中存活的觀察結果使人們發現一些細菌EPSPS酶對草甘膦不敏感。這引起了對表達這些抗草甘膦細菌EPSPS酶的Monsanto轉基因耐草甘膦作物(Round Up Ready crops)的研發。
[0006]目前的耐草甘膦`作物(Round Up Ready crops)包括大豆、玉米、高粱、卡諾拉(canola)、苜蓿、棉花和甜菜。這些作物極大地改進了農民控制雜草的能力，因為可以將草甘膦噴灑在田間而不會嚴重影響農作物。自2005年起，87%的美國大豆田種上了抗草甘勝作物(National Agriculture Statistics Service (2005) in Acreage eds.Johanns, M.&ffiyatt, S.D.6 30, (U.S.Dept, of Agriculture, Washington, DC))0
[0007]然而，據發現，耐草甘膦大豆作物與優良的傳統品種相比，產量降低6.7%(CharlesBenbrook.Evidence of the Magnitude and Consequences of the Roundup ReadySoybean Yield Drag from University-Based Varietal Trials in 1998.Ag BioTechInfoNet Technical Paper Number I (1998年高校主導的品種試驗中耐草甘膦大豆產量的量和結果的證明))。賦予植物草甘膦抗性可能涉及該植物的大量的適宜性成本。這樣的適宜性成本可能接近于農作物產量的降低，也可能隨時間的推移表現為生物量積累下降。
[0008]已發現在田間條件下賦予植物草甘膦抗性的一種重要突變是單核苷酸變化，即將EPSPS酶中位置106的脯氨酸變為亮氨酸(P106L)。全世界許多雜草種類已獨立地發生這種突變，但是到目前為止，還沒有在EPSPS中發現其他自發性突變(Baerson et al.PlantPhysiol, July 2002，Vol.129，pp.1265-12752002)。Gassert et al.(J.Biol.Chem Vol263(9)pp4280-4289)描述了矮牽牛花和番茄的5-烯醇丙酮酸莽草酸_3_磷酸合成酶基因的結構、表達和演變。
[0009]需要識別在提供賦予草甘膦的(改善的)抗性的EPSPS酶方面有用的進一步的突變，以及攜帶這種突變和/或表達這種酶的植物，因此該植物能夠在存在(增長水平的)草甘膦的條件下生長。與現有技術的植物，包括抗草甘膦植物相比，這些植物能夠在存在更高濃度的草甘膦的條件下生長，或者與現有技術的植物，包括抗草甘膦植物相比，在存在相似濃度的草甘膦的條件下表現增強的生長。
[0010]此外，還需要識別進一步增強現有技術的抗草甘膦植物的草甘膦抗性的突變或者優選地降低與現有技術的抗草甘膦植物的草甘膦抗性相關的適宜性成本的突變。
[0011]本發明的目的是提供上述需要的至少一種。

【發明內容】

[0012]定義
[0013]在以下的描述和實例中使用了大量術語。為了對包括這些術語給定的范圍的說明書和權利要求書有清楚一致的理解，給出以下定義。除非本文另有定義，否則所有技術術語和科學術語的含義與本發明所屬【技術領域】的普通技術人員通常理解的含義相同。所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻的全部內容通過引用結合到本文中。
[0014]除非本文中另有清楚地說明，本文中使用的單數形式“一個/種(a) ”、“一個/種(an)”和“該(the)”包括多個所指物。例如，如上面所使用的，一種分離“一個” DNA分子的方法，包括分離多個分子(如數十個、數百個、數千個、數萬個、數十萬個、數百萬個或更多分子)。
[0015]實施本發明的方法中使用的傳統技術的方法，對本領域技術人員應當是顯而易見的。分子生物學、生物化學、計算化學、細胞培養、重組DNA、生物信息學、基因組學、測序和相關領域中的傳統技術的實踐為本領域技術人員所熟知，并且在例如以下的參考文獻中論述:分子克隆(Sambrook et al., Molecular Cloning.A Laboratory Manual, 2ndEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N.Y.，1989);現有分子生物學技術(Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology, JohnWiley&Sons, New York, 1987 and periodic updates);和系列方法(the series Methodsin Enzymology Academic Press,San Diego)。
[0016]“栽培植 物”和“野生植物”分別指的是為了有利的農學特征已被人類培植的植物和野外大自然中發現的植物。在后者中發現的基因和等位基因還稱為“野生型”。然而，相對于EPSPS基因，在“栽培植物”和“野生型植物”中存在的基因稱為“野生型基因”。這些野生型基因在植物中表達至通常在這些植物中發現的說明，并不提供“抗草甘膦”EPSPS，而是提供“對草甘膦敏感的” EPSPS (見下文)。
[0017]“核酸構建”或者“載體”在本文中應理解為，使用重組DNA技術產生的人造核酸分子，并且其用來將外源DNA運送到宿主細胞。該載體骨架可以是例如雙元或者超雙元載體(參見例如US5591616，US2002138879和W095/06722)，共整合載體或者T-DNA載體，如本領域所知和本文別處描述的那樣，可以將嵌合基因整合到上述載體中，或者當已存在合適的轉錄調控序列時，只將期望的核酸序列(如編碼序列、反義序列或者反向重復序列)整合到該轉錄調控序列的下游。載體通常還包含遺傳元件如選擇性標記、多克隆位點等以促進它們在分子克隆中的使用。
[0018]本文使用的“抗草甘膦” EPSPS指的是EPSPS，其在植物細胞中的表達賦予該植物細胞以草甘膦抗性。如果以在這些植物中通常發現的水平在植物細胞中表達即沒有引起過度表達時，沒有賦予草甘膦抗性，那么EPSPS是“對草甘膦敏感的”。
[0019]本文使用的“抗草甘膦”細胞或者植物指的是在存在通常殺死或者抑制其它細胞或者植物的生長的一定濃度的草甘膦存在的條件下能夠存活或者繼續生長的細胞或者植物。生長包括例如光合作用、根的增多、高度的增加、重量的增加或者新葉的發育。
[0020]例如，當賦予植物草甘膦抗性時，EPSPS是抗草甘膦的。如在EPSPS同樣的表達水平下，在比不攜帶該抗草甘膦EPSPS的植物停止生長或者死亡的草甘膦水平高至少5%、10%、20%、30%或者40%草甘膦水平下，攜帶該抗草甘膦EPSPS的植物繼續存活或生長。 [0021]在一個實施方案中，抗草甘膦(植物)細胞可以在含50μΜ (或50mg/l)或者更多草甘膦的培養基上生長和分裂，優選地，抗草甘膦細胞可以在含100 μ M (或100mg/l)或者更多如 200 μ M (或 200mg/l)、300yM (或 300mg/l)或者 400 μ M (或 400mg/l)草甘膦的培養基上生長和分裂。甚至更優選地，抗草甘膦細胞可以在含500 μ M (或500mg/l)或者更多如600μΜ (或600mg/l)草甘膦的培養基上生長和分裂。就本發明的目的，術語“草甘膦”包括N-膦酰基甲基甘氨酸(包括其任何鹽)的任何除草劑有效形式和引起植物中草甘膦陰離子產生的其它形式。
[0022]“草甘膦抗性”，如本申請中定義的，在本領域一般指的是草甘膦耐受性。
[0023]與蛋白(或者變體如直系同源物或者突變體，以及片段)相關的“功能性的”指的是該基因和/或編碼蛋白通過修飾(如通過過度表達或者沉默)植物中該基因的表達水平來修飾(定量和/或定性的)特征的能力。例如，由植物種類X獲得的推定蛋白質的功能性可以通過多種方法來測試。優選地，如果該蛋白是功能性的，使用例如基因沉默載體沉默編碼植物種類X中該蛋白的基因，將導致該特征的降低或抑制，而在易感植物中的過度表達將導致提高的抗性。并且，與功能性蛋白的互補將能恢復或者賦予該特征。熟練技術人員在測試功能性方面沒有困難。
[0024]術語“基因”指包含區域(轉錄域)的DNA序列，其被轉錄為細胞中的可操作地連接至合適的調控區(如啟動子)的RNA分子(如，mRNA)。因此基因可能包含幾個可操作地連接的序列，如啟動子、包含例如包含與翻譯起始相關的序列的5'前導序列、(蛋白)編碼區(cDNA或者基因組DNA)和包含例如轉錄終止位點的3'非翻譯序列。“基因的表達”指的是這樣的過程，其中可操作地連接至合適的調控區具體為啟動子的DNA區域轉錄為RNA的過程，該RNA是有生物活性的RNA，即其能被翻譯成生物活性蛋白或者肽(或者活性肽片段)或其本身有活性(例如在轉錄后的基因沉默或RNAi中)。某些實施方案中的活性蛋白指的是具有組成活性的蛋白。該編碼序列優選地位于有義方向并編碼期望的生物活性蛋白或者肽或者活性肽片段。在基因沉默方法中，該DNA序列優選以反義DNA或者反向重復DNA的形式存在，包括位于反義方向或者有義和反義方向的靶基因的短序列。“異位表達”指的是基因在其中一般不表達的組織中的表達。
