多亞基蛋白質例如抗體在轉化的微生物例如巴斯德畢赤酵母中的高純度產生的制作方法

多亞基蛋白質例如抗體在轉化的微生物例如巴斯德畢赤酵母中的高純度產生的制作方法
【專利摘要】公開了用于在轉化的細胞中產生異源多亞基蛋白質的方法。具體地，本公開提供了以更高的產率和減少的非所需副產物產量產生多亞基蛋白質的改進方法，所述多亞基蛋白質包括可能會或可能不會被分泌出的抗體和其它多亞基蛋白質。在示例性實施方案中，轉化的細胞為酵母，例如甲醇營養型酵母如巴斯德畢赤酵母。
【專利說明】多亞基蛋白質例如抗體在轉化的微生物例如巴斯德畢赤酵母中的高純度產生
[0001]相關申請公開
[0002]本申請要求2011年8月19日提交的美國臨時申請序列號61/525，307 (代理人案卷號 67858.730200)(標題為 “MULT1-COPY STRATEGY FOR HIGH-TITER AND HIGH-PURITYPRODUCTION OF MULT1-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBESSUCH AS PICHIA PAST0RIS”、2011年5月20日提交的美國臨時申請序列號61/488，660 (代理人案卷號 67858.730300)(標題為“ANT1-CGRP COMPOSITIONS AND USE THEREOF”)、2011年6月14日提交的美國臨時申請序列號61/496，860(代理人案卷號67858.760000)(標題為 “USE OF ANT1-CGRP ANTIBODIES AND ANTIBODY FRAGMENTS TO PREVENT OR INHIBITPHOTOPHOBIA IN SUBJECTS IN NEED THEREOF, ESPECIALLY MIGRAINE SUFFERERS”)和 2011年6月14日提交的美國臨時申請序列號61/496，873(代理人案卷號67858.770000)(標題為 “USE OF ANT1-CGRP ANTIBODIES AND ANTIBODY FRAGMENTS TO TREAT DIARRHEA INSUBJECTS WITH DISEASES OR TREATMENTS THAT RESULT IN ELEVATED CGRP LEVELS”)的權益，這些美國臨時申請的每一個通過引用整體并入本文。
[0003]本申請包括通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，該序列表創建于2012年5月8日，文件名為“67858o711002.txt”，大小為315，392字節，所述序列表通過引用整體并入本文。
[0004]領域
[0005]本公開總體上涉及用于在轉化的細胞中產生異源蛋白質的方法。具體地，本公開提供了產生多亞基蛋白質包括抗體和其它多亞基蛋白質的改進方法，所述蛋白質可以是分泌的或可以不是分泌的，具有減少的非所需副產物的產量和/或增加的產率。在示例性實施方案中，轉化的細胞是酵母`，例如巴斯德畢赤酵母或釀酒酵母。
[0006]背景
[0007]常規抗體是由兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈組成的四聚體蛋白質。對于許多目的，可能難以或不可能以充足的量從天然來源純化特定類型的純的人抗體。因此，生物技術和制藥公司已轉向基于重組DNA的方法來大規模制備抗體。功能性抗體的產生通常不僅包括兩個多肽的合成而且還包括許多翻譯后事件，包括N末端分泌信號序列的蛋白酶解加工；多肽至四聚體的正確折疊和裝配；二硫鍵的形成；和通常包括特定N聯接的糖基化。所有這些事件在真核細胞分泌途徑(對于真核細胞是獨特的細胞器復合物)中發生。
[0008]此類復合蛋白質的重組合成通常依賴于高等真核細胞的培養來產生具有生物活性的物質，培養的哺乳動物細胞是很常用的。然而，基于哺乳動物組織培養的產生系統相對于微生物發酵法引起顯著增加的費用和并發癥。此外，來源于哺乳動物細胞培養的產物可能需要另外的安全性測試來確保不含可能存在于培養細胞或用于培養的動物來源的產品例如血清中的哺乳動物病原體(包括病毒)。
[0009]現有工作幫助將酵母巴斯德畢赤酵母建立為用于產生功能性抗體的具有成本效益的平臺，所述平臺潛在地適用于研究、診斷和治療用途。參見共同擁有的美國專利7，935，340和7，927，863，所述美國專利的每一個通過引用整體并入本文。用于用于表達重組蛋白質的巴斯德畢赤酵母發酵的設計和最優化(包括細胞密度、液體培養基體積、底物進料速度以及反應的每一個時期的長度的最優化)的方法在文獻中也是已知的。參見 Zhang 等，“Rational Design and Optimization of Fed-Batch and ContinuousFermentations，，in Cregg, J.M., Ed., 2007, Pichia Protocols (第 2 版),Methods inMolecular Biology,第 389 卷,Humana Press, Totowa, N.J.,第 43-63 頁。
[0010]盡管可從培養細胞產生重組多亞基蛋白質，還可產生非所需副產物。例如，培養細胞可產生連同游離單體、具有不正確的化學計量的復合物或具有不期望的或異常的糖基化的蛋白質一起的期望的多亞基蛋白質。期望的多亞基蛋白質的純化可增加生產成本，并且參與純化的步驟可減少活性復合物的總產率。此外，即使在純化后，非所需副產物可以以引起關注的量存在。例如，糖基化副產物可以以在施用后增加免疫反應的風險的量存在，然而異常復合物或聚集體可減小特異性活性并且還可潛在具有免疫原性。
[0011]概述
[0012]大多數IgGl抗體分子通過總共16個鏈內和鏈間二硫鍵來穩定。鏈內二硫鍵穩定IgG結構域在重鏈和輕鏈中的折疊，然而鏈間二硫鍵使重鏈與輕鏈之間的結合穩定。由于這些鍵，抗體形成包含兩個重鏈和兩個輕鏈(H2L2)的穩定復合物。然而，由于不正確的二硫鍵形成，有時在重組抗體制劑中發現產物相關變體，包括具有一個輕鏈和一個重鏈的復合物(HlLl)和具有兩個重鏈和一個輕鏈的復合物(H2L1)。此外，還可形成其中形成額外的鏈間二硫鍵(從而導致更多數目的共價連接的亞基)的更高級的復合物。
[0013]如下文中進一步描述的， 申請人:現已確立了在從酵母培養物重組產生抗體的過程中減少這些包含異常二硫鍵的復合物的產生的方法。具體地，所述方法包括將大劑量乙醇添加至培養物中，從而導致減少的H1L1、H2L1和H4L4產物相關變體的產生以及增加的期望的H2L2產物的純度。HlLl和H2L1復合物可通過非還原變性SDS-PAGE來檢測，H4L4復合物可通過尺寸排阻色譜法來`檢測。通過使用主題方法，可促進適當的二硫鍵形成，從而導致增加的抗體純度。這在3種不同的抗體中得以證明，當在添加大劑量乙醇的情況下產生時，所述三種抗體全都顯示改善的純度(圖1-6)。這三種抗體不僅在序列上不同而且識別3種不同的抗原。此外，當在所述大劑量乙醇不存在的情況下，相較于第三抗體(圖5)，所述抗體中的兩種包含更大量的HlLl產物(圖1-4)。兩種包含更大量的HlLl產物的抗體具有非經典的或額外的二硫鍵，然而第3種抗體不具有非經典的或額外的二硫鍵。圖1、2和3中例舉的抗體在可變輕鏈結構域中具有額外的鏈內二硫鍵，然而圖4中例舉的抗體在其重鏈中具有額外的鏈內二硫鍵。文獻中已報導過表達的蛋白質中二硫鍵的存在增加宿主的細胞內應激(參見 Gasser 等，Biotechnology and Bioengineering,第 94 卷，N0.2，第 353-61頁，2006 年 6 月 5 日；Inan 等，Biotechnology And Bioengineering,第 93 卷，N0.4,第771-78 頁，2006 年 3 月 5 日；Li 等，Biochem Biophys Res Commun.2010 年 11 月 19 日；402(3):519 - 524)。該增加的應激還可導致更低的活力，如圖11、12和13中顯示的，其中具有額外鏈內二硫鍵的兩種抗體在“無大劑量”條件下具有更低的活力。大劑量乙醇的添加從而導致增加的活力和增加的純度。這可以是有用的，特別是在難以表達多個二硫鍵要表達的蛋白質時。
[0014]在一個方面，本公開提供了產生多亞基復合物的方法，包括:(a)提供包含含有提供所述多亞基復合物的亞基的表達的基因的真核細胞的培養物；(b)將大劑量的乙醇添加至所述培養物；和(C)培養所述培養物以產生所述多亞基復合物。
[0015]大劑量乙醇相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法增加穩定的二硫鍵的形成。
[0016]所述多亞基復合物可包含一個或多個包含至少一個二硫鍵的多肽。
[0017]所述多亞基復合物包含抗體。
[0018]所述方法相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法可降低一種或多種產物相關變體的相對豐度。
[0019]所述方法相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法可降低產物相關變體的相對豐度，所述變體具有比所述期望的多亞基復合物更高或更低的表觀分子量，如通過尺寸排阻色譜法或凝膠電泳所檢測的。
[0020]所述方法相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法可降低具有異常化學計量的復合物的相對豐度。
[0021]所述方法相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法可降低具有異常二硫鍵的復合物的相對豐度。
[0022]所述方法相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法可降低具有降低的半胱氨酸的復合物的相對豐度。
[0023]所述方法相對于 在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法可降低具有異常糖基化的復合物的相對豐度。
[0024]所述方法可調節重鏈間二硫鍵的形成或穩定性。
[0025]所述方法可調節連接輕鏈與重鏈的二硫鍵的形成或穩定性。
[0026]所述方法相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的方法可降低一種或多種產物相關變體的相對豐度。
[0027]所述產物相關變體包括H1L1、H2L1和H4L4產物相關變體的一種或多種。
[0028]所述方法相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法增加所述抗體的純度。
[0029]可在步驟(C)之前進行步驟(b)。
[0030]可在步驟(C)后進行步驟(b)。
[0031]可同時進行步驟(b)與步驟(C)。
[0032]步驟(b)可導致所述培養物中的乙醇濃度在約0.01%與約4% (w/v)之間。
[0033]步驟(b)可導致所述培養物中的乙醇濃度為約0.01%與約4%之間、約0.02%與約3.75%之間、約0.04%與約3.5%之間、約0.08%與約3.25%之間、約0.1%與約3%之間、約0.2%與約2.75%之間、約0.3%與約2.5%之間、約0.4%與約2.25%之間、約0.5%與約
1.5%之間、約0.5%與約2%之間、約0.6%與約1.75%之間、約0.7%與約1.5%或約0.8%與約1.25%之間。
[0034]步驟(b)可導致所述培養物中的乙醇濃度可為至少約0.01%、0.02%、0.03%、
0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.10%、0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.6%、0.7%、0.8%
或 0.9% (w/V)
[0035]步驟(b)可導致所述培養物中的乙醇濃度可為至多約4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.8%、1.6%、1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.35%、0.3%、0.25%、0.2% 或 0.15% (w/v)。
[0036]步驟(b)可包括將乙醇添加至所述培養物，將包含乙醇的載體添加至所述培養物，將所述細胞添加至培養基或包含乙醇的載體，或替換部分所述培養基。
[0037]在I至20分鐘的時間段內將所述大劑量乙醇添加至培養基。
[0038]步驟(C)可包括給所述細胞提供氧。
[0039]所述提供氧包括攪拌所述培養物。
[0040]所述提供氧包括將所述培養物與包含氧的氣體混合物接觸。
[0041]步驟(C)可包括將含有碳源的進料添加至所述培養物。
[0042]所述進料包含至少一種可發酵碳源。
[0043]所述進料包含葡萄糖、乙醇、檸檬酸鹽、山梨醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麥芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露醇和棉子糖的一種或多種。
[0044]所述方法還可在步驟(C)期間將乙醇的濃度維持在上設置點與下設置點之間。
[0045]所述下設置點為約0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、
0.09%、0.10%、0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.6%、0.7%、0.8% 或 0.9% (w/v)。
[0046]所述上設置點為 約4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.8%、1.6%、1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、
1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.35%,0.3%、0.25%,0.2% 或 0.15%(w/v)。
[0047]所述上設置點至多為約L 5%、L 4%、L 3、I.2%或I.1% (w/v)。
[0048]所述方法還可包括在步驟(C)期間將乙醇濃度維持在設置點。
[0049]所述設置點為約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、01.%、
01.1%、01.2%、01.3%、01.4% 或 01.5% (w/v)。
[0050]步驟(c)可包括將所述培養物中的乙醇濃度維持在約0.01%與約4%之間、約
0.02%與約3.75%之間、約0.04%與約3.5%之間、約0.08%與約3.25%之間、約0.1%與約3%之間、約0.2%與約2.75%之間、約0.3%與約2.5%之間、約0.4%與約2.25%之間、約0.5%與約2%之間、約0.6%與約1.75%之間、約0.7%與約1.5%或約0.8%與約1.25%之間。
[0051]所述培養物中的乙醇濃度通過控制由所述細胞進行的乙醇產生或通過將乙醇添加至所述培養物來維持。
[0052]控制乙醇產生的步驟可包括控制葡萄糖的濃度、氧的可用度、攪拌的強度、氣壓、供應的空氣或其它氣體混合物的流速、培養物粘度、培養物密度、供應的空氣或其它氣體混合物中氧的濃度以及溫度的一項或多項。
[0053]步驟(a)與步驟(b)之間的時間可少于約72小時、少于約48小時、少于約24小時、少于約12小時、少于約9小時、少于約6小時、少于約5小時、少于約4小時、少于約3小時、少于約90分鐘、少于約30分鐘、少于約5分鐘或少于約I分鐘。
[0054]步驟(b)與步驟(C)之間的時間少于約10小時、少于約9小時、少于約8小時、少于約7小時、少于約6小時、少于約5小時、少于約4小時、少于約3小時、少于約2小時、少于約90分鐘、少于約80分鐘、少于約70分鐘、少于約60分鐘、少于約50分鐘、少于約40分鐘、少于約30分鐘、少于約20分鐘、少于約10分鐘、少于約5分鐘或少于約I分鐘。
[0055]步驟(a)的培養物通過向所述培養物添加碳源，以及培養所述培養物直至碳源可被耗盡來產生。[0056]所述碳源包括甘油、葡萄糖、乙醇、檸檬酸鹽、山梨醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麥芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露醇和棉子糖的一種或多種。
[0057]碳源的耗盡通過檢測所述真核細胞的代謝活動的減弱來測定。
[0058]所述真核細胞的代謝活動的所述減弱可通過檢測所述真核細胞對氧的消耗的減少，通過檢測培養物的pH的升高，通過檢測濕細胞團的穩定化，或通過檢測培養物中的氨濃度的增加來鑒定。
[0059]所述真核細胞對氧的消耗的所述減少可通過檢測所述培養物中溶解氧的濃度的增加來鑒定。
[0060]所述真核細胞可包括酵母細胞。
[0061]所述酵母細胞可包括甲醇營養型酵母。 [0062]所述甲醇營養型酵母可屬于畢赤酵母屬。
[0063]畢赤酵母屬的所述甲醇營養型酵母是巴斯德畢赤酵母。
[0064]畢赤酵母屬的所述甲醇營養型酵母選自:安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)、季也蒙畢赤氏酵母(Pichia guiIIermordii)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)和因諾托畢赤氏酵母(Pichia inositovera)。
[0065]提供所述多亞基復合物的表達的基因被整合到一個或多個基因組基因座中。
[0066]所述基因組基因座的至少一個選自pGAP基因座、3’A0X TT基因座、PpURA5、0CHl、A0Xl、HIS4、GAP、pGAP、3’ AOX TT、ARG 和 HIS4TT 基因座。
[0067]可在誘導型或組成型啟動子的控制下表達編碼多亞基復合物的所述亞基的基因中的至少一個。
[0068]所述誘導型啟動子選自A0XUCUP1、四環素誘導型啟動子、硫胺酸誘導型啟動子以及FLDl啟動子。
[0069]可在選自以下的啟動子的控制下表達編碼所述多亞基復合物的所述亞基的基因中的至少一個:CUP1、AOXl、ICLl、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)、FLDl、ADHl、醇脫氫酶I1、GAL4、PH03、PH05以及Pyk啟動子、四環素誘導型啟動子、硫胺素誘導型啟動子、來源于其的嵌合啟動子、酵母啟動子、哺乳動物啟動子、昆蟲啟動子、植物啟動子、爬行動物啟動子、兩棲動物啟動子、病毒啟動子和禽類啟動子。
[0070]所述真核細胞可以是二倍體、四倍體細胞或多倍體。
[0071]所述方法還可包括從所述真核細胞或從培養基純化所述多亞基復合物。
[0072]可從所述真核細胞的細胞內組分、細胞質、核質或膜純化所述多亞基復合物。
[0073]所述真核細胞可分泌所述多亞基復合物至培養基中。
[0074]可從所述培養基純化所述多亞基復合物。
[0075]所述多亞基復合物可包括單特異性或雙特異性抗體。
[0076]所述多亞基復合物可包括人抗體或人源化抗體或其片段。
[0077]所述人源化抗體可具有小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊或牛來源。
[0078]所述人源化抗體可具有兔來源。
[0079]所述多亞基復合物可包括單價、雙價或多價抗體。
[0080]可通過蛋白A和/或蛋白G親和從所述培養物純化所述抗體。
[0081]可最優化基因的至少一個以在所述真核細胞中表達，所述基因在所述小組的所述真核細胞的至少一個中提供所述多亞基復合物的亞基的表達。
[0082]所述多亞基復合物可包括抗體并且所述抗體的純度可通過測量由所述真核細胞產生的抗體的分數來評估，所述抗體可包含在具有預期的表觀流體力學半徑的抗體復合物中，可包含在具有預期的分子量的抗體復合物中，和/或特異性結合所述抗體的靶。
[0083]所述多亞基復合物可包括抗體并且所述抗體的產量可通過測定扣除任何產物相關變體的由所述真核細胞產生的抗體的量來評估，所述變體可被異常糖基化，包含在抗體復合物中而非具有預期的表觀流體力學半徑的復合物中，包含在具有預期的分子量的抗體復合物中，和/或不能特異性結合所述抗體的靶。
[0084]所述抗體復合物的分子量可通過非還原SDS-PAGE來測定。
[0085]所述多亞基復合物可包括抗體，所述方法還可包括純化所述抗體。
[0086]所述培養細胞產生至少100mg/L、至少150mg/L、至少200mg/L、至少250mg/L、至少300mg/L、100 至 300mg/L、100 至 500mg/L、100 至 1000mg/L、至少 1000mg/L、至少 1250mg/L、至少1500mg/L、至少約1750mg/L、至少約2000mg/L、至少約10000mg/L或更多的上清液抗體滴度。
[0087]所述多亞基復合物的一個或多個亞基可從超過一個基因拷貝表達。
[0088]所述多亞基復合物可包括抗體，所述抗體可從1-10個拷貝的編碼所述抗體的輕鏈的基因和從1-10個拷貝的編碼所述抗體的重鏈的基因表達。
[0089]可將提供所述多亞基復合物的表達的基因整合到所述細胞的基因組中。
[0090]提供所述多亞基`復合物的表達的基因可包含在染色體外元件、質粒或人工染色體中。
[0091]所述細胞可包含比提供所述抗體的重鏈的表達的基因的拷貝更多的提供所述抗體的輕鏈的表達的基因的拷貝。
[0092]所述細胞中編碼所述抗體的重鏈的基因的拷貝數和編碼所述抗體的輕鏈的基因拷貝數分別為:2和2、2和3、3和3、3和4、3和5、4和3、4和4、4和5、4和6、5和4、5和
5、5和6或5和7。
[0093]所述細胞中的編碼所述抗體的重鏈的基因的拷貝數和編碼所述抗體的輕鏈的基因的拷貝數分別為:2和1、3和1、4和1、5和1、6和1、7和1、8和1、9和1、10和1、1和2、2和2、3和2、4和2、5和2、6和2、7和2、8和2、9和2、10和2、1和3、2和3、3和3、4和
3、5和 3、6 和 3、7 和 3、8 和 3、9 和 3、10 和 3、I 和 4、2 和 4、3 和 4、4 和 4、5 和 4、6 和 4、7 和
4、8和 4、9 和 4、10 和 4、1 和 5、2 和 5、3 和 5、4 和 5、5 和 5、6 和 5、7 和 5、8 和 5、9 和 5、10和 5、1 和 6、2 和 6、3 和 6、4 和 6、5 和 6、6 和 6、7 和 6、8 和 6、9 和 6、10 和 6、1 和 7、2 和 7、3和 7、4 和 7、5 和 7、6 和 7、7 和 7、8 和 7、9 和 7、10 和 7、1 和 8、2 和 8、3 和 8、4 和 8、5 和 8、6和8、7和8、8和8、9和8、10和8、1和9、2和9、3和9、4和9、5和9、6和9、7和9、8和9、9 和 9、10 和 9、1 和 10、2 和 10、3 和 10、4 和 10、5 和 10、6 和 10、7 和 10、8 和 10、9 和 10,10和10。
[0094]可使步驟(C)的培養物在生產培養基中生長。
[0095]所述生產培養基可以是基本培養基。
[0096]所述基本培養基不存在選擇劑。
[0097]所述基本培養基不存在預形成的氨基酸或其它復合生物分子。[0098]所述生產培養基可以是復合培養基。
[0099]所述復合培養基可包含酵母提取物、大豆蛋白胨和其它植物蛋白胨的一種或多種。
[0100]可使步驟(C)的培養物生長至高細胞密度。
[0101]所述高細胞密度可以為至少50g/L。
[0102]所述高細胞密度可以為至少100g/L。
[0103]所述高細胞密度可以為至少300g/L。
[0104]所述高細胞密度可以為至少400g/L。
[0105]所述高細胞密度可以為至少500g/L。
[0106]所述高細胞密度可以為至少750g/L。
[0107]可將酵母細胞培養至少20個倍增，并且在至少20個倍增后維持所述多亞基復合物的高水平表達。
[0108]可將所述步驟(C)的細胞培養至少50個倍增并且在所述至少50個倍增后維持所述多亞基復合物的高水平表達。
[0109]可將所述步驟(C )的細胞培養至少100個倍增并且在所述至少100個倍增后維持所述多亞基復合物的高水平表達。
[0110]所述多亞基復合物的至少一個亞基可包含分泌信號。
[0111]所述多亞基復合物可包含抗體。
[0112]分泌信號可包含一種或多種選自:SEQ ID NOS:414至437及其任何組合的多肽。
[0113]所述多亞基復合物可以不是2010年12月I日提交的美國臨時申請號61/418，832,2011年12月I日提交的PCT/US11/62963、2011年12月I日提交的美國序列號13/309，295,2011年12月I日提交的美國序列號13/309，153,2011年12月I日提交的美國序列號13/308，665和2011年12月I日提交的美國序列號13/308，831中公開的抗體的任一種。
[0114]所述多亞基復合物可以不是Abl-NGF、Ab2_NGF、Ab3_NGF、Ab4_NGF、Ab5_NGF、Ab6-NGF、Ab7-NGF、Ab8-NGF、Ab9-NGF、Abl0-NGF、Abll-NGF、Abl2-NGF、Abl3-NGF、Abl4-NGF、Abl5-NGF、Abl6-NGF、Abl7_NGF、Abl8_NGF、Abl9_NGF、Ab20_NGF 和 Ab21_NGF 或 Fab2 或其Fabl片段。
[0115]所述多亞基復合物可以不包含下列抗體的任一種中包含的互補性決定區(OTR)的至少I個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少全部6個:Abl-NGF、Ab2-NGF、Ab3-NGF、Ab4-NGF、Ab5_NGF、Ab6_NGF、Ab7_NGF、Ab8_NGF、Ab9_NGF、Ab IO-NGF, Ab 11-NGF,Abl2-NGF、Abl3-NGF、Abl4_NGF、Abl5_NGF、Abl6_NGF、Abl7_NGF、Abl8_NGF、Abl9_NGF、Ab20-NGF或Ab21-NGF，并且所述抗體任選地具有對于NGF的結合特異性。
[0116]所述多亞基復合物可以不包含如下序列或不由所述序列組成:分別地SEQ IDNO: 51和401的輕鏈和重鏈多肽序列、分別地SEQ ID NO: 53和402的輕鏈和重鏈多肽序列、分別地SEQ ID NO:405和406的輕鏈和重鏈多肽序列和分別地SEQ ID NO:407和408的輕鏈和重鏈多肽序列。
[0117]所述多亞基復合物可以不包含抗體，所述抗體含有SEQ ID N0:55、56、57、58、59和60的⑶R的至少I個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少全部6個的抗體,并且任選地具有對于NGF的結合特異性。