[0025]本文公開的核酸可以包括嘧啶堿基和嘌呤堿基的任何多聚物或者低聚物，嘧啶堿基和嘌呤堿基分別優選為胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鳥嘌呤(參見生物化學原理(Albert L.Lehninger, Principles of Biochemistry, at 793-800 (Worth Pub.1982)，其全部內容通過引用結合到本文中)。本公開預期了任何脫氧核苷酸、核苷酸或者肽核酸組成，以及其任何化學變體，如這些堿基的甲基化、羥甲基化或者糖基化形式等等。這些多聚物或者低聚物在組合物中可以是異源的或者同源的，可以從天然存在的來源中分離，或者可以是人造的或合成的。因此術語“分離的”指從天然來源中或者人造的或合成的中分離。例如核苷酸序列可以通過將其克隆進宿主有機體如BAC克隆來分離。通常，當分離核苷酸序列時，它包含該核苷酸序列的至多500，優選地至多250，更優選地至多100，更優選地至多50或者最優選地至多20個連續的核苷酸，其自然直接地位于現在分離的核苷酸序列兩偵U。另外，該核酸可以是DNA或者RNA，或者其混合物，且可能是以單鏈或雙鏈形式永久地或過渡地存在，包括同源雙鏈、異源雙鏈或混合態。
[0026]本發明的植物包括葫蘆科(ucurbitanceae)、禾本科(Graminaeae)、爺科(Solanaceae)或者菊科(Asteraceae)、玉米(玉蜀黍屬(Compositae))、小麥(小麥屬(Zea)種類)、大麥(如大麥芽(Hordeum vulgare))、燕麥(如野燕麥(Avena sativa))、高粱(Sorghum bicolor)、黑麥(黑麥(Secale cereal))、大豆(大豆屬(Glycine)種類，如大豆(G.max))、棉花(棉屬(Gossypiun)種類，如 G.hirsutum,海島棉(G.barbadense))、蕓苔屬(Brasscia)種類(如甘藍型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.juncea)、甘藍(B.0leracea)、白菜型油菜(B.rapa)等)，向日葵(向日葵(Helianthus annus))、紅花、山藥、木薯、紫苜猜(Medicago sativa)、水稻(稻屬(Oryza),如秈稻栽培品種組(0.sativaindica cultivar-group)或粳稻品種組(japonica cultivar-group))、飼草、狼尾草(狼尾草屬(Pennisetum)種類，如狼尾草(P.glaucum))、樹種(松屬(Pinus)、白楊、冷杉、車前草等)、茶樹、咖啡屬、油棕、椰子、蔬菜如豌豆、西葫蘆、豆(如菜豆屬(Phaselolus))、辣椒、黃瓜、朝鮮薊、蘆筍、茄子、西蘭花、大蒜、韭、生菜、洋蔥、蘿卜、大頭菜、番茄、馬鈴薯、球芽甘藍(Brussels sporuuts)、胡蘿卜、花椰菜、菊苣、芹菜、菠菜、萵苣菜、茴香、甜菜、結肉果植物(葡萄、桃子、李子、草莓、芒果、蘋果、梅子、櫻桃、杏、香蕉、黑莓、藍莓、柑橘、奇異果、無花果、檸檬、酸橙、油桃、覆盆子、西瓜、桔子、葡萄柚等)、觀賞樹種(如玫瑰(Rose)、矮牽牛(Petunia)、菊花(Chyrsanthemum)、百合花(Lily)、非洲菊(Gerbear))、草本植物(簿荷、荷蘭芹、羅勒屬植物、百里香`等)、木本樹(如楊樹屬、柳屬、櫟屬、桉屬)、纖維種類如亞麻(亞麻(Linum usitatissimum))和大麻(大麻(Canabis sativa)),以及其它。
[0027]“重組植物”或者“重組植物部分”或者“轉基因植物”是指植物或者植物部分(例如，種子或果實或葉子)，其包含所有細胞和植物部分里在同一位點的嵌合基因，即使該基因可能不在所有細胞中表達。
[0028]術語“測序”指的是確定核酸樣品例如DNA或者RNA中核苷酸的順序(堿基序列)。可采用許多技術如桑格(Sanger)測序和454或者Solexa技術提供的新一代測序技術。
[0029]SEQ ID NO: 1-8以圖1所示的EPSPS的相關區域為基礎:玉米(SEQ ID N0:1)，水稻(SEQ ID N0:2)、小麥(SEQ ID N0:3)，番茄(SEQ ID NO:4)、擬南芥(SEQ ID N0:5)、洋蔥(SEQID N0:6)、沙門氏菌(SEQ ID NO:7)和大腸桿菌(SEQ ID N0:8)。相對于 SEQ ID NO: 1-8 ψ任一序列和圖1所示的相應序列之間的任何非預定差異，特此注明，圖1中所示的序列是主要的，應該作為任何非預定差異的修正基礎。
[0030]全文中的氨基酸可以使用以下常見縮寫。
[0031]Ala A丙氣酸
Arg R精氨酸
Asn N天冬酰胺
Asp D天冬氨酸(天冬氨酸鹽)
Cys C半胱氨酸
Gln Q谷氨酸鹽
Glu E谷氨酸(谷氨酸鹽)
Gly G甘氨酸
[0032]
His H組氨酸
IIe I異亮氨酸
Leu L亮氨酸
Lys K賴氨酸
Met M蛋氨酸
Phe F苯丙氨酸
Pro P脯氨酸
Ser S絲氨酸
Thr T蘇氨酸
Trp W色氨酸
Tyr Y酪氨酸
Val V纈氨酸
Asx B天冬氨酸或者天冬酰胺
Glx Z谷氨酸鹽或者谷氨酸
Xaa X任何氨基酸(有時用于指任一氨基酸)
[0033]詳細說明
[0034]本發明涉及在與位置44的氨基酸的變化相對應的EPSPS編碼序列中的新識別的突變，如圖1所示。在優選的實施方案中，這個變化與所述EPSPS編碼序列中的至少一個進一步的突變相組合，優選地，與選自由101、106或者179組成的組中的位置的氨基酸的變化相對應的進一步的突變相組合，如圖1所示。正如本領域技術人員所清楚了解的，圖1示出了缺少葉綠體引導信號的成熟蛋白質，而其它的圖示出了包括這種引導信號的完整蛋白質。因此，例如按照圖1的數據通過比對各種EPSPS基因的序列，本領域技術人員可以毫無問題地確定編碼EPSPS酶的核苷酸序列或EPSPS酶的氨基酸序列中本發明的相應位置和突變。[0035]在用各種植物材料進行實驗的過程中，包括原生質體，例如含有番茄原生質體，得到能夠在含草甘膦的培養基上生長的植物材料如胼胝，并且該植物材料如胼胝在維持生長的同時還表現了對這種除草劑的抗性。[0036]使用熟練技術人員可用的方法對來自不同抗草甘膦材料的EPSPS基因測序。在E P S P S的編碼區域中鑒定出一種新的意料之外的突變，遺傳材料中的該突變導致編碼的EPSPS酶中位置44的氨基酸改變，如圖1所示。據發現，攜帶這種突變的植物(細胞)表現出(提高的)草甘膦抗性。事實上，甚至更令人驚訝的是，據發現，通過引入存在于該植物中的EPSPS編碼序列中位置44的上述鑒定的突變可以進一步增強植的現有草甘膦抗性。例如，特別是，如圖1所示，可以通過引入引起位置44的氨基酸改變的突變，進一步增強表達EPSPS編碼序列的植物的草甘膦抗性，該EPSPS編碼序列通過具有引起原EPSPS酶中的選自由101、106或者179組成的組中的位置的氨基酸改變的突變來賦予草甘膦抗性。換句話說，該新鑒定的突變可以有利地被用來增強賦予EPSPS酶中其它和已知的突變的草甘膦抗性。[0037]因此本發明的某些方面涉及與特定位置的氨基酸改變相對應的EPSPS編碼序列中四種不同的突變。總之，這些突變在下文中稱為突變A、B、C和D。[0038]突變A[0039]EPSPS編碼序列中的第一突變稱為突變A，并且其引起該EPSPS酶中位置44的氨基酸改變，如圖1所示，例如與沒有該突變的相同的EPSPS酶相比引起草甘膦抗性。例如，且優選地，由于EPSPS編碼序列中的突變引起變化的位置44的氨基酸是天冬酰胺(N)，如圖1所示的植物氨基酸序列中所示(換句話說，根據本發明，位置44的原始氨基酸將被改變，且該原始氨基酸可以是天冬酰胺)。因此，優選地，該突變導致EPSPS編碼序列中位置44的氨基酸不是天冬酰胺(N)。[0040]根據本發明，盡管位置44的氨基酸優選天冬酰胺(N)可以改變為任何其它的氨基酸，只要其有利于提供草甘膦抗性方面，但優選地，該EPSPS編碼序列包含引起位置44的氨基酸優選天冬酰胺改變為天冬氨酸(D)的突變，如圖1所示。[0041]因此，在優選的實施方案中，該EPSPS編碼序列編碼EPSPS酶，其中位置44的氨基酸是天冬氨酸(D )，獨立于之前存在于該位置的氨基酸。[0042]突變B[0043]第二突變(可以把這個突變稱為突變B)引起EPSPS酶中位置101的氨基酸改變，如圖1所示，例如與沒有該突變的相同的EPSPS酶相比帶來草甘膦抗性。例如，且優選地，由于EPSPS編碼序列中的突變引起變化的位置101的氨基酸是甘氨酸(G)，如圖1所示的植物氨基酸序列所示(換句話說，根據本發明，位置101的原始氨基酸將被改變，且該原始氨基酸可以是甘氨酸)。因此，優選地，該突變導致EPSPS編碼序列中位置101的氨基酸不是甘氨酸(G)。在圖17的大腸桿菌(E.coli)EPSPS氨基酸序列中，突變B與位置96的氨基酸的改變相對應。[0044]盡管位置101的氨基酸優選甘氨酸(G)可以改變為任何其它的氨基酸，只要其有利于提供草甘膦抗性，但優選地，該EPSPS編碼序列包含引起位置101的氨基酸優選甘氨酸改變為丙氨酸(A)的突變，如圖1所示。
[0045]因此，在優選的實施方案中，該EPSPS編碼序列編碼EPSPS酶，其中位置101的氨基酸是丙氨酸(A)，獨立于之前存在于該位置的氨基酸。
[0046]該GlOlA突變的結構顯示，位置101的丙氨酸在空間上阻礙草甘膦與PEP結合位點的結合，其伴隨有PEP Km的相應增長(參見:Eschenburg, S., Healy, M.L., Priestman, Μ.A Lushington, G.H.and Schonbrunn, Ε.(2002)How the mutation glycine 96 to alanineconfers glyphosate insensitivity to5~enolpyruvyI shikimate-3-phosphatesynthase from Escherichia coli (甘氨酸96到丙氨酸的突變如何賦予來自大腸桿菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶以草甘膦不敏感性).Planta 216，129-135。
[0047]突變C
[0048]第三突變(可以把這個突變稱為突變C)引起EPSPS酶中位置106的氨基酸改變，如圖1所示，例如與沒有該突變的相同的EPSPS酶相比帶來草甘膦抗性。例如，且優選地，由于EPSPS編碼序列中的突變引起變化的位置106的氨基酸是脯氨酸(P)，如圖1所示的植物氨基酸序列所示(換句話說，位置106的原始氨基酸可以是脯氨酸，且可以改變該原始氨基酸)。因此，優選地，該突變導致EPSPS編碼序列中位置106的氨基酸不是脯氨酸(P)。
[0049]盡管位置106的氨基酸，優選脯氨酸(P)，可以改變為任何其它的氨基酸，只要其有利于提供草甘膦抗性 ，但優選地，該EPSPS編碼序列包含引起位置106的氨基酸優選脯氨酸改變為亮氨酸(L)的突變，如圖1所示。
[0050]因此，在優選的實施方案中，該EPSPS編碼序列編碼EPSPS酶，其中位置106的氨基酸是亮氨酸(L)，獨立于之前存在于該位置的氨基酸。
[0051]突變D
[0052]第四突變(其是新鑒定的，可以把這個突變稱為突變D)引起EPSPS酶中位置179的氨基酸改變，如圖1所示，例如與沒有該突變的相同的EPSPS酶相比帶來草甘膦抗性。例如，且優選地，由于EPSPS編碼序列中的突變引起變化的位置179的氨基酸是絲氨酸(S)，如圖1所示的植物氨基酸序列中所示(換句話說，位置179的原始氨基酸可以是絲氨酸，且可以改變該原始氨基酸)。因此，優選地，該突變導致EPSPS編碼序列中位置179的氨基酸不是絲氨酸(S)。
[0053]盡管位置179的氨基酸，優選絲氨酸(S)，可以改變為任何其它的氨基酸，只要其有利于提供草甘膦抗性，但優選地，該EPSPS編碼序列包含引起位置179的氨基酸優選絲氨酸改變為天冬酰胺(N)的突變，如圖1所示。
[0054]因此，在優選的實施方案中，該EPSPS編碼序列編碼EPSPS酶，其中位置179的氨基酸是天冬酰胺(N)，獨立于之前存在于該位置的氨基酸。
[0055]圖1到22中的任一圖示出了各種生物體的EPSPS酶的各種序列(氨基酸或者編碼這種氨基酸的核酸)；在圖4-22中的大部分圖中，在圖1中稱為44、101、106和179的氨基酸位置用下劃線標明。本領域技術人員應該理解，參考圖1，本文所描述的突變可以存在于或者引入任何生物體的任何EPSPS編碼序列和/或EPSPS酶中相應的位置，如圖中所示的那些位置。通過對比圖1所示的序列，很容易確定其它序列中的相應位置。這可以通過以下步驟來完成:從相關生物體(特別是植物)取得EPSPS蛋白序列，與擬南芥(A.thaliana)蛋白進行比對，以及鑒定對應于N44、G101、P106和S179的氨基酸位置。圖4所示的序列進一步包括葉綠體引導信號；圖1示出缺少該葉綠體引導信號的成熟蛋白質。
[0056]在第一方面，本發明提供了編碼EPSPS酶優選植物EPSPS酶的(分離的)核苷酸序列，所述酶賦予植物(細胞)草甘膦抗性，其特征在于該核苷酸序列包含與位置44的氨基酸的變化相對應的至少一個突變，如圖1所示。
[0057]相應地，該EPSPS編碼序列中位置44的氨基酸優選不是天冬酰胺(N)。
[0058]優選地，在位置44發生改變的氨基酸是天冬酰胺。優選地，位置44的氨基酸改變為等電位點(Pl)為3.50或以下的蛋白氨基酸，是天冬氨酸或谷氨酸，優選天冬氨酸。換句話說，根據本發明，EPSPS酶中位置44的氨基酸(提供草甘膦抗性)優選是天冬氨酸或者谷氨酸，優選天冬氨酸。
[0059]優選地，所述變化與野生型EPSPS酶相比較，例如從草甘膦抗性被引入和/或增強的植物中獲得的野生型EPSPS酶。
[0060]人們發現，如圖1所示位置44的這種特定氨基酸(改變為等電位點(pi)為3.50或以下的的蛋白氨基酸，是天冬氨酸或谷氨酸，優選天冬氨酸)相對于由所得的EPSPS酶賦予的草甘膦抗性呈現有利的結果，和/或與相應的野生型EPSPS或者位置44的氨基酸是除天冬氨酸或者谷氨酸以外的其它氨基酸的EPSPS酶相比，得到對其正常底物有改善活性的EPSPS 酶。
[0061]因此，攜帶該核苷酸序列的植物(細胞)，例如通過改變所述植物中存在的原始序列，可以表現(增強的)草甘膦抗性。在本發明的內容中，植物(細胞)的草甘膦抗性指所述植物(細胞)在存在通常殺死 或抑制野生型植物(細胞)的一定濃度的草甘膦的條件下存活或繼續生長的能力。優選地，在這樣的情況下所述植物(細胞)維持正常的或僅略微降低的生長(例如，不到20%的質量積累)。
[0062]增強植物(細胞)的草甘膦抗性，指在存在高于通常抑制植物(細胞)存活和/或生長的草甘膦濃度例如不攜帶抗草甘膦EPSPS的草甘膦濃度的條件下，賦予所述植物(細胞)存活或者繼續生長的能力。這提供了草甘膦抗性增強的植物(細胞)。換句話說，對草甘膦表現一定水平的抗性的植物，例如由于突變的存在，由于位置44的突變的存在可以表現出對更高濃度草甘膦的抗性。
[0063]例如，如果參照抗草甘膦植物(細胞)僅可以在最多含50 μ M (或50mg/l)草甘膦的培養基上生長，那么草甘膦抗性增強的植物(細胞)可以在含有大于50 μ M (或50mg/l)草甘膦的培養基上生長，例如55 μ M (或55mg/l)的草甘膦或更高，如100 μ M (或100mg/l)、200 μ M O^ 200mg/l)* 300yM (或300mg/l)草甘膦。如果參照抗草甘膦植物(細胞)可以在含100 μ M (或100mg/l)草甘膦的培養基上生長，那么草甘膦抗性增強的植物(細胞)可以在含有大于100 μ M (或100mg/l)草甘膦的培養基上生長，例如110 μ M (或110mg/l)的草甘膦或更高，如 200 μ M (或 200mg/l)、300yM (或 300mg/l)或 400 μ M (或 400mg/l)草甘膦。可以通過引入引起如圖1所示位置44的氨基酸變化的突變來該植物(細胞)在草甘膦濃度增加的情況下的生長能力，優選地改善的EPSPS酶中的氨基酸是天冬氨酸。
[0064]在本發明的內容中，生長包括例如光合作用、根的增長、高度的增加、質量的增加、新葉發育、作物生長和/或作物產量的增加。以下詳細闡述實施例。
[0065]然而，植物(細胞)的草甘膦抗性增強也可以指植物在存在特定濃度草甘膦的條件下，與該植物(細胞)在存在所述濃度的草甘膦下通常表現的存活和/或生長相比，提高的存活和/或增加的生長。換句話說，對草甘膦表現一定水平的抗性的植物，例如由于突變的存在，正如本文詳述的，由于位置44的突變的存在，在存在特定濃度的草甘膦的條件下將顯不提聞的存活或者生長。
[0066]例如，如果在含50 μ M(或50mg/l)草甘膦的培養基上生長的參照抗草甘膦植物(細胞)顯示50天后存活率為90%和每50天100g干重的生長率,那么在含50 μ M (或50mg/l)草甘膦的培養基上生長的具有提高的草甘膦抗性的植物(細胞)可以顯示增加的存活和/或生長。同等地，如果在含100 μ M (或100mg/l)草甘膦的培養基上生長的參照抗草甘膦植物(細胞)顯示特定的存活率和特定的生長率，那么在含100 μ M (或100mg/l)草甘膦的培養基上生長的具有增強的草甘膦抗性的植物(細胞)可以顯示增加的存活和/或生長。