[0118]所述多亞基復合物可以不包含本文中在標題為“抗-NGF抗體及其具有對于NGF的結合活性的結合片段”和“編碼抗-NGF抗體多肽的多核苷酸”的部分中公開的抗體或抗體編碼序列的任一種。在一個方面，本公開提供了產生多亞基復合物的方法，所述方法可包括:培養宿主細胞，提供包含表達所述多亞基復合物的真核細胞的培養物，將大劑量乙醇添加至所述培養物，以及培養所述培養物以產生所述多亞基復合物。多亞基復合物可包含一個或多個二硫鍵，并且可以是抗體。
[0119]乙醇大劑量濃度(表示為％w/v)可以在約0.1%與約5%之間，例如至少約0.1%、至少約0.2%、至少約0.3%、至少約0.4%、至少約0.5%、至少約0.6%、至少約0.7%、至少約0.8%、至少約0.9%、至少約1%、聞達約1%、聞達約1.1%、聞達約1.2%、聞達約1.3%、聞達約1.4%、聞達約1.5%、聞達約1.6%、聞達約1.7%、聞達約1.8%、聞達約1.9%、聞達約2%、聞達約3%、聞達約4%或高達約5%，例如在約0.1%與約1.9%之間、約0.2%與約1.8%之間、約0.3%與約
1.7%之間、約0.4%與約1.6%之間、約0.5%與約1.5%之間、約0.6%與約1.4%之間、約0.7%與約1.3%之間、約0.8%與約1.2%之間或約0.9%與約1.1%之間，例如約0.1%、約0.2%、約0.3%、約 0.4%、約 0.5%、約 0.6%、約 0.7%、約 0.8%、約 0.9%、約 1%、約 1.1%、約 1.2%、約 1.3%、約 1.4%、約 1.5%、約 1.6%、約 1.7%、約 1.8%、約 1.9%、約 2%、約 2.5%、約 3%、約 4% 或約 5%。
[0120]所述方法還可包括所述期望的多亞基復合物的純化。
[0121]在示例性實施方案中，可在添加大劑量乙醇后控制乙醇濃度，這可用于將乙醇濃度維持在期望的設置點或期望的設置點范圍內。設置點(表示為％w/v)可以在約0.1%與約4%之間、至少約0.01%、至少約0.02%、至少約0.04%、至少約0.06%、至少約0.08%、至少約0.1%、至少約0.15%、至少約0.2%、至少約0.25%、至少約0.3%、至少約0.35%、至少約0.4%、至少約0.45%、至少約`0.5%、至少約0.6%、至少約0.7%、至少約0.8%、至少約0.9%、至少約1%、至少約1.2%、至少約1.4%、至少約1.6%、至少約1.8%、至少約2%、高達約4%、高達約3.75%、高達約3.5%、高達約3.25%、高達約3%、高達約2.75%、高達約2.5%、高達約2.25%、高達約2%、高達約1.75%、高達約1.5%、高達約1.25%、高達約1%、約0.01%與約4%之間、約0.02%與約3.75%之間、約0.04%與約3.5%之間、約0.08%與約3.25%之間、約0.1%與約3%之間、約0.2%與約2.75%之間、約0.3%與約2.5%之間、約0.4%與約2.25%之間、約0.5%與約2%之間、約0.6%與約1.75%之間、約0.7%與約1.5%之間或約0.8%與約1.25%之間。例如，設置點可與大劑量濃度相同或在大劑量濃度的正負1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%, 45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% 內。
[0122]可通過在發酵過程中控制酵母細胞的乙醇產生來維持乙醇濃度設置點。例如，可通過增加葡萄糖的濃度(例如，增加葡萄糖進料速度)、減少氧的可用度，通過減少攪拌的強度(例如，降低發酵罐輸入功率)、減少發酵罐中的氣壓、減少供應的空氣或其它氣體混合物的流速、增加培養物的粘性或減少供應空氣或其它氣體混合物中氧的濃度(例如，如果將使用氧補充的話)來增加乙醇濃度。還可通過增加發酵溫度來增加乙醇產生。同樣地，可通過減少葡萄糖濃度(例如，減少葡萄糖進料速率)，通過增加氧的可用度，通過增加攪拌的強度(例如，增加發酵罐輸入功率)、增加發酵罐中的氣壓、增加減少供應的空氣或其它氣體混合物的流速、減小培養物的粘性或增加供應空氣或其它氣體混合物中氧的濃度(例如，如果將使用氧補充的話)來增加乙醇濃度。還可通過降低發酵溫度來增加乙醇產生。
[0123]通過使用本公開內容的方法，相對于常規方法，可將非所需副產物的相對豐度相較于初始豐度水平降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或降至不可檢測
的水平。可這樣降低其相對豐度的示例性非所需副產物可包括一個或多個具有與期望的多亞基復合物不同的表觀分子量的種類。例如，表觀分子量可受到化學計量、折疊、復合物裝配和/或糖基化影響。例如，這樣的非所需副產物可使用尺寸排阻色譜法和/或凝膠電泳來檢測，可具有比期望的多亞基復合物更高或更低的表觀分子量。在示例性實施方案中，可在還原條件下檢測非所需副產物。在其它示例性實施方案中，可在非還原條件下檢測非所需副產物。
[0124]在示例性實施方案中，本公開還提供了以更高產率提供抗體和其它多亞基復合物的重組產生的改進方法和物質組合物。在示例性實施方案中，可使用本文中公開的方法使產率增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少100%或更多(相對于常規方法)。
[0125]在示例性實施方案中，其中可產生多亞基蛋白質的宿主細胞可以是酵母例如畢赤酵母屬的種類，例如巴斯德畢赤酵母或另一種甲醇營養型酵母或在酵母菌屬的種類中例如釀酒酵母或另一種酵母例如裂殖酵母屬(例如，粟酒裂殖酵母(S.pombe))。可用于本發明的甲醇營養型酵母的其它實例包括安格斯畢赤酵母(在本領域中也稱為漢遜酵母)、季也蒙畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、因諾托畢赤氏酵母、緒方奈川氏酵母(Ogataeanitratoaversa)和波伊德氏假絲酵母(Candida boidnii)。
[0126]宿主細胞可以是真核細胞例如酵母細胞，例如甲醇營養型酵母，例如畢赤酵母屬的酵母。畢赤酵母屬示例性甲醇營養型酵母包括巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母和因諾托畢赤氏酵母。宿主細胞可通過交配，例如通過將兩個各自包含一個或多個拷貝的至少一個編碼多亞基復合物的亞基 的基因的二倍體酵母細胞交配來產生。
[0127]在優選實施方案中，畢赤酵母屬的甲醇營養型酵母是巴斯德畢赤醇。宿主細胞可以是二倍體或四倍體細胞。
[0128]編碼期望的多亞基復合物的所述亞基例如所述期望的抗體輕鏈和/或重鏈的所述基因的至少一個，可在如下誘導型或組成型啟動子的控制下表達，例如CUPl (通過培養基中銅的水平誘導的；參見Koller等，Yeast2000 ;16:651_656.)、四環素誘導性啟動子(參見例如，Staib 等，Antimicrobial Agents And Chemotherapy, Jan.2008, p.146 - 156)、硫胺素誘導性啟動子、AOXl、ICLl、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)、FLD1、ADHl、醇脫氫酶I1、GAL4、PH03、PH05和Pyk啟動子、來源于其的嵌合啟動子、酵母啟動子、哺乳動物啟動子、昆蟲啟動子、植物啟動子、爬行動物啟動子、兩棲動物啟動子、病毒啟動子和禽類啟動子。
[0129]宿主細胞可分泌所述期望的多亞基復合物至培養基中。可選擇地或此外，可將所述期望的多亞基復合物保留在所述宿主細胞中，以及可從其分離所述期望的多亞基復合物。
[0130]期望的多亞基復合物可包含抗體，例如單特異性或雙特異性抗體。抗體可以是特異性結合任何抗原的抗體。
[0131]期望的多亞基復合物可以是除了 2010年12月I日提交的美國臨時申請號61/418，832、2011年12月I日提交的PCT/US11/62963、2011年12月I日提交的美國序列號13/309，295、2011年12月I日提交的美國序列號13/309，153、2011年12月I日提交的美國序列號13/308，665和2011年12月I日提交的美國序列號13/308，831中公開的抗體(例如，除抗-NGF抗體的任一種外的抗體)的任一種外的抗體。在示例性實施方案中，期望的多亞基復合物可以不是下列抗體的任一種:Abl-NGF、Ab2-NGF、Ab3-NGF、Ab4-NGF、Ab5-NGF、Ab6-NGF、Ab7-NGF、Ab8-NGF、Ab9-NGF、Abl0-NGF、Abll-NGF、Abl2-NGF、Abl3-NGF、Abl4-NGF、Abl5-NGF、Abl6-NGF、Abl7_NGF、Abl8_NGF、Abl9_NGF、Ab20_NGF 和 Ab21_NGF。在示例性實施方案中，期望的多亞基復合物可以是不是下列抗體的任一種的Fab2片段:Abl-NGF、Ab2-NGF、Ab3-NGF、Ab4_NGF、Ab5_NGF、Ab6_NGF、Ab7_NGF、Ab8_NGF、Ab9_NGF、AbIO-NGF,Ab11-NGF, Abl2-NGF、Abl3_NGF、Abl4_NGF、Abl5_NGF、Abl6_NGF、Abl7_NGF、Abl8_NGF、Abl9-NGF、Ab20-NGF和Ab21-NGF。在其它示例性實施方案中，期望的多亞基復合物可以不是下列抗體的任一種的 Fabl 片段:Abl-NGF、Ab2_NGF、Ab3_NGF、Ab4_NGF、Ab5_NGF、Ab6-NGF、Ab7-NGF、Ab8-NGF、Ab9-NGF、Abl0-NGF、Abll-NGF、Abl2-NGF、Abl3-NGF、Abl4-NGF、Abl5-NGF、Abl6-NGF、Abl7-NGF、Abl8-NGF、Abl9-NGF、Ab20-NGF和Ab21-NGF。在其它示例性實施方案中，期望的多亞基復合物可以不包含抗體，所述抗體包含下列抗體的任一種中包含的互補性決定區(CTR)的至少I個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少全部
6個:Abl-NGF、Ab2-NGF、Ab3-NGF、Ab4-NGF、Ab5-NGF、Ab6-NGF、Ab7-NGF、Ab8-NGF、Ab9-NGF、AblO-NGF, Abll-NGF, Abl2_NGF、Abl3_NGF、Abl4_NGF、Abl5_NGF、Abl6_NGF、Abl7_NGF、Abl8-NGF、Abl9-NGF、Ab20_NGF或Ab21_NGF，并且任選地具有對于NGF的結合特異性。例如，期望的多亞基復合物可以不包含或可以不由如下多肽序列組成:分別地SEQ ID NO:51和401的輕鏈和重鏈多肽序列、分別地SEQ ID NO: 53和402的輕鏈和重鏈多肽序列、和/或分別地SEQ ID NO:405和406的輕鏈和重鏈多肽序列和/或分別地SEQ ID NO:407和408的輕鏈和重鏈多肽序列。作為其它實例，期望的多亞基復合物可以不包含抗體，所述抗體包含SEQ ID NO:55、56、57、58、59和60的⑶R的至少I個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少全部6個的抗體，并且任選地具有對于NGF的結合特異性。
[0132]期望的多亞基復合物可包含任何類型的抗體。示例性抗體類型包括任何哺乳動物種類例如人、小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、牛等的抗體。優選，抗體是人抗體或可具有兔來源的人源化抗體。期望的抗體可以是單價、雙介或多價抗體。
[0133]可最優化基因的至少一個以在所述宿主細胞中表達(例如，通過選擇優選密碼子和/或通過密碼子選擇改變AT的百分比)，所述基因在所述小組的所述宿主細胞的至少一種中提供所述多亞基復合物的亞基例如期望的抗體的輕鏈和/或重鏈的表達。
[0134]所述期望的多亞基復合物例如期望的抗體的純度可通過測量由所述宿主細胞產生的期望的多亞基復合物的分數和/或通過測量多亞基復合物的特異性活性(例如，特異性結合期望的抗體的靶)來評估，所述多亞基復合物是非糖基化的，包含在具有預期的表觀流體力學半徑和/或表觀分子量(例如通過尺寸排阻色譜法測量的)的復合物中，具有預期的電泳遷移率(例如，通過凝膠電泳，例如SDS-PAGE，和任選地Western印跡所檢測)。
[0135]期望的多亞基復合物可以是抗體，并且所述抗體的產率可通過測定扣除任何產物相關變體的由所述宿主細胞產生的期望抗體的量來評估，所述變體被異常糖基化，包含在除具有預期的表觀分子量或流體力學半徑的復合物外的抗體復合物中，和/或不能特異性結合所述期望的抗體的靶。
[0136]主題方法可產生至少100mg/L、至少150mg/L、至少200mg/L、至少250mg/L、至少 300mg/L、100 至 300mg/L、100 至 500mg/L、100 至 1000mg/L 或超過 1000mg/L 例如高至1200mg/L、高至10，000mg/L或更高的上清液抗體滴度。
[0137]在另一個方面，產生期望的多亞基復合物宿主細胞可以是畢赤酵母屬的雙倍體或四倍體細胞，例如巴斯德畢業赤酵母細胞。可將提供所述期望的多亞基復合物的亞基例如期望的抗體的輕鏈和重鏈的表達的基因整合到所述宿主細胞的基因組，和/或可將其包含在染色體外元件、質粒或人工染色體上。