[0067]在優選的實施方案中，根據本發明及本文公開的內容，編碼EPSPS酶的核苷酸序列的進一步特征在于，該核苷酸序列包含至少一個進一步的突變，所述突變獨立地使得該核苷酸序列編碼賦予植物草甘膦抗性的EPSPS酶，優選地，其中所述至少一個進一步的突變與選自由101、106或者179組成的組中的位置的氨基酸的變化相對應，如圖1所示。因此，在EPSPS編碼序列中，位置101的氨基酸優選不是甘氨酸(G)，位置106的氨基酸優選不是脯氨酸(P)，和/或位置179的氨基酸優選不是絲氨酸(S)。
[0068]例如，根據本發明編碼具有氨基酸突變(例如對應于圖1所示的位置101、106或者179)的EPSPS酶的核苷酸序列，其中該突變賦予EPSPS酶草甘膦抗性，可以提供有與本文公開的位置44的氨基酸的變化對應的至少一個進一步的突變。
[0069]在優選的實施方案中，在位置101發生改變的氨基酸是甘氨酸。
[0070]在優選的實施方案中，在位置106發生改變的氨基酸是脯氨酸。
[0071]在優選的實施方案中，在位置179發生改變的氨基酸是絲氨酸。
[0072]優選地，位置101的氨基酸改變為丙氨酸。
[0073]優選地，位置106的氨基酸改變為亮氨酸。
[0074]優選地，位置179的氨基酸改變為天冬酰胺。
[0075]換句話說，優選地根據本發明，位置101的氨基酸是丙氨酸，或者位置106的氨基酸是脯氨酸，或者位置179的氨基酸是天冬酰胺。據發現，如圖1所示，在EPSPS酶中，在位置44優選地與天冬氨酸或者谷氨酸組合，優選天冬氨酸，這些特定氨基酸(變化)相對于由所得的EPSPS酶賦予的草甘膦抗性呈現有利的結果，和/或與相應的野生型EPSPS相比或者與在該位置改變為除優選氨基酸以外的氨基酸的EPSPS相比，得到對其正常底物活性獲得改善的EPSPS酶。
[0076]在文獻和實踐中，不同的數字用來指EPSPS酶的氨基酸序列中相同氨基酸的位置，尤其是當比對不同生物體的氨基酸序列時。為了避免說明書中使用的數字的歧義，我們引入圖1，其中比對和編號了玉米、水稻、小麥、番茄、擬南芥、洋蔥、沙門氏菌和大腸桿菌的EPSPS酶氨基酸序列的相關區域。此外，突出了重要的氨基酸。本文公開和提及的氨基酸位置參見圖1。
[0077]當在本說明書(或者權利要求書)中提到氨基酸位置44、101、106和/或179時，它們應被解釋為，表示在與氨基酸序列中位置44、101、106和/或179相似的位置的氨基酸的變化，本領域技術人員應該理解，該氨基酸序列與具有如圖1所示的氨基酸序列的EPSPS蛋白基本上同源，例如與圖1所示氨基酸序列的蛋白質的整個長度具有至少75%的氨基酸的同一性，優選地至少75%，更優選地至少80%，甚至更優選地84%、88%、92%、95%、98%或者99%的同一性，和/或是功能性的，換言之具有EPSPS酶活性。
[0078]例如，盡管圖1沒有示出馬鈴薯或者向日葵的EPSPS的相關區域，它們仍然可以根據熟練技術人員已知的方法(例如使用CLC Bio Main Workbench package (www.clcbi0.com))與圖1公開的序列進行比對。例如，具有EPSPS酶活性且包含序列蘇氨酸(T)-纈氨酸(V)-纈氨酸(V)-天冬氨酸(D)-天冬氨酸(D)-亮氨酸(L)-亮氨酸(L)-天冬酰胺(N)的馬鈴薯EPSPS酶的氨基酸序列，對應于圖1所示的位置40-47。由于這個序列包含與如圖1所示的位置44相對應的位置的變化，即根據本發明其是天冬氨酸，而不是天冬酰胺。
[0079]
【發明者】已認識到，EPSPS酶中突變的限制因素可能是它們賦予EPSPS酶的生化活性降低。例如，沙門氏菌中T42M突變使對其正常底物(PEP)的親和力降低25倍，而對草甘膦的耐受性提高26倍。這種適應性損失可能意味著這樣的突變基因在田間條件下不足以正常生長。同等地，與優良的傳統品種相比，抗草甘膦大豆作物的產量降低6.7% (CharlesBenbrook.Evidence of the Magnitude and Consequences of the Roundup ReadySoybean Yield Drag from University-Based Varietal Trials in 1998.Ag BioTechInfoNet Technical Paper Number I (1998年高校主導的變種試驗中抗草甘膦大豆產量的量和結果的證明))。
[0080]人們認為單獨地具有優選如上文描述突變A即位置44的突變，或具有突變A與其它產生草甘膦抗性的突變優選本文描述的突變相組合的EPSPS突變體可能導致對草甘膦的(改善的)抗性。這可能是沒有(進一步)抑制酶活性或者甚至改善了酶活性。尤其意外的是，發現突變A (在位置44)與產生草甘膦抗性的其它突變例如突變B (在位置101)、突變C (在位置106)或者突變D (在位置179)的組合增強了草甘膦抗性，這超出了以單獨的突變A和單獨的其它突變`為基礎達到的預期效果。
[0081]例如，還可以為編碼EPSPS酶的核苷酸序列，所述酶包含使EPSPS酶賦予植物(細胞)草甘膦抗性的突變，優選選自由如圖1所示的101、106或者179組成的組中的位置的氨基酸的變化相對應的突變，提供與上文所公開的位置44的氨基酸的變化相對應的進一步的突變，以獲得編碼EPSPS酶的核苷酸序列，相較于當編碼EPSPS酶的核苷酸序列中未提供與位置44的氨基酸的變化的相對應的所述突變時，上述EPSPS酶對其正常底物可以具有增加的活性，或者對草甘膦有更好的抗性。例如增加的活性包括EPSPS酶對其正常底物的親和力增加1.5、2、4或5倍。在不受理論限制的情況下，本申請發明人認為，該效果可能涉及EPSPS酶活性位點的變化，所述變化導致酶對草甘膦親和力更低和/或酶對其正常底物親和力增加。
[0082]其它突變的或者修飾的EPSPS，如美國專利第5，310，667號、第5，866，775、第6，225，114號和第6，248，876號中描述的那些，或者顯示草甘膦抗性的天然EPSPS變體，也可以與本發明組合使用。另外，細菌衍生的抗草甘膦EPSPS變體，例如與葉綠體轉運肽融合之后，也可以與本發明組合使用。
[0083]如熟練技術人員所理解的，通過應用誘變化合物例如甲磺酸乙酯(EMS)或者能夠(任意)將突變引入核苷酸序列中的其它化合物，可以將突變引入到本文限定的編碼EPSPS的核苷酸序列中。該誘變化合物或其它化合物可以作為產生具有編碼EPSPS酶的核苷酸序列中的突變的植物(細胞)的一種手段。然后根據本發明可以通過測序選擇具有突變的植物(細胞)。
[0084]可選地，根據本發明在編碼EPSPS酶的核苷酸序列中引入突變，會受到在植物中引入轉移DNA (T-DNA)的影響，例如某些種類細菌例如根癌農根菌(Agrobacteriumtumefaciens)的腫瘤誘發(Ti)質粒的T-DNA。可以將包含根據本發明編碼含有位置44的氨基酸變化的EPSPS酶的核苷酸序列的T-DNA要素，可選地與本文描述的其它突變相組合，引入到植物中，這導致通過根據本發明的方法獲得的具有(增強的)草甘膦抗性的植物(細胞)(參見例如 Krysan et al, 1999 The Plant Cell1Vol 11.2283-2290)。可以通過轉座因子插入的使用獲得同樣的優點(參見例如Kunze et al (1997) Advances in BotanicalResearch 27 341-370 or Chandlee(1990)Physiologia Planta 79(1)105-115)。
[0085]優選地，通過基因組工程技術將突變引入根據本發明編碼EPSPS酶的核苷酸序列中，如基于同源重組的技術或者寡聚物定向誘變(0DM)，例如W02007073170、W02007073149、W02009002150和W02007073166中描述的)。通過應用0DM，可以改變編碼EPSPS的核苷酸序列中的特定核苷酸，從而可以引入本發明的突變。 [0086]本發明還提供了一種賦予植物草甘膦抗性的EPSPS酶，優選植物EPSPS酶，如本文所描述的，其通過根據本發明的核苷酸序列編碼。這樣的EPSPS酶可以源自細菌或者植物。然而，優選的是，該EPSPS酶或者編碼該EPSPS酶的核苷酸源自作物，更優選源自棉花、番茄、馬鈴薯、洋蔥、水稻、小麥、玉米或者向日葵，因為該EPSPS酶可能更類似于在農業中最常用的植物的天然EPSPS酶。這樣更天然的EPSPS酶在農業中可以使農作物產生更高的作物產量。
[0087]本發明的EPSPS酶可以在植物中表達，優選為作物，更優選棉花、番茄、馬鈴薯、洋蔥、水稻、小麥、玉米、向日葵、甜菜或者蕓苔屬種類。