[0138]在另一個方面，產生期望的多亞基復合物的宿主細胞可經工程化以增加產率和/或純度，例如如在2011年8月31日提交的美國臨時申請序列號61/525，307(代理人案卷號67858.730200)(所述美國臨時申請序列通過引用整體并入本文)中進一步描述的。如其中所描述的，可通過改變每細胞編碼每一個亞基的基因的拷貝數來極大地改善抗體或其它多亞基復合物的產率和純度。例如，當其中的多亞基復合物是抗體時，宿主細胞可包含比提供重鏈的表達的基因的拷貝更多的拷貝的提供輕鏈的表達的基因。在示例性實施方案中，宿主細胞可包含1-10個拷貝的編碼輕鏈的基因和1-10個拷貝的編碼重鏈的基因。所述宿主細胞中編碼重鏈的基因的拷貝數和編碼輕鏈的基因的拷貝數分別地各自可以為:2和2、2和3、3和3、3和4、3和5、4和3、4和4、4和5、4和6、5和4、5和5、5和6或5和7。重鏈和輕鏈基因拷貝數的另外的示例性組合包括達到10個拷貝的重鏈和/或輕鏈基因的任意組合，例如 H2xLl、H3xLl、H4xLl、H5xLl、H6xLl、H7xLl、H8xLl、H9xLl、HlOxLl、HlxL2、H2xL2、H3xL2、H4xL2、H5xL2、H6xL2、H7xL2、H8xL2、H9xL2、H10xL2、HlxL3、H2xL3、H3xL3、H4xL3、H5xL3、H6xL3、H7xL3、H8xL3、H9xL3、H10xL3、HlxL4、H2xL4、H3xL4、H4xL4、H5xL4、H6xL4、H7xL4、H8xL4、H9xL4、H10xL4、HlxL5、H2xL5、H3xL5、H4xL5、H5xL5、H6xL5、H7xL5、H8xL5、H9xL5、H10xL5、HlxL6、H2xL6、H3xL6、H4xL6、H5xL6、H6xL6、H7xL6、H8xL6、H9xL6、H10xL6、HlxL7、H2xL7、H3xL7、H4xL7、H5xL7、H6xL7、H7xL7、H8xL7、H9xL7、H10xL7、HlxL8、H2xL8、H3xL8、H4xL8、H5xL8、H6xL8、H7xL8、H8xL8、H9xL8、H10xL8、HlxL9、H2xL9、H3xL9、H4xL9、H5xL9、H6xL9、H7xL9、H8xL9、H9xL9、H10xL9、HlxLlO、H2xL10、H3xL10、H4xL10、H5xL10、H6xL10、H7xL10、H8xL10、H9xL10、HlOxLlO，其中“H”后的數字標明重鏈基因的拷貝數，“L”后的數字標明輕鏈基因的拷貝數。例如，指定數目的重鏈和輕鏈基因拷貝可被串聯地整合到單個基因座，或整合到多個基因座(所述基因座的任一個或全部可包含超過一個拷貝)。任選地，每一個基因組基因座可包含超過3或4個串聯整合的基因拷貝，從而在擴增和/或抗體產生過程中增強拷貝數穩定性。
[0139]培養最常見地包括給細胞提供能源、氧和營養物。用于用于表達重組蛋白質的巴斯德畢赤酵母發酵的設計和最優化(包括細胞密度、液體培養基體積、底物進料速度以及反應的每一個時期的長度的最優化)的方法在文獻中也是已知的。參見Zhang等，“Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations^inCregg, J.M., Ed., 2007, Pichia Protocols (第 2 版)，Methods in Molecular Biology,第389卷，Humana Press, Totowa, N.J.,第43_63頁。可給培養物提供包含氧的氣體混合物，例如補充有氧或未補充氧的空氣。可將酵母培養物培養在可以為基本培養基，可以不存在選擇劑和/或可以不存在預形成的氨基酸或其它復合生物分子的培養基中。培養基還可以是復合培養基(例如，包含酵母提取物和/或植物蛋白胨)。培養基可包含氮源(例如，甲胺氯、NH4S04、酵母提取物、大豆蛋白胨、其它植物蛋白胨等)。示例性基本培養基包括基本葡萄糖培養基(MD) (1.34%酵母氮源基礎(YNB)(無氨基酸)、4X 10_5%生物素和2%葡萄糖)、緩沖的基本甘油復合培養基(BMGY) (1%酵母提取物、2%蛋白胨、1%甘油、1.34%YNB (無氨基酸)、4X 10 - 5%生物和IOOmM磷酸鉀(pH6.0))。培養基可包含一種或多種鹽(例如氯化鈉、氯鈣、氯化鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(例如磷酸鉀、Tris或HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如，添加以抑制污染物的生長和/或維持可選擇標記)、痕量元素以及葡萄糖或另一種能源。還可以對于本領域技術人員來說是已知的適當的濃度包含任何補充物和替代物。
[0140]可使培養物生長至高細胞密度，例如至少50g/L、至少100g/L、至少300g/L、至少400g/L、至少500g/L或至少700g/L。這些培養物密度是舉例說明性的而非限定性的，并且適合的培養物密度可由本領域技術人員來容易地確定。
[0141]可將酵母細胞培養至少20個倍增并且在所述至少20個倍增后維持所述抗體的高水平表達。
[0142]可將酵母細胞培養至少50個倍增并且在所述至少50個倍增后維持所述抗體的高水平表達。
[0143]可將酵母細胞培養至少100個倍增并且在所述至少100個倍增后維持所述抗體的高水平表達。
[0144]在另一個方面，本公開提供了包含按照前述方法的任何方法產生的穩定的二倍體畢赤酵母屬酵母培養物的培養基，其中培養基可包含所述期望的抗體的表達水平，所述表達水平可以為至少約 50mg/L、100mg/L、500mg/L、750mg/L、1000mg/L、1250mg/L、1500mg/L、1750mg/L、2000mg/L或更高。這些產率值是舉例說明性的而非限定性的。任選地，可以例如使用、Zhang等(2007)(同上)中描述的方法和一般途徑最優化產率。例如，可通過改變溫度、pH、培養基組成(例如，碳源、碳源濃度、兩種或更多種碳源的混合物、氮源和濃度、鹽和營養物(包括KH2P04、K2HPO4, MgSO4、`硫酸鉀、檸檬酸鈉、硫酸鉀、檸檬酸鈉、痕量金屬例如氯化鈷、硫酸銅、碘化鈉、硫酸鎂、鑰酸鈉、硼酸、氯化鋅、硫酸亞鐵、維生素例如生物素、肌醇、硫胺素、蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白氨基酸、尿素、磷酸銨或其它銨離子、L-精氨酸-鹽酸鹽))、時間、培養物密度、充氧以及其它影響產率的其它因素來最優化產率。例如，期望的多亞基復合物的產率、表達和/或純度可在一些情況下通過將溫度維持在期望的設置點例如約15°C至約30°C (例如約17°C至約25°C)的設置點上來進行改善。不希望被理論束縛，假設控制溫度可通過折疊和翻譯后加工途徑來幫助細胞內運輸，和/或可減小細胞蛋白酶的活性。同樣地，期望的多亞基復合物的產率、表達和/或純度可在一些情況下通過將培養基的PH維持在期望的設置點例如pH3至pH8 (例如pH4至pH7)的設置點上來進行改善。
[0145]在另一個方面，本公開提供了包含按照前述方法的任何方法產生的穩定的二倍體巴斯德畢赤酵母的培養基，所述方法將所述期望的抗體表達進入培養基，其中所述培養物中的所述二倍體細胞的細胞密度可以為至少約50g/L、100g/L、300g/L、400g/L、500g/L、700g/L或更多。這些培養物密度是舉例說明性的而非限定性的，適當的培養物密度可由本領域技術人員來容易地確定。
[0146]所述抗體或其它多亞基蛋白質的至少一個亞基可包含分泌信號，例如S.chicken溶菌酶(CLY)信號肽；CLY-L8 ;釀酒酵母轉化酶(SUC2)信號肽；MF_ a (Prepro)；MF-a (Pre) -apv ；MF-a (Pre) -apv-SLEKR ；MF-a (Prepro) - (EA) 3 ; a F 信號肽；KILM1 信號肽；可抑制的酸性磷酸酶(PHOl)信號肽；黑曲霉GOX信號肽；西方許旺酵母葡糖淀粉酶基因(GAMl)信號肽；無前導序列的人血清白蛋白(HSA)信號肽；具有前導序列的人血清白蛋白(HSA)信號肽；ISN信號肽；IFN信號肽；HGH信號肽；植物血細胞凝集素(PHA) ；SiIkworm溶菌酶；人溶菌酶(LYZl);活化素受體I型；活化素受體II型受體；巴斯德畢赤酵母免疫球蛋白結合蛋白(PpBiP);人抗體3D6輕鏈前導序列；及其任意組合。
[0147]宿主細胞可通過交兩個二倍體酵母細胞交配來產生，所述酵母細胞各自包含一個或多個拷貝的編碼所述抗體或其它多亞基蛋白質的一個或多個亞基的基因。
[0148]附圖簡述
[0149]圖1A-B.通過在葡萄糖進料開始之前在從其產生抗體的酵母培養物中添加大劑量乙醇來改善重組產生的Ab-A的純度。在97小時的培養后收集抗體，通過蛋白A親和進行純化，隨后使用非還原性凝膠(圖1A)拆分期望的完全抗體(箭頭，“完全Ab (H2L2) ”)與不期望的產物相關變體，通過SDS-PAGE來評估純度。基于它們的分子量、對于蛋白A的親和力以及下文中進一步描述的其它研究，將具有異常化學計量的復合物鑒定為包含一個重鏈和一個輕鏈(箭頭，“H1L1”)的“半抗體”種類和包含兩個重鏈和一個輕鏈(“H2L1”)的復合物。可通過在抗體產生過程中大劑量添加乙醇來極大減小H2L1和HlLl復合物的相對豐度。比較圖1A的泳道2-3 (無大劑量)與泳道5 (具有大劑量)。圖1B顯示在還原條件下處理的相同樣品，所述處理將每一個完全抗體HlLl和H2L1復合物分離成單個重鏈和輕鏈，從而確認HlLl和H2L1復合物由全長重鏈和輕鏈組成。圖1A-B中的泳道順序:泳道1:分子量標準；泳道2和3:在不大劑量添加乙醇的情況下從發酵培養物制備的對照樣品；泳道4:無樣品；樣品5:在大劑量添加乙醇的情況下從發酵培養物制備的樣品。
[0150]圖1C-E顯示沿著非`還原凝膠的長度繪制的凝膠條帶強度(圖1A，分別地泳道2、3和5);箭頭鑒定對應于HlLl種類的峰。圖1F將圖1C-E中顯示的HlLl峰中包含的面積繪制成表，顯示了 HlLl復合物的相對豐度的約90%的降低。H2L1復合物豐度因與完全抗體峰的不完全拆分而未被定量。
[0151]圖2A-B和3A-B顯示通過向酵母培養物添加大劑量乙醇產生的Ab-A的純度的改善的重現性。在87或86小時的培養后(分別地圖2和3)收集抗體，通過蛋白A親和進行純化，隨后使用非還原凝膠通過SDS-PAGE評估純度。再次通過大劑量乙醇添加來降低HlLl和H2L1復合物(箭頭)的豐度。將圖2A的泳道3 (無大劑量)與泳道2 (具有大劑量)相比較，將圖3A的泳道4-6 (無大劑量)與泳道2和4(具有大劑量)相比較。圖2B顯示在還原條件下處理的與圖2A中相同的樣品，再次確認觀察到的產物相關變體由全長重鏈和輕鏈組成。圖2A-B中的泳道順序:泳道1:分子量標準；泳道2:在大劑量添加乙醇的情況下從發酵培養物制備的樣品；泳道3:在不大劑量添加乙醇的情況下從發酵培養物制備的對照樣品。圖3A中的泳道順序:泳道1:分子量標準；泳道2和4:在大劑量添加乙醇的情況下從發酵培養物制備的樣品；泳道3:無樣品；泳道5-7:在不大劑量添加乙醇的情況下從發酵培養物制備的對照樣品。
[0152]圖2C和2D顯示沿著非還原凝膠的長度繪制的凝膠條帶強度(圖2A，分別地泳道2和3);箭頭鑒定對應于HlLl種類的峰。圖2E和3B將圖2C和圖3A中顯示的HlLl峰中包含的面積繪制成表，顯示了圖2A中的HlLl復合物的相對豐度的約85%的降低，和圖3A中的HlLl復合物的相對豐度的約87%的平均降低。
[0153]圖4A-D.通過在發酵過程的生產期之前大劑量添加乙醇也改善第二重組抗體(，，Ab-B，，)的純度。在67小時(“T67)或87小時(“T87”)的培養(分別地，圖4A-B和4C-D)后收集發酵培養液體培養基的樣品，通過蛋白A親和純化抗體。隨后，使用非還原凝膠通過SDS-PAGE評估純度(圖4A和4C)。在兩個評估的時間點上，相對于未接受大劑量乙醇添加的對照培養物，在接受大劑量乙醇添加的制備的發酵培養物中半抗體種類(HlLl)和H2L1復合物的豐度大大降低。將圖4A的泳道2-3 (無大劑量)與泳道6_7(具有大劑量)相比較，以及將圖4C的泳道2-3(無大劑量)與泳道6-7(具有大劑量)相比較。圖4B和4D顯示在還原條件下處理的相同樣品。圖4A-D的泳道順序:泳道1:分子量標準；泳道2-3:在不大劑量添加乙醇的情況下從發酵培養物制備的對照樣品；泳道4-5:無樣品；泳道6-7:在大劑量添加乙醇的情況下從發酵培養物制備的樣品。
[0154]圖4E和4F將分別在圖4A(T67)和4C(T87)中顯示的HlLl峰中包含的面積繪制成表，顯現了乙醇的大劑量添加產生圖4A中顯示的較早時間點上HlLl復合物的相對豐度的約73%的降低和圖4C中顯示的較晚時間點上HlLl復合物相對豐度的約34%的平均降低。
[0155]圖5A-B.通過在發酵過程的生產期之前大劑量添加乙醇也改善第三重組抗體(”Ab-C”)的純度。在86小時的培養(圖5A)后收集抗體，通過蛋白A親和純化抗體，隨后，使用非還原凝膠通過SDS-PAGE評估純度(圖5A)。即使在不大劑量添加乙醇的情況下在Ab-C產物中HlLl和H2L1復合物不太豐富，留了更少的改善空間。然而，相對于未接受大劑量乙醇添加的對照培養物,在接受大劑量乙醇添加的發酵培養物中半抗體種類(HlLl)和H2L1復合物的豐度顯著降低。將圖5A的泳道5-6 (無大劑量)與泳道3 (具有大劑量)相比較。圖5B顯示在還原條件下處理的相同樣品。圖5A-B的泳道順序:泳道1:分子量標準；泳道2:無樣品；泳道3:在接受大劑量乙醇添加的情況下從發酵培養物制備的對照樣品；泳道4:無樣品；泳道5-6:從未接受大劑量乙醇添加的發酵培養物制備的對照樣品。
[0156]圖5C將圖5A中顯示的HlLl峰中包含的面積繪制成表，顯示了通過大劑量添加乙醇產生的HlLl復合物的相對豐度的約61`%的平均降低。
[0157]圖6A-F顯示通過尺寸排阻色譜法產生的圖1-3中顯示的Ab-A制劑的相對純度。在每一個小組中，主峰包含含有兩個重鏈和兩個輕鏈(H2L2)的完全抗體。通過該方法未能將HlLl種類與主峰相區分(據認為歸因于通過在使用的條件下保留的非共價締合產生的HlLl 二聚體形成)。然而，檢測到其它不期望的產物相關變體，包括更高分子量的種類(主峰的左邊)和更低分子量的種類(主峰的右邊)。檢測到被認為對應于包含兩個完全抗體(H4L4)的抗體二聚體的主峰(箭頭)，并且這類抗體的相對豐度在從接受大劑量乙醇添加的發酵培養物制備的樣品中降低。將圖6A、6C和6E (無大劑量)與圖6B、6D和6F(具有大劑量)相比較。