[0088]棉花包括棉屬種類，例如G.hirsutum和海島棉。番爺包括番爺(SolanumIycopersicum)。馬鈴薯包括馬鈴薯(Solanum tubersosum)。洋蔥包括蔥屬(Allium)種類，特別是洋蔥(Allium cepa)。水稻包括稻(Oryza sativa),如秈稻栽培種組(0.sativacultivar-group)或者粳稻品種組(japonica cultivar-group)和光稃稻(Oryzaglaberrima)。小麥包括小麥屬(Triticum)種類，包括一粒小麥(T.monococcum)和二粒小麥(T.dicoccoides)。玉米包括玉蜀黍屬(Zea)種類。向日葵包括向日葵(Helianthusannus)。蕓苔屬種類包括卡諾拉、油菜、菜花、花椰菜、卷心菜、甘藍型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.juncea)、甘藍(B.0leracea)、白菜型油菜(B.rapa)，以及甜菜,包括甜菜(Betavulgaris)。
[0089]本發明還提供了包含本發明的核苷酸序列的載體和包含這樣的載體的宿主。所述載體可以用來將本發明的核苷酸轉移到另一細胞例如植物細胞。不同類型的載體包括質粒、噬菌體和其它病毒、粘粒和人工染色體。
[0090]本發明還提供了包含本發明的核苷酸序列和/或其片段和/或本發明的EPSPS酶的植物或轉基因植物或其部分。所述片段的長度至少足以確定該片段是源自編碼EPSPS酶的核苷酸序列，且其還包含本發明的突變A，優選與當在編碼EPSPS酶的完整核苷酸序列中將賦予植物草甘膦抗性的至少一個進一步的突變相組合。優選地，該至少一個進一步的突變包括本文描述的本發明的突變B、突變C和/或突變D。[0091]例如該片段的長度可以為至少10、30、100、500個連續核苷酸。熟練技術人員可以毫無問題地確定這樣的片段是否包括本文所描述的突含變。例如可以通過將該片段與EPSPS編碼序列比對來確定。
[0092]轉基因作物含有人工插入的一個基因或多個基因，即其中該基因最初沒有通過授粉獲得。因此非轉基因植物不含有人工插入的一個基因或多個基因。本發明還提供了源自上文所述的植物或者轉基因植物或者其部分的種子，其包含本發明的核苷酸序列和/或其片段和/或本發明的EPSPS酶。 [0093]該片段的長度至少足以確定該片段是源自編碼EPSPS酶的核苷酸序列，且其還包含本發明的突變A (位置44)。
[0094]例如該片段的長度可以為至少10、30、100、500個連續核苷酸。熟練技術人員可以毫無問題地確定這樣的片段是否包含本文所描述的突變。例如可以通過將該片段與EPSPS編碼序列比對來確定。
[0095]在另一方面，本發明涉及一種提供抗草甘膦植物(細胞)的方法，該方法包括:
[0096]a.提供包含編碼EPSPS酶、優選植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物(細胞)，其特征在于該核苷酸序列包含與如圖1所示位置44的氨基酸的變化相對應的至少一個突變。
[0097]在上述方法中，優選的是，在位置44發生改變的氨基酸是天冬酰胺，和/或在位置44的氨基酸改變為天冬氨酸，優選與野生型EPSPS比較。換句話說，如圖1所示，位置44的氨基酸優選是天冬氨酸。
[0098]在另一方面，本發明涉及一種提供對草甘膦有抗性的植物(細胞)的方法，該方法包括:
[0099]a.提供包含編碼EPSPS酶、優選植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物(細胞)，其特征在于該核苷酸序列包含與如圖1所不位置44的氨基酸的變化相對應的至少一個突變,和獨立地使該核苷酸序列編碼賦予植物草甘膦抗性的EPSPS酶的至少一個進一步的突變，優選地，其中該至少一個進一步的突變與選自由101、106或者179組成的組中的位置的氨基酸的變化相對應，如圖1所示。
[0100]在又一方面，本發明涉及一種提供對草甘膦有抗性的植物(細胞)的方法，該方法包括:
[0101]a.提供包含編碼EPSPS酶、優選植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物(細胞)；
[0102]b.在步驟a)的所述核苷酸序列中，優選地在步驟a)的所述植物中，提拱與圖1所示位置44的氨基酸的變化相對應的突變。
[0103]因此，優選提供了一種突變，其導致在EPSPS編碼序列中的位置44的氨基酸不是天冬酰胺(N)，例如與沒有該突變的相同的EPSPS編碼序列相比引起草甘膦抗性。
[0104]在又一方面，本發明涉及一種增強植物(細胞)的草甘膦抗性的方法，該方法包括:
[0105]a.提供包含編碼賦予植物草甘膦抗性的EPSPS酶、優選植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物(細胞)，并且優選地，其特征在于該核苷酸序列包含與選自由如圖1所示的101、106或者179組成的組中的位置的氨基酸的變化相對應的至少一個突變。
[0106]b.在步驟a)的所述核苷酸序列中，優選地在步驟a)的所述植物中提拱與圖1所示位置44的氨基酸的變化相對應的突變。
[0107]因此，優選提供了一種突變，其導致在EPSPS編碼序列中的位置44的氨基酸不是天冬酰胺(N)，例如與沒有該突變的相同的EPSPS編碼序列相比引起草甘膦抗性。
[0108]在編碼EPSPS酶、優選植物EPSPS酶的核苷酸序列中提供與圖1所示位置44的氨基酸的變化相對應的突變，可以通過靶向核苷酸交換(TNE)來完成，即通過在編碼EPSPS酶、優選植物EPSPS酶的核苷酸序列中引入至少一個寡核苷酸來完成，該寡核苷酸能夠和步驟a)的核苷酸序列雜交并且包含相對于步驟a)的核苷酸序列的錯配，其中該錯配的位置與圖1所示位置44的氨基酸的變化相對應的突變的位置對應。
[0109]一旦引入細胞中，例如通過電穿孔或者PEG介導的寡核苷酸攝取，這樣的寡核苷酸就能夠與將被改變(即編碼EPSPS酶的核苷酸序列中的靶位點)的核苷酸序列的互補序列雜交(堿基對)。通過在寡核苷酸中有意設計錯配，該錯配可以使得在靶基因組序列中的相應位置發生核苷酸轉換。這可以導致提供與圖1所示位置44的氨基酸變化相對應的突變。同樣，根據有意設計的錯配類型，這可以導致提供與圖1所示位置101、106和/或179的氨基酸變化相對應的突變。
[0110]該寡核苷酸的長度可以為10-500個核苷酸之間，優選地15-250個核苷酸，更優選地10-200個核苷酸，最優選地15-150個核苷酸之間。該寡核苷酸可以含有鎖核苷酸，優選地在該錯配的上游或者下游設置一個核苷酸。該寡核苷酸可以可選地或者額外地包含丙炔基化堿基。 申請人:的專利公開W02007073166、W02007073170和W02009002150中描述了 TNE方法。該寡核苷酸還可以包含位于5'端和/或3'端或該錯配的兩端的至少4、至少3、3、2或者I個硫代磷酸酯連接。
[0111]進一步優選的是，在上述方法中，在位置44發生改變的氨基酸是天冬酰胺，和/或位置44的氨基酸改變為天冬氨酸，和/或在位置101發生改變的氨基酸是甘氨酸，和/或在位置106發生改變的氨基酸是脯氨酸，和/或在位置179發生改變的氨基酸是絲氨酸，和/或位置101的氨基酸改變為 丙氨酸，和/或位置106的氨基酸改變為亮氨酸，和/或位置179的氨基酸改變為天冬酰胺(參見在本發明涵蓋的標題“突變的具體組合”中描述的突變的具體組合)。
[0112]本發明的方法提供的植物可以用來生產其他植物和/或從其衍生的植物產品。術語植物產品指的是能從生長的植物中獲得的那些材料，其包括壓碎的、磨碎的或仍完整的、與其它材料混合的、干燥的或冰凍等的果實、葉子、植物器官、植物脂肪、植物油、植物淀粉和植物蛋白級分。
[0113]本發明還提供了一種生成植物產品的方法，該方法包括:
[0114]a)加工包含本發明的核苷酸和/或本發明的EPSPS酶的植物或轉基因植物或其部分，或者根據本發明的任何方法可得到的植物。
[0115]在上述方法中，優選地通過蒸煮、碾磨、干燥、研磨、烘焙、切割、篩分、剝落、脫皮、浸泡、洗滌、加熱、冷卻、破碎或者濕潤來實施所述加工，以得到植物產品。
[0116]還提供通過上述方法可獲得的植物產品，優選為淀粉基產品或植物油基產品，其特征在于，存在本發明的核苷酸序列和/或其片段。
[0117]淀粉基產品可以包括產品如番茄醬、面粉或任何其它含淀粉產品。植物油基產品可以包括產品如橄欖油、向日葵油或任何其它含植物油產品。
[0118]本發明還提供了本發明的核苷酸序列和/或本發明的EPSPS酶在增強植物的草甘膦抗性中的用途。例如，可以將這樣的核苷酸序列引入到植物(細胞)中從而實現(增強的)草甘膦抗性。
[0119]本發明的另一個方面涉及與圖1所示位置44的氨基酸的變化相對應的突變在增強抗草甘膦植物的草甘膦抗性中的用途，優選，其中該植物包含編碼賦予植物草甘膦抗性的EPSPS酶優選植物EPSPS酶的核苷酸序列，優選地，其特征在于該核苷酸序列包含與選自由圖1所示101、106或者179所組成的組中的位置的氨基酸的變化相對應的至少一個突變。