[0158]圖7概述了通過圖6中顯示的6個Ab-A樣品和5個另外的樣品的SEC檢測的產物相關變體的量的定量。對于每一個鑒定的樣品(第I列)，顯示了運行設置號(第2列，標識平行進行的發酵運行)、添加的大劑量(10g/L或無，第3列)和在獲取和處理培養樣品前消耗的培養時間(第4列)以及在主峰中檢測到的蛋白質的分數(“SEC主峰％”，第5列)。生長期結束時乙醇的大劑量添加使主峰中包含的平均百分比從80.3%增加至90.6%。[0159]圖8概述了通過圖4中顯示的Ab-B抗體樣品的SEC檢測到的產物相關變體的量的定量。對于每一個發酵運行(第I列)，顯示了在生長期結束時添加的大劑量(10g/L或無，第2列)，和在獲取和處理培養樣品前消耗的培養時間(第3列)以及主峰中檢測到的蛋白質的分數(“SEC主峰%，，，第4列)。總體純度增加，主峰在T67時從76%增加至79%，在T87時從60%增加至73%。
[0160]圖9概述了通過圖5中顯示的Ab-C抗體樣品的SEC檢測到的產物相關變體的量的定量。對于每一個鑒定的發酵運行(第I列)，顯示了添加的大劑量(10g/L或無，第2列)，和在獲取和處理樣品前消耗的培養時間(第3列)以及主峰中檢測到的蛋白質的分數(“SEC主峰％”，第4列)。在總體純度上幾乎無差異，如通過該方法檢測到的，在利用大劑量乙醇或不利用大劑量乙醇的情況下約89%的產物包含在主峰中。這顯然歸因于即使在不添加大劑量乙醇的情況下Ab-C抗體的高初始純度。此外，SEC未將HlLl種類與完全抗體相區分，相應地歸因于大劑量乙醇的該種類的減少的產生未反映在SEC結果中。
[0161]圖10概述了包含高量或低量HlLl條帶的Ab-A樣品中的游離重鏈(不存在對第二重鏈的二硫鍵)的量的質譜測量的結果。如所預期的，游離重鏈的量與HlLl條帶的量相關，確認了其身份為包含一個重鏈和一個輕鏈并且不存在對第二重鏈的二硫鍵。
[0162]圖11-13顯示了大劑量乙醇添加與細胞活力之間的關系。大劑量乙醇的添加通常改善細胞活力以及Ab-A抗體(圖11)和Ab-B抗體(圖12)的抗體純度。這些結果表明細胞活力的改善可至少部分負責通過大劑量乙醇添加產生的抗體純度的改善。與這些結果一致，Ab-C抗體培養物顯示比Ab-A和Ab-B培養物更高的抗體純度和細胞活力(圖13)。顯然，因為Ab-C抗體產生性培養物的活力在這些實驗中已經很高，所以幾乎沒有改善的空間，并且培養物在大劑量添加乙醇的情況下顯示幾無改善。在圖11-13，實心條棒表示無大劑量乙醇添加，然而空心條棒表示乙醇的大劑量添加。從在1.5小時(在該時間上收集樣品以進行純度分析)取樣的發酵培養物測定活力(如在先前載片中鑒定的)。
`[0163]圖14顯示寬范圍的乙醇大劑量濃度可產生抗體純度的相同改善。在大劑量添加5g/L (0.5%w/v)至15g/L(l.5%w/v)的乙醇的情況下產生Ab-A,通過蛋白A親和進行純化，隨后通過非還原SDS-PAGE分析純度。每一個培養物在第63小時(圖14A)和第86小時(圖14B)顯示相似的低H2L1和HlLl復合物水平。圖14A-B中的泳道順序:泳道1:分子量標準；泳道2和7:5g/L大劑量；泳道3和5:10g/L大劑量；泳道4和6:15g/L大劑量。
[0164]圖15顯示溶解氧劇增與乙醇大劑量添加之間過去的時間可進行相當大的變化，然而產生相似的抗體純度的改善。在大劑量添加10g/L(l%W/v)的乙醇的情況下產生Ab-A，通過蛋白A親和進行純化，隨后通過非還原SDS-PAGE分析純度(圖15A)。“饑餓期”(溶解氧劇增(表明培養物中碳源的耗盡)與大劑量添加乙醇之間的時間)在O與3小時之間變化。每一個培養物顯示相似的低H2L1和HlLl復合物的水平，無論饑餓期的持續時間多長，這表明抗體純度對饑餓期的不存在或至少達到3小時的饑餓期相對不敏感。在還原凝膠上分析相同樣品(圖15B)。圖15A-B中的泳道順序:泳道1:分子量標準；泳道2-4:無樣品；泳道5:0小時饑餓期；泳道6:3小時饑餓期。
[0165]圖16顯示平衡期(大劑量乙醇添加與開始進料之間的時間)對抗體純度的作用。在大劑量添加10g/L(l%w/v)的乙醇的情況下產生Ab-B抗體,通過蛋白A親和進行純化,隨后通過非還原SDS-PAGE分析純度(圖16A)。平衡期的持續時間為0、30或60分鐘。60分鐘的平衡期導致更低的抗體純度(更高的H2L1和HlLl復合物豐度)。對于60分鐘的平衡期，特別在培養早期(在第23小時，圖16B)，培養物活力也顯著下降；到培養結束時(在第85小時，圖16C)，活力略有改善。圖16A中的泳道順序:泳道1:分子量標準；泳道2和4:無樣品；泳道3:30分鐘的平衡；泳道5和6:60分鐘的平衡時間；泳道7和8:0分鐘的平衡時間。在圖16B-C中，實心條棒表示O分鐘的平衡期，陰影線條棒表示30分鐘的平衡期，空心條棒表示60分鐘的平衡期。
[0166]詳細描述
[0167] 申請人:已意外地發現從酵母表達的多亞基復合物的純度可通過向培養基添加大劑量乙醇來極大地改善。已顯示乙醇的單次大劑量添加在長達至少97小時的持續生產時期中改善純度。
[0168]本公開提供了主題方法和組合物，所述方法和組合物以增加的純度和減少的一種或多種非所需副產物的產量提供抗體和其它多亞基復合物的重組產生。在示例性實施方案中，相對于期望的多亞基復合物，不期望的產物可顯示如下的一項或多項:改變的化學計量、異常糖基化、表觀分子量的差異、二硫鍵的差異、流體力學半徑的差異、一個或多個亞基的片段和/或截短形式。非所需副產物可同樣地顯示一個或多個另外的差異。非所需副產物還可通過它們對制劑的作用，例如特異性活性的水平、免疫原性的改變，或對期望的多亞基復合物的物理構造和/或功能的其它作用來檢測。
[0169]例如，當期望的多亞基復合物是抗體時，非所需副產物可包括HlLl或“半抗體”種類(即，包含重鏈和輕鏈，其中重鏈未通過二硫鍵連接至另一個重鏈)，和/或H2L1種類(即，包含兩個重鏈和一個輕鏈，但不存在第二輕鏈)。
[0170]然而不希望被理論束縛，假設乙醇濃度的快速增加(這可通過大劑量添加乙醇來產生)可引起基因表達的持續改變，這賦予了正確折疊和裝配的多亞基復合物的持續改善和/或增加了不正確折疊或錯誤裝配的多亞基復合物的加工，從而導致多亞基復合物的改善的純度。此外，已顯示改善的抗體純度與培養物中酵母的改善的活力相關，并且在此基礎上 申請人:假設改善的活力可負責(至少部分)改善的純度，然而該理論無意是限定性的。
[0171] 在優選實施方案中，異源多亞基復合物是抗體或抗體片段，例如人源化抗體，其由兩個重鏈亞基和兩個輕鏈亞基組成。優選宿主細胞包括酵母，特別優選酵母包括甲醇營養型酵母菌株，例如巴斯德畢赤酵母、多形漢森酵母(安格斯畢赤酵母)、季也蒙畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、因諾托畢赤氏酵母等等(參見，例如，美國專利4，812，405,4, 818，700、4，929，555,5, 736，383,5, 955，349,5, 888，768 和 6，258，559，所述美國專利的每一個通過引用整體并入本文)。宿主細胞可通過本領域已知的方法例如轉化、交配、芽孢形成等來產生。
[0172]在優選實施方案中，宿主細胞可包含超過一個拷貝的編碼異源蛋白質亞基的基因的一個或多個基因。例如，可將多拷貝的亞基基因以串聯方式整合到一個或多個染色體基因座。患聯整合的基因拷貝在產生多亞基復合物的培養過程中優選以穩定拷貝數得以保留。例如，在上述實例中，對于包含3至4個串聯整合的拷貝的輕鏈和重鏈抗體基因的巴斯德畢赤酵母菌株，基因拷貝數通常是穩定的。
[0173]優選將編碼異源蛋白質亞基的基因的一個或多個基因整合到宿主細胞的一個或多個染色體基因座。任何適當的染色體基因座可用于整合，包括基因間序列、啟動子序列、編碼序列、終止序列、調控序列等。可用于巴斯德畢赤酵母的示例性染色體基因座包括PpURA5 ；0CH1 ；A0X1 ;HIS4和GAP。還可將編碼基因整合到一個或多個隨機染色體基因座而非被靶向的基因座。在優選實施方案中，染色體基因座選自PGAP基因座、3’AOX TT和HIS4TT基因座。在另外的示例性實施方案中，可將編碼異源蛋白質亞基的基因可包含在一個或多個染色體外元件例如一個或多個質粒或人工染色體中。
[0174]在示例性實施方案中，多亞基蛋白質可包含2、3、4、5、6或更多個非相同的亞基。此外，每一個亞基可在每一個多亞基蛋白質中存在I次或多次。例如，多亞基蛋白質可以是多特異性抗體例如包含兩個不相同的輕鏈和兩個不相同的重鏈的雙特異性抗體。
[0175]可從單順反子基因、多順反子基因或其任意組合表達亞基。每一個多順反子基因可包含多個拷貝的相同亞基，或可包含一個或多個拷貝的每一種不同的亞基。
[0176]可用于操作巴斯德畢赤酵母的示例性方法(包括培養、轉化和交配的方法)公開于公布的申請包括 U.S.20080003643、U.S.20070298500 和 U.S.20060270045 中以及 Higgins, D.R.和 Cregg, J.M.，Eds.1998.Pichia Protocols.Methods in MolecularBiology.Humana Press, Totowa, N.J.和 Cregg, J.M., Ed., 2007, Pichia Protocols (第 2版)，Methods in Molecular Biology.Humana Press, Totowa, N.J.(將上述資料的每一份資料通過引用整體并入本文)中。
[0177]可使用的示例性表達盒由整合至編碼分泌信號的序列的甘油醛脫氫酶基因(GAP基因)啟動子、隨后待表達的基因的序列、隨后編碼巴斯德畢赤酵母轉錄終止信號(來自巴斯德畢赤酵母醇氧化酶I基因(A0X1)的轉錄終止信號)的序列組成。Zeocin抗性標記基因可提供通過選擇抗更高水平的Zeocin的轉化子，來富集在菌株中包含多個整合的拷貝的表達載體的菌株的方法。類似地，G418或卡那霉素抗性標記基因可用于提供通過選擇抗更高水平的遺傳霉素或卡那霉素的轉化子，來富集在菌株中包含多個整合的拷貝的表達載體的菌株的方法。
[0178]可使用的宿主菌株包括營養缺陷型巴斯德畢赤酵母或其它畢赤酵母屬菌株，例如在metl、lyS3、ura3和adel或其它營養缺陷型相關基因中具有突變的菌株。優選突變不能以任何可評估的頻率產生回復子并且優選地是部分突變體或甚至更優選是完全缺失突變體。優選地，原養型二倍體或四倍體菌株可通過將互補組的營養缺陷型菌株交配來產生。
[0179]二倍體巴斯德畢赤酵母菌株的轉化以及巴斯德畢赤酵母有性周期的遺傳操作可如 Pichia Protocols (1998, 2007)(同上)中所述來進行。
[0180]在轉化之前，每一個表達載體可通過與靶基因組基因座(例如，GAP啟動子序列)同源的區域內的限制 性內切酶切割進行線性化來指導載體至宿主細胞的靶基因座內的整合。隨后可通過電穿孔或其它方法將每一個載體的樣品單個地轉化進入期望的菌株的培養物，成功的轉化體可通過可選擇標記例如抗生素抗性或營養缺陷型的互補作用來選擇。可挑揀分離株，在選擇條件下將其劃線培養以產生單個菌落，隨后通過對從每一個菌株提取的基因組DNA進行Southern印跡或PCR測定來檢查，以確認編碼多亞基復合物(例如，期望的抗體)的亞基的基因的拷貝數。任選地，預期的亞基基因產物的表達可以例如通過FACS、Western印跡、菌落轉移檢測和免疫印跡和本領域已知的其它方法來確認。任選地，額外地多次轉化二倍體分離株以將額外的異源基因例如額外拷貝數的相同亞基和/或額外拷貝數的不同亞基整合在不同的基因座中。隨后將二倍體菌株交配以產生能夠合成多蛋白復合物的二倍體菌株(或更高倍體的菌株)。每一個預期的亞基基因的存在可通過Southern印跡、PCR和本領域已知的其它檢測方法來確認。當期望的多蛋白復合物是抗體時，其表達還可通過菌落轉移檢測/免疫印跡法(Wung等Biotechniques21808_812 (1996)和/或通過FACS來確認。
[0181]任選地重復該轉化方案以將異源基因靶向第二基因座中，所述第異源基因可以是與被靶向第一基因座的基因相同的或不同的基因。當待整合到第二基因座中的構建體編碼與由第一基因座編碼的序列相同或高度相似的蛋白質時，可改變其序列減少不期望的至第一基因座中的整合的概率。例如,待整合到第二基因座中的序列相對于整合到第一基因座的序列，可具有啟動子序列、終止序列、密碼子選擇的差異和/或其它可耐受的序列差異。
[0182]為了交配巴斯德畢赤酵母二倍體菌株，將待雜交的每一個菌株一起涂板在交配板上。例如，可通過將每一個待交配的菌株在適合于其生長的板上劃線培養來方便地同時進行多個交配，可將交配伴侶在第二塊板(優選該板是豐富培養基例如YPD)上劃線培養。通常地，在于30°C溫育I或2天后，可將兩塊板以交叉的方式模印涂板至交配板上，這導致每一對菌株被共涂板并且在一對原始脈線的交叉點上具有交配的可能的交叉影線械。隨后可溫育(例如，在30°C)交配板以刺激兩個菌株之間的交配開始。在約2天后，可將交配板上的細胞劃線培養，涂板，或模印涂板至對期望的二倍體菌株具有選擇性的培養基上(例如，當交配的菌株具有互補自養作用時，可使用省卻培養基或基本培養基板)。可溫育(例如，在30°C)這些板進行適當的持續時間(例如，約3天)以允許期望的二倍體菌株選擇性生長。可挑揀產生的菌落，將其劃線以分離單個菌落，純化每一個二倍體菌落。