[0120]換句話說，與位置44的氨基酸的變化相對應的突變的用途包括，改變位置44的氨基酸，優選使得位置44的氨基酸是天冬氨酸，從而實現(增強的)草甘膦抗性。但換言之，該用途包括根據本發明位置44的氨基酸的變化信息的用途，從而實現(增強的)草甘膦抗性。[0121 ] 相對于上述用途，優選的是，在位置44發生改變的氨基酸是天冬酰胺，和/或在位置101發生改變的氨基酸是甘氨酸，和/或在位置106發生改變的氨基酸是脯氨酸，和/或在位置179發生改變的氨基酸是絲氨酸，和/或位置44的氨基酸改變為天冬氨酸，和/或位置101的氨基酸改變為丙氨酸，和/或位置106的氨基酸變為亮氨酸，和/或位置179的氨基酸改變為天冬酰胺。這些變化優選與野生型EPSPS比較。
[0122]還提供了以上描述的抗草甘膦的EPSPS酶中的突變在恢復或者提高酶活性中的用途。例如，引起位置44的氨基酸優選天冬酰胺改變為另一氨基酸優選天冬氨酸的突變可以通過以下方式使用:將其引入到已對草甘膦有抗性的酶中來進一步提高該酶對其正常底物PEP的活性。優選地，可以將引起位置101的氨基酸優選甘氨酸改變為另一氨基酸優選丙氨酸的突變，和/或引起位置106的氨基酸優選脯氨酸改變為另一氨基酸優選亮氨酸的突變，和/或引起位置179的氨基酸優選絲氨酸改變為另一氨基酸優選天冬酰胺的突變，(另外)引入到已對草甘有抗性的酶中來進一步提高該酶對其正常底物PEP的活性。
[0123]下面描述了可根據本發明使用的突變A、B、C和D的具體組合。
`[0124]本發明涵蓋的突變的具體組合
[0125]突奪 A+B
[0126]在優選的實施方案中，編碼EPSPS酶的核苷酸序列包含引起位置44的氨基酸的變化的突變和引起位置101的氨基酸的變化的突變。在優選的實施方案中，在位置44發生改變的氨基酸是天冬酰胺。在另一優選的實施方案中，在位置101發生改變的氨基酸是甘氨酸。在進一步優選的實施方案中，在位置44發生改變的氨基酸是天冬酰胺和在位置101發生改變的氨基酸是甘氨酸。優選地，引起位置44的氨基酸的變化的核苷酸序列中的突變使其改變為天冬氨酸，即天冬氨酸位于位置44。優選地，引起位置101的氨基酸的變化的核苷酸序列中的突變使其改變為丙氨酸，即丙氨酸位于位置101。優選地，引起位置44的氨基酸的變化的核苷酸序列中的突變使其改變為天冬氨酸，即天冬氨酸位于位置44，并且同時，弓丨起位置101的氨基酸的變化的核苷酸序列中的突變使其改變為丙氨酸，即目前丙氨酸位于位置101。
[0127]突奪 A+C
[0128]在另一優選的實施方案中，編碼EPSPS酶的核苷酸序列包含引起位置44的氨基酸的變化的突變和引起位置106的氨基酸的變化的突變。在優選的實施方案中，在位置44發生改變的氨基酸是天冬酰胺。在另一優選的實施方案中，在位置106發生改變的氨基酸是脯氨酸。在進一步優選的實施方案中，在位置44發生改變的氨基酸是天冬酰胺和在位置106發生改變的氨基酸是脯氨酸。優選地，引起位置44的氨基酸的變化的核苷酸序列中的突變使其改變為天冬氨酸，即天冬氨酸位于位置44。優選地，引起位置106的氨基酸的變化的核苷酸序列中的突變使其改變為亮氨酸，即亮氨酸位于位置106。優選地，引起位置44的氨基酸的變化的核苷酸序列中的突變使其改變為天冬氨酸，即天冬氨酸位于位置44，并且同時，引起位置106的氨基酸的變化的核苷酸序列中的突變使其改變為亮氨酸，即亮氨酸位于位置106。
[0129]突奪 A+D
[0130]在另一優選的實施方案中，編碼EPSPS酶的核苷酸序列包含引起位置44的氨基酸的變化的突變和引起位置179的氨基酸的變化的突變。在優選的實施方案中，在位置44發生改變的氨基酸是天冬酰胺。在另一優選的實施方案中，在位置179發生改變的氨基酸是絲氨酸。在進一步優選的實施方案中，在位置44發生改變的氨基酸是天冬酰胺和在位置179發生改變的氨基酸是絲氨酸。優選地，引起位置44的氨基酸的變化的核苷酸序列中的突變使其改變為天冬氨酸，即天冬氨酸位于位置44。優選地，引起位置179的氨基酸的變化的核苷酸序列中的突變使其改變為天冬酰胺(D)，即天冬酰胺位于位置179。優選地，引起位置44的氨基酸的變化的核苷酸序列中的突變使其改變為天冬氨酸，即目前天冬氨酸位于位置44，并且同時，引起位置179的氨基酸的變化的核苷酸序列中的突變使其改變為天冬酰胺，即天冬酰胺位于位置179。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0131]圖1示出缺少葉綠體引導信號的成熟蛋白質。在圖1中，比對了來自玉米(SEQID NO:1)、水稻(SEQ ID N0:2)、小麥(SEQ ID N0:3)、番茄(SEQ ID N0:4)、擬南芥(SEQ IDN0:5)、洋蔥(SEQ ID N0:6)、沙門氏菌(SEQ ID NO: 7)和大腸桿菌(SEQ ID N0:8)的 EPSPS酶的相關區域，并且突出了重要的氨基酸。圖1示出本文公開和提及的氨基酸位置。可以看出，本文公開和提及的氨基 酸位置44、101、106和179分別涉及SEQ ID N0:1中的位置43、99、104 和 177，SEQ ID N0:2 中的位置 44、101、106 和 179，SEQ ID N0:3 中的位置 44、101、106 和 179，SEQ ID N0:4 中的位置 44、101、106 和 179，SEQ ID N0:5 中的位置 44、101、106和 179，SEQ ID N0:6 中的位置 30、87、92 和 165，SEQ ID NO:7 中的位置 42、95、100 和 169以及 SEQ ID N0:8 中的位置 42、95、100 和 169。
[0132]圖2示出使用擬南芥(A.thaliana)EPSPS變體在大腸桿菌中互補試驗的結果。以下是對圖2的說明。
[0133](I) N44D P106L
[0134](2) S179N
[0135](3) P106L
[0136](4)野生型
[0137](5) N44D
[0138](6)P106L S179N
[0139](7)空白
[0140]圖3示出完整的擬南芥EPSPS氨基酸序列，包括葉綠體引導信號(SEQ ID N0:9)。相關的氨基酸用下劃線標出。可以看出，本文公開和提及的氨基酸位置44、101、106和179分別涉及SEQ ID NO:1中的位置120、177、182和255。
[0141]圖4 示出完整的擬南芥 EPSPS ORF(SEQ ID NO: 10)。
[0142]圖5示出包括與N44D (SEQ ID NO: 11)對應的突變A358G的完整的擬南芥EPSPSORF。
[0143]圖6示出包含與P106L (SEQ ID NO: 12)對應的突變C545T的完整的擬南芥EPSPSORF。
[0144]圖7示出包含分別與N44D和P106L (SEQ ID NO: 13)對應的突變A358G和G545T的完整的擬南芥EPSPS 0RF。
[0145]圖8示出包含與S179N (SEQ ID NO: 14)對應的突變G902A的完整的擬南芥EPSPSORF。
[0146]圖9示出包含分別與P106L和S179N (SEQ ID NO: 15)對應的突變C545T和G902A的完整的擬南芥EPSPS 0RF。
[0147]圖10示出包含分別與N44D和S179N (SEQ ID NO: 16)對應的突變A358G和G902A的完整的擬南芥EPSPS 0RF。
[0148]圖11示出包含與G101A(SEQ ID NO: 17)對應的突變G530C的完整的擬南芥EPSPSORF。
[0149]圖12示出包含分別與N44D和GlOlA (SEQ ID NO: 18)對應的突變A358G和G530C的完整的擬南芥EPSPS 0RF。
[0150]圖13示出完整的番茄EPSPS核苷酸序列(SEQ ID NO: 19)。
[0151]圖14示出完整的番茄EPSPS2核苷酸序列(SEQ ID NO: 20)。
[0152]圖15示出完整的番茄EPSPSl氨基酸序列(SEQ ID N0:21)。相關氨基酸用下劃線標出。可以看出，本文公開和提及的氨基酸位置44、101、106和179分別涉及SEQ ID N0:21中的位置118、175、180和253。
[0153]圖16示出完整的番茄EPSPS2氨基酸序列(SEQ ID NO: 22)。相關氨基酸用下劃線標出。可以看出，本文公開和提及的氨基酸位置44、101、106和179分別涉及SEQ ID NO: 22中的位置120、177、182和255。
[0154]圖17示出完整的大腸桿菌EPSPS氨基酸序列(SEQ ID N0:23)。相關氨基酸用下劃線標出。可以看出，本文公開和提及的氨基酸位置44、101、106和179分別涉及SEQ IDNO:23 中的位置 43、96、101 和 170。
[0155]圖18示出完整的棉花EPSPS氨基酸序列(SEQ ID N0:24)。相關氨基酸用下劃線標出。可以看出，本文公開和提及的氨基酸位置44、101、106和179分別涉及SEQ ID NO: 24中的位置121、178、183和256。