[0183]用于本發明的方法的表達載體還可包括酵母特異性序列，包括用于鑒定轉化酵母菌的可選擇營養缺陷型或藥物標記。藥物標記還可用于在酵母宿主細胞中擴增載體的拷貝數，例如通過在濃度升高的藥物中培養一群細胞，從而選擇表達升高的水平的抗性基因的轉化體來進行擴增。
[0184]在示例性實施方案中，將編碼異源蛋白質亞基的基因的一個或多個基因偶聯至誘導型啟動子。適當的示例性啟動子包括醇氧化酶I基因啟動子、甲醛脫氫酶基因(FLD ;參見美國公布N0.2007/0298500)和本領域已知的其它誘導型啟動子。醇氧化酶I基因啟動子在最常用的碳源例如葡萄糖、甘油或乙醇上在酵母生長過程中被嚴格抑制，但在甲醇上在生長過程中被高度誘導(Tschopp等，1987 ;屬于Stroman, D.W.等的美國專利N0.4，855，231)。為了產生外來蛋白質，最初將菌株生長在抑制性碳源上，以產生生物質，隨后轉移至甲醇(作為唯一(或主要)碳源和能源)來誘導外來基因的表達。該調控系統的一個有利方面是可通過在抑制性條件下生長來維持利用外來基因(其表達產物對于細胞是有害的)轉化的巴斯德畢赤酵母菌株。
[0185]在另一個示例性實施方案中，可將異源基因的一個或多個基因偶聯至其表達水平在適當的條件下被上調的調控型啟動子。示例性調控啟動子包括CUPl啟動子(被培養基中的銅的水平誘導的)、四環素誘導性啟動子、硫胺素誘導性啟動子、AOXl啟動子和FLDl啟動子。
[0186]雖然本發明公的大部分開內容描述抗體的產生，但本文中描述的方法可被容易地改造來同樣地適用于其它多亞基復合物。不希望受理論限制，據信多亞基復合物的產率和純度可受到亞基的濃度和化學計 量的巨大影響，這轉而受到負責產生每一種亞基的基因的表達水平的影響。本文中公開的方法可被容易地用于改善任何重組多亞基復合物(包含兩個或更多個不同亞基)的產率和/或純度。此外，本方法不限于產生多蛋白質復合物，而且還可被容易地改造來適用于核糖核蛋白(RNP)復合物(包括端粒酶、hnRNP、核糖體、snRNP、信號識別顆粒、原核和真核RNA酶P復合物)，以及包含多個不同蛋白質和/或RNA亞基的任何其它復合物。表達多亞基復合物的宿主細胞可通過本領域已知的方法來產生。例如，一小組包含不同基因拷貝數的組合的二倍體或四倍體酵母細胞可通過將包含不同拷貝數的單個亞基基因(其拷貝數優選在交配前是已知的)的細胞交配來產生。
[0187]定義
[0188]應當理解本發明不限于描述的具體方法、方案、細胞系、動物的種或屬以及試劑，因為這可變化。還應理解本文中使用的術語僅僅是為了描述特定實施方案，無意限定僅由所附權利要求限定的本發明的范圍。
[0189]如本文中所用，除非上下文中另外清楚地指出，否則單數形式〃 一個/ 一種〃、〃和〃以及〃所述〃包括復數所指物。因此，例如，〃 一個/ 一種細胞〃包括多個這樣的細胞并且〃所述蛋白質"包括指一種或多種蛋白質以及本領域技術人員已知的其等同物，等等。除非明確地另有所指，否則本文中使用的所有技術和道學術語具有與本發明所屬的領域內的技術人員通常理解的含義相同的含義。
[0190]大劑量添加:在本公開中，“大劑量添加”通常是指與培養細胞(例如，在培養基中)接觸的物質(例如乙醇)的濃度的快速改變。例如，可以以單次添加、超過一次添加的連續添加和/或在一段時間內(例如，在約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60,90或120分鐘的時間內)進行的輸注的方式將物質添加至培養細胞。還可通過部分或完全更換培養基，例如通過濃縮細胞(使用離心、過濾、沉降或其它方法)，除去部分或全部培養基，隨后添加物質，或通過將細胞添加至含有物質的培養基中來添加物質。可將物質與載體(例如，培養基、水、鹽水等)混合。例如，乙醇的大劑量添加可包括將純的或高濃度乙醇(例如，100%、95%、70%、50%、60%、40%、30%、20%等)以足以產生期望的濃度的量添加至培養基中。作為另一個實例，可將細胞添加至含有乙醇的培養基，例如通過將含有細胞的接種物添加至含乙醇的培養基。`
[0191]大劑量濃度:在本公開中，“大劑量濃度”通常是指因物質(例如，乙醇)的大劑量添加而導致的濃度。
[0192]具有交配能力的酵母的種:在本發明中，這意欲廣泛地包括可在培養中生長的任何二倍體或四倍體酵母。這樣的種類的酵母可以以單倍體、二倍體或其它多倍體形式存在。給定倍性的細胞可在適當的條件下以該形式增殖無限的世代數。二倍體細胞還可生成孢子來形成單倍體細胞。連續交配可通過二倍體菌株的進一步交配或融合來導致四倍體菌株。本發明涉及單倍體酵母以及例如通過交配或融合(例如，原生質球融合)產生的二倍體或其它多倍體酵母細胞的用途。
[0193]在本發明的一個實施方案中，具有交配能力的酵母是酵母菌科(Saccharomycetaceae)的成員，其包括阿斯霉屬(Arxiozyma)、類盤酵母屬(Ascobotryozyma)、固囊酵母屬(Citeromyces)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、德克酵母屬(Dekkera)、假囊酵母屬(Eremothecium)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、釀酒酵母屬(Kazachstania)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、柯達菌屬(Kodamaea)、類德羅菌屬(Lodderomyces)、管囊酵母屬(Pachysolen)、畢赤酵母屬、酵母菌屬、子囊酵母屬(Saturnispora)、四盾酵母屬(Tetrapisispora)、有抱圓酵母屬(Torulaspora)、擬威爾酵母屬(Williopsis)和接合糖酵母菌(Zygosaccharomyces)。潛在地用于本發明的其它類型的酵母包括子囊菌酵母屬(Yarrowia)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、念珠菌屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、線黑粉(Filobasium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、布勒擲孢酵母屬(Bullera)、白冬孢酵母屬(Leucosporidium)和線黑粉菌屬(Filobasidella)。
[0194]在本發明的優選實施方案中，具有交配能力的酵母是畢赤酵母屬的成員或為另一種甲基營養生物。在本發明的其它優選實施方案中，畢赤酵母屬的具有交配能力的酵母是下列種之一:巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母和漢遜酵母(安格斯畢赤酵母)。在本發明的特別優選實施方案中，畢赤酵母屬的具有交配能力的酵母是巴斯德畢赤酵母種。
[0195]單倍體酵母細胞:具有單個拷貝的其正常基因組(染色體)組型的每一個基因的細胞。
[0196]多倍體酵母細胞:具有超過一個拷貝的其正常基因組(染色體)組型的細胞。
[0197]二倍體酵母細胞:具有兩個拷貝(等位基因)的其正常基因組組型的基本上每一個基因的細胞，通常通過兩個二倍體細胞的融合(交配)過程形成的。
[0198]四倍體酵母 細胞:具有4個拷貝(等位基因)的其正常基因組組型的基本上每一個基因的細胞，通常通過兩個二倍體細胞的融合(交配)過程形成的。四倍體可具有2、3、4或更多個不同的表達盒。這樣的四倍體可通過選擇性交配純合異宗配合二倍體a/a與α/α二倍體在釀酒酵母中獲得和通過單倍體的連續交配(以獲得營養缺陷型二倍體)在畢赤酵母屬中獲得。例如，可將[met his]單倍體與[ade his]單倍體交配以獲得二倍體[his];和可將[met arg]單倍體與[ade arg]單倍體交配以獲得二倍體[arg];隨后可將二倍體[his]與二倍體[arg]交配以獲得四倍體原養型。本領域技術人員應理解二倍體細胞的有益效果和用途也可適用于四倍體細胞。
[0199]酵母交配:兩個酵母細胞籍以融合以形成單個酵母細胞的過程。融合細胞可以是單倍體細胞或具有更高倍性的細胞(例如，將兩個二倍體細胞交配以產生四倍體細胞)。
[0200]減數分裂:二倍體酵母細胞藉以經歷減容分裂以形成4個單倍性孢子產物。每一孢子隨后可萌發并且形成單倍體營養生長細胞系。
[0201]可選擇標記:可選擇標記是賦予接受該基因(如例如通過轉化事件)的細胞生長表型(物理生長特征)的基因或基因片段。可選擇標記允許細胞在其中不接受該可選擇標記基因不能生長的條件下在選擇生長培養基中存活和生長。可選擇標記通常分成幾個類型，包括陽性可選擇標記基因例如賦予細胞對抗生素或其它藥物、溫度(當將兩個溫度敏感型(“ts”)突變體雜交或轉化ts突變體時)的抗性的基因；陰性可選擇標記基因例如生物合成基因，所述生物合成基因賦予細胞在不含被不具有該生物合成基因的細胞需要的特定營養物的培養基中生長的能力，或誘變的生物合成基因，所述誘變的生物合成基因使得細胞不能通過不具有野生型基因的細胞生長；等。適當的標記包括但不限于:ZE0、NE0(G418)、LYS3、METl、MET3a、ADEl、ADE3、URA3 等。
[0202]整合的:共價地連接至生物體的染色體中的遺傳元件(通常地異源遺傳元件)。
[0203]串聯整合的:兩個或更多個拷貝的被整合在染色體中相鄰位置中的遺傳元件。兩個或更多個拷貝不必定向；例如對于轉錄的基因，一些拷貝可從Watson鏈轉錄，其它拷貝可從Crick鏈轉錄。
[0204]宿主細胞:在本公開內容的上下文中，術語宿主細胞是指包含異源基因的細胞(例如，真核細胞，例如畢赤酵母屬細胞)。例如，異源基因可提供期望的多亞基復合物的亞基的表達，參與蛋白質折疊(例如，伴侶分子)、表達或分泌的基因和/或另一種期望的基因。可將異源基因整合到真核細胞的基因組中或包含在染色體外元件例如質粒或人工染色體內。
[0205]表達載體:這些DNA載體包含有利于外來基因在靶宿主細胞內表達的元件。方便地，首先在細菌宿主例如大腸桿菌(E.coli)中進行用于轉化的DNA的產生和序列的操作，并且通常載體可包括有利于這樣操作的序列，包括細菌復制起始點和適當的細菌選擇標記。選擇標記編碼在選擇性培養基中生長的轉化的宿主細胞存活或生長所必需的蛋白質。未用包含選擇基因的載體轉化的宿主細胞在培養基上不能存活。常見選擇基因編碼蛋白質，所述蛋白質(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，(b)補充營養缺陷性不足或(c)提供不可從復合培養基獲得的至關重要的營養物。用于酵母轉化的示例性載體和方法描述于例如Burke, D.，Dawson, D.，&Stearns, T.(2000).Methods in yeast genetics: a Cold SpringHarbor Laboratory course manual.Plainviewj N.Y.: Cold Spring Harbor LaboratoryPress (將所述文獻通過引用整體并入本文)中。
[0206]用于本發明的方法的表達載體還可包括酵母特異性序列，包括用于鑒定轉化的酵母菌株的可選擇營養缺陷或藥物標記。藥物標記還可用于選擇載體拷貝數在酵母宿主細胞中的擴增。
[0207]編碼目標序列的多肽通常有效地連接至轉錄和翻譯調控序列，所述調控序列提供多肽在酵母細胞中的表達。這些載體元件可包括但不限于下列元件的一個或多個:增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。還可包含用于多肽分泌的序列，例如信號序列等。酵母復制起始點是任選的，因為表達載體`通常被整合到酵母基因組中。
[0208]雖然是任選地，但在本發明的一個實施方案中，將多亞基復合物的一個或多個亞基有效地連接至或融合至分泌序列，所述分泌序列提供表達的多肽至培養基中的分泌，所述分泌序列可有利于異源多亞基復合物的收集和純化。甚至更優選地，分泌信號例如通過選擇優選密碼子和/或通過密碼子選擇改變AT百分比來提供來自宿主細胞(例如，酵母二倍體細胞)的多肽的最優化分泌。在本領域已知分泌效率和/或穩定性可通過選擇分泌序列來實現，并且最佳分泌序列在不同蛋白質之間可變化(參見，例如，Koganesawa等，Protein Eng.2001Sep; 14(9):705-10，將所述文獻通過引用整體并入本文)。許多潛在適當的分泌信號在本領域是已知的并且可容易地測試它們對特定異源多亞基復合物的產率和/或純度的作用。可潛在地使用任何分泌序列，包括存在于酵母和其它物種的分泌型蛋白質中的那些分泌序列以及工程化分泌信號。