[0156]圖19示出完整的玉米EPSPS氨基酸序列(SEQ ID N0:25)。相關氨基酸用下劃線標出。可以看出，本文公開和提及的氨基酸位置44、101、106和179分別涉及SEQ ID NO: 25中的位置46、102、107和180。
[0157]圖20示出完整的水稻EPSPS氨基酸序列(SEQ ID N0:26)。相關氨基酸用下劃線標出。可以看出，本文公開和提及的氨基酸位置44、101、106和179分別涉及SEQ ID NO: 26中的位置115、172、177和250。
[0158]圖21示出完整的小麥EPSPS氨基酸序列(SEQ ID N0:27)。相關氨基酸用下劃線標出。可以看出，本文公開和提及的氨基酸位置44、101、106和179分別涉及SEQ ID NO: 27中的位置110、167、172和245。
[0159]圖22示出完整的向日葵EPSPS氨基酸序列(SEQ ID N0:28)。相關氨基酸用下劃線標出。可以看出，本文公開和提及的氨基酸位置44、101和106分別涉及SEQ ID NO:28中的位置118、175和180。
[0160]圖23示出轉基因擬南芥株系中的草甘膦耐受性:平均幼苗重量比(+Gly/_Gly)。以下是對圖23的說明。
[0161](I)野生型EPSPS基因
[0162](2)具有突變 N44D 的 EPSPS
[0163](3)具有突變 P106L 的 EPSPS
[0164](4)具有突變 P106L 和 N44D 的 EPSPS(I)
[0165](5)具有突變 P106L 和 N44D 的 EPSPS (2)
[0166](6)具有突變 P106L 和 N44D 的 EPSPS (3)
[0167](7)具有突變 N44D 和 S179N 的 EPSPS
【具體實施方式】
[0168]實施例1
[0169]在EPSPS酶中應用突變A增強由所述EPSPS酶賦予的草甘膦抗性。
[0170]我們測試在EPSPS酶中與位置44的天冬酰胺改變為天冬氨酸相對應的突變(N44D突變)是否能夠提供具有草甘膦抗性的EPSPS酶。通過將N44D突變單獨地和與賦予該EPSPS酶以草甘膦抗性的其它突變組合引入到該EPSPS酶中來測試。這些是在EPSPS酶中與位置101的甘氨酸改變為丙氨酸的變化相對應的突變(G101A)，在EPSPS酶中與位置106的脯氨酸改變為亮氨酸的變化相對應的突變(P106L)，以及在EPSPS酶中與位置179的絲氨酸改變為天冬酰胺的變化相對應的突變(S179N)。
[0171]構建體
[0172]所有實驗都使用了擬南芥(Arabidopsisthaliana)EPSPS (At2945300)開放閱讀框(參見圖4-12)。圖13描述了該擬南芥(Arabidopsis)EPSPS氨基酸序列。
[0173]首先,綜合地合成該序列(ww.geneart.com)并將其克隆到側翼為BamHI和EcoRI位點的載體中。然后將其作為用于通過定點誘變引入N44D(A350G)、G101A(G530C)、P106L(C545T)和S179N (G902A)突變的基本構建體(ww.geneart.com)。還構建了以下雙突變體:N44D+G101A、N44D+P106L、N44D+S179N 以及 P106L+S179N。
[0174]然后將這些EPSPS變體的每一個作為1576bps EcoR1-BamHI片段克隆到載體PET302NT HIS (lnvitrogen，產品K630203)中，從而將EPSPS變體融合到6x His標簽并允許在大腸桿菌中用IPTG誘變蛋白表達。還可以將這些構建體引入到大腸桿菌表達菌株BL21 PLYS (lnvitrogen)中用于互補分析(complementation assay)。
[0175]互補分析
[0176]由于內源細菌 EPSPS合酶AroA的活性的抑制，大腸桿菌不能在補充有草甘膦的基本M9生長培養基中生長。可以通過補充抗草甘膦植物EPSPS基因來恢復細菌生長。使含有該擬南芥(A.thaliana)EPSPS變體的大腸桿菌菌株在含100 μ g/ml羧節青霉素(Duchefa)的IOml LB培養基中過夜生長。然后在相同的培養基中將菌種稀釋4倍并再生長4小時。然后測量每一培養物的OD600，并在4000rpm的速度下將1.5ml培養物離心10分鐘。在500 μ I Μ9 培養基(12.8g/l Na2HPO4^.0g/1 KH2PO4'0.5g/1 NaCl、1.0g/l NH4C1、2.0g/1 葡萄糖、0.4940g/l MgSO4.7H20、15mg/lCaCl2.2H20、10mg/l 硫胺素和 10mg/l FeSO4.7H20)中重懸浮細菌球，然后將其接種在含有I mM IPTGU00 μ g/ml羧芐青霉素和30mM草甘膦的IOml M9培養基上至達到0.10D600。還制成用于每一菌株的缺少草甘膦的相同培養物，并且它們用來評價未經選擇的每一菌株的生長。然后在25°C生長該培養物，并且隨時間測量0D600以評價細菌的生長(參見圖2)。
[0177]結果
[0178]圖2示出互補分析的結果。正如所期望的，含有空白PET302NT His載體的菌株不能在存在草甘膦的條件下生長，而含有P106L突變的菌株顯示了良好的抗性水平。野生型(WT) EPSPS酶的超表達能夠在稍后的時間點補足細菌生長，大概是由于高蛋白表達水平引起的草甘膦滴定。換句話說，在上述稍后的時間點草甘膦的量可能不再足以使所有表達的EPSPS酶失活。
[0179]該結果表明，單獨的N44D突變可以提供一些草甘膦抗性，但當與P106L突變組合時則在生長18小時后能夠將抗性水平增強2.5倍。這表明，N44D可以優選地用作能夠提高草甘膦抗性的次級突變。當突變A在這種情況下是N44D與上面描述的其它突變組合時，能獲得相似的結果。單獨的S179N突變也賦予了良好的抗性，但當其與P106L突變組合時，該EPSPS酶是無活性的。
[0180]實施例2
[0181]當含N44D和P106L突變的EPSPS基因在擬南芥中表達時賦予增強的草甘膦耐受`性。
[0182]在使用大腸桿菌分析的第一個實施例中，我們已能證明N44D突變本身提供了草甘膦耐受性，但當與例如P106L突變組合時，極大地增強了草甘膦耐受性。本實施例的目的是證明N44D突變在植物中顯示同樣的效果，并且測試了大量突變EPSPS基因對擬南芥(Arabidopsis thaliana)中草甘膦抗性的影響。
[0183]構建含突變的EPSPS基因的雙元載體
[0184]將大腸桿菌中測試的突變擬南芥EPSPS基因(參見實施例1)克隆到雙元載體pEARLEYGATElOO 中(The Plant J.2006; 45:616-629)。簡言之，將 EPSPS 基因分離為包含完整的ORF' s的BamHI和Sacl片段，然后將它們插入到雙元載體中的相同的特定的位點。這生成了一系列攜帶T-DNA和BAR基因(賦予草甘膦抗性)的雙元載體，其中通過組成型35S啟動子在T-DNA上表達EPSPS基因，BAR基因可以用于植物選擇。使用熟練技術人員已知的方法，將該系列的雙元載體電穿孔至根癌農根菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV2260，并且在含100 μ g/ml壯觀霉素的LB培養基上選擇細菌菌落。
[0185]擬南芥(Arabidopsis thaliana)的轉化
[0186]將擬南芥(生態型Colombia)種子播種在土壤中，一旦發芽，就將單個的幼苗放入5cmX 5cm的盆中，使其生長，直到出現第一次內源熒光。然后在這個階段使用花序浸潰法轉化該植物。簡單地說,在28°C使農桿菌屬(Agrobacterium)菌株在含有100μ g/ml壯觀霉素的50ml液體LB培養基中生長過夜，然后在4000rpm將該培養物離心10分鐘。然后在含0.02%表面活性劑(Silwet) (Lehle種子)的5%庶糖溶液中重懸浮該菌球。將擬南芥植物浸潰在該培養物中，然后在25 C避光鮮育過夜。然后使該植物在溫室中進一步生長，7天后重復該浸潰步驟。然后使該植物落籽并使籽在土壤中發芽。為選擇轉化的擬南芥幼苗，制備草胺膦溶液(0.lmg/ml草胺膦+0.005%表面活性劑)，并將其噴灑在該幼苗上。7天后，確定存活的幼苗，使其長至成熟并且收集種子。
[0187]轉基因擬南芥株系復制數目的確定
[0188]我們對轉基因株系的種子進行分離分析以估計T-DNA復制數目。用2%次氯酸鹽溶液對來自每一轉基因株系的種子殺菌，并用無菌水洗滌。然后將每株系大約100粒種子放置到含0.lmg/ml草胺膦的MS20培養基上，并在20天后記錄存活幼苗的數量。選擇具有對草甘膦分離為3:1 (抗性:敏感性)的單個的T-DNA復制的株系，用于進一步分型。