可使用的示例性分泌序列包括:雞溶菌酶(CLY)信號肽(MRSLLILVLCFLPLAALG(SEQ ID NO: 414))、CLY-L8 (MRLLLLLLLLPLAALG (SEQID N0:415))、釀酒酵母轉化酶(SUC2)信號肽(MLLQAFLFLLAGFAAKISA(SEQ ID N0:416))、MF-a (Prepro)(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR(SEQ ID NO:417))、MF-α (Pre) -apv(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APV(SEQ ID N0:418))、MF-a (Pre)-apv-SLEKR(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVSLEKR(SEQ ID NO:419)), MF- a (Prepro) - (EA)3(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSL EKR-EAEAEA(SEQ ID NO:420))、 aF信號肽(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-DETAQIPAEAVIGYSDLEG DFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKE-EGVSLEKR(SEQ ID NO:421))、KILMl 信號肽(MTKPTQVLVRSVSILFFITLLHLVVALNDVAGPAETAPVSLLPR(SE Q ID NO:422))、可抑制的酸性磷酸酶(PHOl)信號肽(MFSPILSLEIILALATLQSVFA (SEQID NO: 423))、黑曲霉 GOX 信號肽(MQTLLVSSLVVSLAAALPHYIR (SEQ ID NO: 424))、西方許旺酵母葡糖淀粉酶基因(GAMl)信號肽(MIFLKLIKSIVIGLGLVSAIQA(SEQ ID NO:425)),具有前導序列的人血清白蛋白(HSA)信號肽(MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR(SEQ IDNO:426))、具有前導序列的人血清白蛋白(HSA)信號肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS (SEQID N0:427))、ISN 信號肽(MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA(SEQ ID N0:428))、IFN 信號肽(MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCDLP(SEQ ID NO: 429) )、HGH 信號肽(MAADSQTPWLLTFSLLCLLWPQEPGA (SEQ ID N0:430))、植物血細胞凝集素(PHA) (MKKNRMMMMIWSVGVVWMLLLVGGSYG(SEQ ID NO:431))、蠶溶菌酶(MQKLIIFALVVLCVGSEA(SEQID NO:432))、人溶菌酶(LYZl)(MKALIVLGLVLLSVTVQG(SEQ ID NO:433))、活化素受體 I 型(MVDGVMILPVUMIALPSPS(SEQ ID NO:434))、活化素受體 II 型受體(MGAAAKLAFAVFLISCSSG(SEQ ID NO:435))、巴斯德畢赤酵母免疫球蛋白結合蛋白(PpBiP) (MLSLKPSWLTLAALMYAMLLVVVPFAKPVRA(SEQ ID NO:436))和人抗體 3D6 輕鏈前導序列(MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC(SEQ ID NO:437))。參見Hashimoto 等，Protein Engineering 第 11 卷 n0.2 第 75 - 77 頁，1998 ；0ka 等，Biosci Biotechnol Biochem.1999Nov ;63(11):1977-83 ;Gellissen 等，FEMS YeastResearch5(2005) 1079 - 1096 ；Ma 等，Hepatology.2005Dec;42(6):1355-63 ；Raemaekers等，Eur J Biochem.19990ctI; 265 (I): 394-403 ；Koganesawa 等，Protein Eng.(2001) 14(9):705-710 ;Daly 等,Protein Expr Purif.2006Apr;46(2):456-67 ；Damasceno等，Appl Microbiol Biotechnol (2007)74:381 - 389 和 Felgenhauer 等，Nucleic AcidsRes.1990Aug25; 18(16):4927，所述文獻的每一篇文獻通過引用整體并入本文)。還可將多亞基復合物分泌進入培養基而無需有效地連接至或融合至分泌信號。例如，已顯示當在巴斯德畢赤酵母中表達時(即使未有效地連接至或融合至分泌信號的情況下)時，一些異源多肽被分泌進入培養基。此外，可使用本領域已知的方法從宿主細胞(所述細胞，例如，可以是優選的，如果較少分泌復合物的話)純化多亞`基復合物。
[0209]可從培養基回收包含期望的多亞基復合物的培養基或細胞。任選地，可純化分泌的蛋白質。例如可使用機械、化學、酶促和/或滲透法(例如，利用液氮冷凍，使用勻漿器，原生質球化，超聲處理，在玻璃珠存在的情況下攪拌，使用去垢劑等)裂解包含期望的多亞基復合物的細胞。可使用本領域已知的方法濃縮、過濾、透析期望的多亞基復合物等。可基于例如其分子質量(例如，尺寸排阻色譜法)、等電點(例如，等電聚焦)、電泳遷移率(例如，凝膠電泳)、疏水相互作用層析(例如，HPLC)、電荷(例如，離子交換層析)、親和力(例如，在抗體的情況下，結合蛋白A、蛋白G，和/或期望的抗體所結合的表位)和/或糖基化狀態(例如，通過外源凝集素結合親和力檢測的)純化期望的多亞基復合物。可進行多個純化步驟來獲得期望水平的純度。在示例性實施方案中，期望的多亞基復合物可包含免疫球蛋白恒定結構域并且可使用蛋白A或蛋白G親和、尺寸排阻色譜法以及對外源凝集素的結合的不存在(以除去糖基化形式)來純化。任選地，可添加蛋白酶抑制劑例如苯甲磺酰氟(PMSF)來在純化過程中抑制蛋白水解消化。
[0210]當被置于與另一個核酸序列的功能性關系中時，核酸是“有效地連接的”。例如，如果信號序列的DNA表達為參與多肽的分泌的前蛋白，則其有效地連接于多肽的DNA;如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，則其有效地連接至編碼序列。一般而言，〃有效地連接的〃意指被連接的DNA序列是鄰接的，以及在分泌前導序列的情況下，是鄰接的并且在讀框內。然而，增強子不必是鄰接的。連接可通過在方便的限制性位點上連接或可選擇地通過對于本領域技術人員來說是熟悉的PCR/重組法(Gateway? Technology ；
Invitrogen, Carlsbad Calif.)來實現。如果這樣的位點不存在,貝U可按照常規實踐使用合成寡核苷酸接頭或連接體。期望的核酸(包括包含有效連接的序列的核酸)還可通過化學合成產生。
[0211]啟動子是位于結構基因(通常在約100至1000bp內)的起始密碼子上游(5’)的非翻譯序列，其控制與它們有效連接的特定核酸序列的轉錄和翻譯。這樣的啟動子分成幾個種類:誘導型、組成型和阻抑啟動子(所述啟動子響應阻抑物的不存在而升高轉錄的水平)。誘導型啟動子可響應培養條件下的一些變化(例如營養物的存在或不存在或溫度的變化)而起始升高水平的從在它們控制之下的DNA的轉錄。
[0212]酵母啟動子片段還可用作用于表達載體至酵母基因組的相同位點中的同源重組和整合的位點；可選擇地可選擇標記用作同源重組的位點。畢赤酵母屬的轉化描述于Cregg等(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376-3385(將所述文獻通過引用整體并入本文)中。
[0213]來自畢赤酵母屬的適當的啟動子的實例包括CUPl (通過培養基中銅的水平誘導的)、四環素誘導性啟動子、硫胺素誘導性啟動子、AOXl啟動子(Cregg等(1989)Mol.Cell.Biol.9:1316-1323)、ICLl 啟動子(Menendez 等(2003) Yeast20 (13): 1097-108)、3_ 磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(GAP) (Wa`terham 等(1997) Genel86 (I):37-44) ；and FLDl 啟動子(Shen等(1998)Gene216(l):93-102)。GAP啟動子是強組成型啟動子，CUPU AOX和FLDl啟動子是誘導型啟動子。每一個前述參考資料通過引用整體并入本文。
[0214]其它酵母啟動子包括ADH1、醇脫氫酶I1、GAL4、PH03、PH05、Pyk和來源于其的嵌合啟動子。此外，非酵母啟動子可用于本發明例如哺乳動物、昆蟲、植物、爬行動物、兩棲動物、病毒和禽類啟動子。最常見地，啟動子將包含哺乳動物啟動子(潛在地對于表達的基因是內源性的)或將包含在酵母系統中提供高效轉錄的酵母或病毒啟動子。
[0215]目標多肽不僅可直接重組產生，而且還可作為與異源多肽例如信號序列或在成熟蛋白質或多肽的N末端上具有特定切割位點的其它多肽的融合多肽產生。一般而言，信號序列可以是載體的組件，或其可以是被插入載體的多肽編碼序列的部分。優選地選擇的異源信號序列是被識別的并且通過可在宿主細胞內獲得的標準途徑之一加工的序列。釀酒酵母α因子前-原信號已證明在多種重組蛋白從巴斯德畢赤酵母的分泌中是有效的。其它酵母信號序列包括α交配因子信號序列、轉化酶信號序列和來源于其它分泌的酵母多肽的信號序列。此外，這些信號肽序列可被工程化以在二倍體酵母表達系統中提供增強的分泌。其它目標分泌信號還包括哺乳動物信號序列，所述信號序列對于待分泌的蛋白質可以是同源的，或對于待分泌的蛋白質可以是天然序列。信號序列包括前肽序列，在一些情況下可包括原肽序列。許多這樣的信號序列在本領域是已知的，包括在免疫球蛋白鏈上發現的信號序列，例如Κ28前毒素原序列、PHA-E、FACE、人MCP-1、人血清白蛋白信號序列、人Ig重鏈、人 Ig 輕鏈等。例如，參見 Hashimoto 等 Protein Engll (2) 75 (1998);和 Kobayashi 等Therapeutic Apheresis2 (4) 257 (1998),所述文獻的每一篇通過引用整體并入本文。
[0216]轉錄可通過將轉錄激活因子序列插入載體來增強。這些激活因子是DNA的順式作用元件，通常為約10至300bp，其作用于啟動子以增強其轉錄。轉錄增強子相對地不依賴于方向和位置，發現于轉錄單位的5’和3’，位于內含子中以及位于編碼序列本身內。可將增強子在編碼序列的5’或3’位置上剪接進入表達載體，但優選位于啟動子的5’位置。
[0217]用于真核宿主細胞的表達載體還可包含終止轉錄和穩定mRNA所必需的序列。這樣的序列通常可獲自翻譯終止密碼子的3’，其存在于真核或病毒DNA或cDNA的非翻譯區中。這些區域包含轉錄為mRNA的非翻譯部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸區段。
[0218]包含上文所列的組件的一個或多個的適當載體的構建使用標準連接技術或PCR/重組法。切割、裁剪分離的質粒或DNA片段，以期望產生所需質粒的形式或通過重組法再連接所述片段。為了進行確認構建的質粒中的正確序列的分析，將連接混合物用于轉化宿主細胞，適當時通過抗生素抗性(例如,氨節青霉素或Zeocin)選擇成功的轉化體。從轉化體制備質粒，通過限制性內切核酸酶消化分析質粒和/或對質粒進行測序。
[0219]作為對片段的限制和連接的替代，基于att位點和重組酶的重組法可用于將DNA序列插入載體。這樣的方法例如由Landy(1989)Ann.Rev.Biochem.58:913-949進行了描述；并且對于本領域技術人員來說是已知的。這樣的方法利用通過λ與大腸桿菌編碼的重組蛋白的混合物介導的分子間DNA重組。重組發生在相互作用的DNA分子上的特異性附著(att)位點之間。關于att位點的描述，參見Weisberg和Landy(1983)Site_SpecificRecombination in Pha ge Lambda, in Lambda II, ffeisberg, ed.(Cold Spring Harbor, N.Y.:Cold Spring Harbor Press),第211-250頁。轉換側翼連接重組位點的DNA區段，以便在重組后，att位點是由每一個親代載體供給的序列組成的雜交序列。重組可在具有任何拓撲結構的DNA之間發生。每一個前述參考資料通過引用整體并入本文。
[0220]可通過將目標序列連接至適當的載體中來將Att位點引入目標序列；通過使用特異性引物產生包含att B位點的PCR產物；產生克隆進入包含att位點的適當載體中的cDNA文庫；等等。
[0221]單順反子和多順反子基因。單順反子基因編碼包含僅翻譯成單一蛋白質的遺傳信息的RNA。多順反子基因編碼包含翻譯超過一種蛋白質的遺傳信息的mRNA。多順反子基因中編碼的蛋白質可具有相同的或不同的序列或其組合。二順反子或雙順反子是指編碼兩種蛋白質的多順反子。多順反子基因任選地包括一個或多個內核糖體進入位點(IRES)元件來有促進不依賴于帽的翻譯起始，所述元件可位于可這樣的位置中，所述位置可不依賴于鍵合至mRNA分子的5’末端的5’-帽結構來驅動下游蛋白質編碼區的翻譯。可使用任何已知的IRES序列(例如，病毒、真核生物或人工來源的)。例如，可使用基因間區域(IGR)中的蟋蟀麻痹病毒IRES序列，如Thompson等(2001)PNAS98:12972-12977中所描述的。任選地，IRES功能可通過遺傳改變，例如通過引起eIF2激酶GCN2的組合成型表達或中斷兩個斷裂的起始密碼子tRNA(met)基因(同前)來賦予。
[0222]折疊，如本文中所用，是指多肽和蛋白質的三維結構，其中氨基酸殘基之間的相互作用用于穩定結構。雖然非共價相互作用在決定結構中是非常重要的，但目標蛋白質通常具有通過兩個半胱氨酸殘基形成的分子內和/或分子間共價二硫鍵。對于天然存在的蛋白質和多肽或其衍生物和變體，正確折疊通常是導致最佳生物活性的排列，并且可方便地通過活性(例如配體結合、酶促活性等)的測定來監測。
[0223]在一些情況下，例如當期望的產物是合成來源時，基于生物活性的測定意義不大。這樣的分子的正確折疊可基于物理性質、活力考慮、建模研究等來確定。