[0189]轉基因擬南芥株系的草甘膦耐受性 [0190]對來自轉基因擬南芥株系的種子殺菌，并將其放置到含0.lmg/ml草胺膦和+/-400 μ M草甘膦的MS20培養基上，并生長4周。在這個階段后，從生長盤中移走幼苗，并確定幼苗的平均重量。通過草甘膦存在下幼苗的平均重量除以無草甘膦時幼苗的平均重量來確定每一株系的草甘膦抗性程度。圖23示出該分析的結果。
[0191]植物中即來自擬南芥的的數據，證實了我們在大腸桿菌生長分析中發現的抗性。與EPSPS未突變的WT形式相比，只含N44D突變的EPSPS基因的超表達導致草甘膦抗性。EPSPSP106L基因的超表達提供合理的抗性，而這在表達既有P106L又有N44D突變的EPSPS的3種獨立的株系中可以增強。S179N突變的數據表明當與N44D組合時該突變也賦予抗性。
【權利要求】
1.一種編碼賦予植物草甘膦抗性的EPSPS酶、優選植物EPSPS酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包含與圖1所示位置44的氨基酸的變化相對應的至少一個突變。
2.如權利要求1所述的核苷酸序列，其中在位置44發生改變的所述氨基酸是天冬酰胺。
3.如權利要求1-2中任一項所述的核苷酸序列，其中優選與野生型EPSPS相比，所述位置44的氨基酸改變為天冬氨酸。
4.如權利要求1-3中任一項所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包含獨立地使所述核苷酸序列編碼賦予植物草甘膦抗性的EPSPS酶的至少一個進一步的突變，優選地，其中所述至少一個進一步的突變與選自由圖1所示101、106或者179組成的組中的位置的氨基酸的變化相對應。
5.如權利要求4所述的核苷酸序列，其中在位置101發生改變的所述氨基酸是甘氨酸，和/或在位置106發生改變的所述氨基酸是脯氨酸，和/或在位置179發生改變的所述氨基酸是絲氨酸。
6.如權利要求4-5中任一項所述的核苷酸序列，其中優選與野生型EPSPS相比，所述位置101的氨基酸改變為丙氨酸，和/或所述位置106的氨基酸改變為亮氨酸，和/或所述位置179的氨基酸改變為天冬酰胺。
7.賦予植物草甘膦抗性的EPSPS酶，優選植物EPSPS酶，所述EPSPS酶由權利要求1_6中任一項所述的氨基酸序列編碼。
8.如權利要求7所述的EPSPS酶，其中所述EPSPS酶源自細菌或者植物，優選源自農作物，更優選源自棉花、番茄、馬鈴薯、洋蔥、水稻、小麥、玉米、向日葵、油菜、卡諾拉或甜菜。
9.如權利要求7或8所述的EPSPS酶，其中所述EPSPS酶在植物中，優選農作物，更優選棉花、番茄、馬鈴薯、洋蔥、水稻、小麥、玉米、向日葵、油菜、卡諾拉或甜菜中表達。
10.包含權利要求1-6任一項所述的核苷酸序列的載體。
11.包含權利要求10所述的載體的寄主。
12.植物或轉基因植物或其部分，包含權利要求1-6中任一項所述的核苷酸序列和/或包含權利要求1-3中任一項限定的突變的所述核苷酸序列的片段，優選地與權利要求4-6中任一項限定的所述至少一個進一步的突變組合，和/或權利要求7-9中任一項所述的EPSPS 酶。
13.來源于權利要求12所述的植物或轉基因植物或其部分的種子，包含權利要求1-6中任一項所述的核苷酸序列和/或包含權利要求1-3中任一項限定的所述突變的核苷酸序列的片段，優選地與權利要求4-6中任一項限定的所述至少一個進一步的突變組合，和/或權利要求7-9中任一項所述的EPSPS酶。
14.提供抗草甘膦植物(細胞)的方法，所述方法包括: a.提供包含編碼EPSPS酶、優選植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物(細胞)，特征在于:所述核苷酸序列包含與圖1所示位置44的氨基酸的變化相對應的至少一個突變。
15.如權利要求14所述的方法，其中在位置44發生改變的所述氨基酸是天冬酰胺。
16.如權利要求14-15中任一項所述的方法，其中優選與野生型EPSPS相比，所述位置44的氨基酸改變為天冬氨酸。
17.提供具有草甘膦抗性的植物(細胞)的方法，所述方法包括:a.提供包含編碼EPSPS酶、優選植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物(細胞)，其特征在于，所述核苷酸序列包含與圖1所示位置44的氨基酸的變化相對應的至少一個突變和獨立地使所述核苷酸序列編碼賦予植物草甘膦抗性的EPSPS酶的至少一個進一步的突變，優選地，其中所述至少一個進一步的突變與選自由圖1所示101、106或者179組成的組中的位置的氨基酸的變化相對應。
18.提供具有草甘膦抗性的植物(細胞)的方法，所述方法包括: a.提供包含編碼EPSPS酶、優選植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物(細胞)； b.在步驟a)的所述核苷酸序列中，優選在步驟a)的所述植物(細胞)中，提供權利要求1-3中任一項限定的突變。
19.如權利要求18所述的方法，其中在步驟a)的所述核苷酸序列中，在步驟a)的所述植物(細胞)中，提供權利要求1-3中任一項限定的突變的步驟b)是通過引入至少一個寡核苷酸來進行，所述寡核苷酸能和步驟a)的所述核苷酸序列雜交并且相對于步驟a)的所述核苷酸序列包含至少一個錯配，其中所述錯配的位置與權利要求1-3中任一項限定的突變的位置相對應。
20.增強植物(細胞)的草甘膦抗性的方法，所述方法包括: a.提供包含編碼賦予植物草甘膦抗性的EPSPS酶、優選植物EPSPS酶的核苷酸序列的植物(細胞)，并且優選地，其特征在于，所述核苷酸序列包含與選自由圖1所示101、106或者179組成的組中的位置的氨基酸的變化相對應的至少一個突變； b.在步驟a)的所述核苷酸序列中，優選在步驟a)的所述植物(細胞)中，提供權利要求1-3中任一項限定的所述突變。`
21.如權利要求20所述的方法，其中在步驟a)的所述核苷酸序列中，在步驟a)的所述植物(細胞)中，提供權利要求1-3中任一項限定的突變的步驟b)是通過引入至少一個寡核苷酸來進行，所述寡核苷酸能和步驟a)的所述核苷酸序列雜交并且相對于步驟a)的所述核苷酸序列包含至少一個錯配，其中所述錯配的位置與權利要求1-3中任一項限定的突變的位置相對應。
22.如權利要求17-21中任一項所述的方法，其中在位置44發生改變的所述氨基酸是天冬酰胺，和/或其中在位置101發生改變的所述氨基酸是甘氨酸，和/或其中在位置106發生改變的所述氨基酸是脯氨酸，和/或其中在位置179發生改變的所述氨基酸是絲氨酸。
23.如權利要求17-22中任一項所述的方法，其中優選與野生型EPSPS相比，所述位置44的氨基酸改變為天冬氨酸，和/或所述位置101的氨基酸改變為丙氨酸，和/或所述位置106的氨基酸改變為亮氨酸，和/或所述位置179的氨基酸改變為天冬酰胺。
24.生成植物產品的方法，所述方法包括: a.優選地通過蒸煮、碾磨、干燥、磨碎、烘焙、切割、過篩、剝落、脫皮、浸泡、洗滌、加熱、冷卻、破碎或者濕潤，加工權利要求12所述的植物或其部分或者通過權利要求14-23中任一項所述的方法可獲得的植物，從而得到植物產品。
25.由如權利要求24所述的方法獲得的植物產品，優選淀粉基產品或植物油基產品，其特征在于，存在權利要求1-6中任一項所述的核苷酸序列和/或包含權利要求1-3中任一項限定的所述突變的核苷酸序列的片段，優選地與權利要求4-6中任一項限定的所述至少一個進一步的突變組合。
26.如權利要求1-6中任一項所述的核苷酸序列和/或權利要求7-9中任一項所述的EPSPS酶在增強植物的草甘膦抗性中的用途。
27.權利要求1-3中任一項所述的突變在增強抗草甘膦植物的草甘膦抗性中的用途，優選地，其中所述植物包含編碼賦予植物草甘膦抗性的EPSPS酶、優選植物EPSPS酶的核苷酸序列，優選地，其特征在于:所述核苷酸序列包含與選自由圖1所示101、106或者179組成的組中的位置的氨基酸的變化相對應的至少一個突變。
28.如權利要求27所述的用途，其中在位置44發生改變的所述氨基酸是天冬酰胺，和/或其中在位置101發生改變的所述氨基酸是甘氨酸，和/或其中在位置106發生改變的所述氨基酸是脯氨酸，和/或其中在位置179發生改變的所述氨基酸是絲氨酸。
29.如權利要求27或28所述的用途，其中優選與野生型EPSPS相比，所述位置44的氨基酸改變為天冬氨酸，和/或其中所述位置101的氨基酸改變為丙氨酸，和/或所述位置106的氨基酸改變為亮氨酸，和`/或其中所述位置179的氨基酸改變為天冬酰胺。
【文檔編號】C12N15/82GK103608458SQ201280020879
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年4月27日 優先權日:2011年4月29日
【發明者】保爾·本多克 申請人:科因公司