[0224]表達宿主還可通過引入編碼一種或多種增強折疊和二硫鍵形成的酶即折疊酶、伴侶蛋白等的序列來進行修飾。這樣的序列可使用本領域已知的載體、標記等來在酵母宿主細胞中組成型地或誘導型地表達。優選，通過靶向方法將序列(包括足以進行期望的表達模式的轉錄調控元件)穩定地整合在酵母基因組中。
[0225]例如，真核PDI不僅是蛋白質半胱氨酸氧化和二硫鍵異構化的高效催化劑而且還顯示伴侶蛋白活性。PDI的共表達可有利于具有多個二硫鍵的活性蛋白質產生。還有利的是BIP(免疫球蛋白重鏈結合蛋白)、親環素等的表達。在本發明的一個實施方案中，可從通過交配產生的酵母表達多亞基復合物,其中每一個單倍體親代菌株表達不同的折疊酶,例如一個菌株可表達BIP，另一個菌株可表達PDI或其組合。
[0226]術語〃期望的蛋白質〃或〃靶蛋白質〃可互換使用并且通常是指異源多亞基蛋白質例如本文中描述的抗體(例如，人源化抗體)或其結合部分。
[0227]術語"抗體"包括具有與表位擬合或識別表位的特定形狀的任何含多肽鏈的分子結構，其中一個或多個非共價結合相互作用穩定分子結構與表位之間的復合。原型抗體分子是免疫球蛋白，來自所有來源例如人、哨齒類動物、兔、牛、綿羊、豬、狗、其它哺乳動物、雞、其它禽類等的所有類型的免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等被認為是“抗體”。用于產生用作根據本 明的起始材料的抗體的優選來源是兔。許多抗體編碼序列已被描述；其它抗體可利用本領域公知的方法產生。其實例包括嵌合抗體、人抗體和其它非人哺乳動物抗體、人源化抗體、單鏈抗體例如scFv、駱能體、納米抗體、IgNAR(來源于S魚的單鏈抗體)、小模塊免疫藥物(SMIP)和抗體片段例如Fab、Fab’、F(ab’)2等。參見Streltsov VA,等，Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of anearly-developmental isotype, Protein Sc1.2005November ；14(11):2901-9.Epub2005年9 月 30 日；Greenberg A S,等,A new antigen receptor gene family that undergoesrearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature.1995年 3 月 9 日.9 ;374(6518): 168-73 ;Nuttall S D，等，Isolation of the new antigenreceptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of proteinloop libraries, Mol Immunol.2001 年 8 月；38 (4): 313-26 ;Hamers_Casterman C，等，Naturally occurring antibodies devoid of light chains，Nature.1993 年 6 月 3 日；363(6428):446-8 ；Gill D S，等，Biopharmaceutical drug discovery using novelprotein scaffolds, Curr Opin Biotechnol.2006 年 12 月；17 (6):653-8.Epub2006 年 10月19日。將每一個上述參數資料通過引用整體并入本文。
[0228]例如，抗體或抗原結合片段可通過遺傳工程產生。在該技術中，與其它方法一樣，抗體產生性細胞對期望的抗原或免疫原敏感。從抗體產生性細胞分離的信使RNA用作使用PCR擴增產生cDNA的模板。通過將擴增的免疫球蛋白cDNA的適當區段插入表達載體來產生載體的文庫，每一個載體包含保留初始抗原特異性的一個重鏈基因和一個輕鏈基因。通過將重鏈基因文庫與輕鏈基因文庫組合來構建重組文庫。這導致共表達重鏈和輕鏈(類似于抗體分子的Fab片段或抗原結合片段)的克隆的文庫。將攜帶這些基因的載體共轉染入宿主細胞。當將抗體基因合成引入轉染的宿主時，重鏈和輕鏈蛋白質自組裝以產生可通過利用抗原或免疫原的篩查來檢測的活性抗體。
[0229]目標抗體編碼序列包括由天然序列編碼的那些序列，以及因遺傳密碼的簡并性而在序列上與公開的核酸不相同的核酸及其變體。變體多肽可包括氨基酸(aa)置換、添加或缺失。氨基酸置換可以是保守氨基酸置換，或消除非必需氨基酸，例如以改變糖基化位點或使錯折疊減少至最低程度(通過一個或多個對于功能不是必需的半胱氨酸殘基的置換或缺失)的置換。可這樣設計變體以使其保留蛋白質的特定區域(例如，功能結構域、催化氨基酸殘基等)的生物活性或具有增強的所述生物活性。變體還包括本文中公開的多肽的片段，特別地生物活性片段和/或對應于功能結構域的片段。用于克隆的基因的體外誘變的技術是已知的。還包括在主題發明中的是已使用常規分子生物學技術修飾以改善它們對蛋白水解消化的抗性或最優化溶解度性質或使它們更適合作為治療劑的多肽。
[0230]嵌合抗體可通過重組方法，通過將獲自一個物種的抗體產生性細胞的可變輕鏈和重鏈區('和Vh)與來自另個物種的抗體產生性細胞的恒定輕鏈和重鏈區組合來進行制備。通常地，嵌合抗體利用嚙齒類動物或兔可變區和人恒定區，以產生具有大部分人結構域的抗體。這樣的嵌合抗體的產生在本領域是公知的，并且可通過標準方法(如例如美國專利N0.5，624，659 (通過引用并入本文)中所描述的)來實現。還預期本發明的嵌合抗體的人恒定區可選自 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgGlO、IgGll、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18 或 IgG19 恒定區。
[0231]人源化抗體經工程化以包含甚至更多人樣免疫球蛋白結構域，并且僅包含動物來源的抗體的互補性決定區。這通過仔細檢查單克隆抗體的可變區的高變環的序列，將它們與人抗體鏈的結構擬合來實現。雖然表面上復雜，但過程在實踐上簡單明了。參見，例如美國專利N0.6，187，287 (通過引用整體并入本文)。人源化抗體的方法先前已在公布的美國專利N0.7935340(將其公開內容通過引用整體并入本文)中進行了描述。在一些情況下，是否需要額外的兔框架殘基來維持活性的確定是必需的。在一些情況下，人源化抗體仍然需要保留一些至關重要的兔框架殘基來使親`和力或活性的損失減小至最低程度。在這些情況下，必需將來自人種系序列的單個或多個框架氨基酸變回原始兔氨基酸以具有期望的活性。實驗性測定這些變化以鑒定哪個兔殘基是保持親和力和活性所必需的。
[0232]除了完整的免疫球蛋白(或它們的重組對應部分)外，可合成包含表位結合位點(例如，Fab’、F(ab’)2或其它片段)的免疫球蛋白片段。"片段"或最小免疫球蛋白可使用重組免疫球蛋白技術來設計。例如用于本發明的"Fv"免疫球蛋白可通過合成融合的可變輕鏈區和可變重鏈區來產生。抗體的組合也是有益的，例如雙鏈抗體，其包含兩個不同的Fv特異性。在本發明的另一個實施方案中，免疫球蛋白片段包括SMIP (小分子免疫藥物)、駱鴕體、納米抗體和IgNAR。
[0233]免疫球蛋白及其片段可被翻譯后修飾來例如添加效應物部分例如化學連接體、可檢測部分例如熒光染料、酶、毒素、底物、生物發光物質、放射性物質、化學發光部分等，或特異性結合部分例如鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白或生物素等可用于本發明的本發明的方法和組合物。其它效應分子的實例提供于下文中。
[0234]產物相關變體:存在于期望的產物的制劑中并且與期望的產物相關的除期望的產物(例如，期望的多亞基復合物)外的產物。示例性產物相關變體包括截短的或延長的肽，具有與期望的糖基化不同的糖基化的產物(例如，如果糖基化產物是期望的，則任何糖基化產物可被認為是產物相關變體)，具有異常化學計量的復合物，不正確裝配，異常二硫鍵，異常或不完全折疊，聚集，蛋白酶切割或其它異常。示例性產物相關變體可顯示分子質量(例如，通過尺寸排阻色譜法檢測的)、等電點(例如，通過等電聚焦檢測的)、電泳遷移率(例如，通過電泳檢測的)、磷酸化狀態(例如，通過質譜檢測的)、荷質比(例如，通過質譜檢測的)、蛋白水解片段的質量或身份(例如，通過質譜或凝膠電泳檢測的)、疏水性(例如，通過HPLC檢測的)、電荷(例如，通過離子交換層析檢測的)、親和力(例如，在抗體的情況下，通過對蛋白A、蛋白G和/或期望的抗體所結合的表位的結合檢測的)以及糖基化狀態(例如，通過外源凝集素結合親和力檢測的)的一項或多項的改變。當期望的蛋白質是抗體時，術語產物相關變體可包括糖-重鏈和/或半抗體種類(下文中描述的)。[0235]示例性產物相關變體包括包含異常二硫鍵的變體形式。例如，大多數IgGl抗體分子通過總共16個鏈內和鏈間二硫鍵來穩定，所述二硫鍵在重鏈和輕鏈中穩定IgG結構域的折疊，而鏈間二硫鍵穩定重鏈與輕鏈之間的締合。其它抗體類型同樣地包含特定性穩定鏈內和鏈間二硫鍵。此外，一些抗體(包括本文中公開的Ab-A和Ab-B)包含稱為非經典二硫鍵的額外二硫鍵。因此，異常鏈間二硫鍵可因穩定共價連接的不存在和/或對額外亞基的二硫連接而導致異常的復雜的化學計量。此外，異常二硫鍵(無論鏈間還是鏈內)可降低抗體的結構穩定性，這可導致減小的活性、減小的穩定性、增加的形成聚集體的傾向和/或增加的免疫原性。包含異常二硫鍵的產物相關變體可以以多種方式檢測，包括非還原變性SDS-PAGE、毛細管電泳、cIEX、質譜法(任選針利用化學修飾來產生游離半胱氨酸的質量漂移)、尺寸排阻色譜法、HPLC、光散射的改變以及本領域已知的任何其它適當的方法。參見，例如，The Protein Protocols Handbook2002,第 V 部分，581-583，DO1: 10.1385/1-59259-169-8:581 ；
[0236]半抗體、半抗體種類或HlLl是指蛋白質復合物，所述蛋白質復合物包括單個抗體重鏈和單個抗體輕鏈，但在第二抗體重鏈與第二抗體輕鏈之間不存在共價鍵。兩個半抗體可在一些條件下保持非共價締合(其可產生與完全抗體相似的行為，例如通過尺寸排阻色譜法測定的表觀分子量)。類似地，H2L1是指包括兩個抗體重鏈和單個抗體輕鏈，但不存在對第二抗體輕鏈的共價連接的蛋白質復合物；這些復合物還可以與另一個抗體輕鏈非共價締合(并且同樣地產生與完全抗體相似的行為)。與完全抗體一樣,半抗體種類和H2L1種類可在還原條件下解離成單個重鏈和輕鏈。半抗體種類和H2L1種類可在非還原SDS-PAGE凝膠上被檢測為以比完全抗體更低的表觀分子量遷移的種類，例如HlLl以約一半的完全抗體的表觀分子量(例如，約75kDa)遷移。
[0237]糖-重鏈變體是指有時存在于抗體制劑中并且包含至少部分Fe序列的糖基化產物相關變體。糖-重鏈變體的特征在于可通過SDS-PAGE觀察的減小的電泳遷移率(相對于正常重鏈)、外源凝集素結合親和力、對抗-Fe抗體的結合以及及如通過尺寸排阻色譜法測定的包含糖-重鏈變體的抗體復合物的顯著更高的分子量。參見2011年8月31日提交的美國臨時申請序列號61/525，307 (代理人案卷號67858.730200)(將其通過引用整體并入本文)。
[0238]術語"長時間穩定地表達期望的分泌的異源多肽的多倍體酵母"是指在閾值表達水平上(通常至少50-500mg/L(在培養約90小時后)和優選顯著更大)分泌所述多肽至少數天至I周，更優選至少I個月，更優選至少1-6個月，更優選超過I年的酵母培養物。
[0239]術語"分泌期望量的重組多肽的多倍體酵母培養物"是指穩定地或長期分泌至少50-500mg/L、最優選500_1000mg/L或更多的培養物。
[0240]如果多核苷酸序列按照遺傳密碼的翻譯產生多肽序列(即，多核苷酸序列“編碼”多肽序列，則多核苷酸序列“對應”于多肽序列，如果兩個序列編碼相同多肽序列，則一個多核苷酸序列〃對應〃于另一個多核苷酸序列。
[0241]DNA構建體的〃異源〃區或結構域是未被天然地發現與更大的分子結合的更大DNA分子內的DNA的可辨認區段。因此，當異源區域編碼哺乳動物基因時，基因通常側翼連接有在來源生物的基因組中不側翼連接哺乳動物基因組DNA的DNA。異源區的另一個實例是其中未天然地發現編碼序列本身的構建體(例如，其中基因組編碼序列包含內含子的cDNA，或具有與天然基因不同的密碼子的合成序列)。等位基因變型或天然存在的突變事件不產生本文中定義的DNA的異源區域。
[0242]"編碼序列"是(根據遺傳密碼)對應于或編碼蛋白質或肽序列的密碼子的框內序列。兩個編碼序列彼此對應，如果序列或它們的互補序列編碼相同氨基酸序列的話。與適當的調控序列連接的編碼序列可被轉錄并且翻譯成多肽。多腺苷酸化信號和轉錄終止序列通常位于編碼序列的3’。"啟動子序列"是能夠結合細胞中的RNA聚合酶并且起始下游(3’方向)編碼序列的轉錄的DNA調控區。啟動子序列任選地包含用于進行編碼序列的轉錄的調控分子(例如，轉錄因子)的結合的額外位點。當RNA聚合酶結合細胞中的啟動子并且將編碼序列轉錄成mRNA時，編碼序列處于啟動子序列的"控制之下"或"有效地連接至啟動子，所述mRNA隨后被翻譯成由編碼序列編碼的蛋白質。
[0243]載體被用于將外`來序列例如DNA、RNA或蛋白質引入生物或宿主細胞。常見載體包括重組病毒(用于多核苷酸)和脂質體(用于多肽)。"DNA載體〃是可將另一個多核苷酸區段連接至其以進行連接區段的復制的復制子，例如質粒、噬菌體或粘粒。〃表達載體〃是包含可指導適當的宿主細胞進行多肽合成的調控序列的DNA載體。這通常意指結合RNA聚合酶并且起始mRNA的轉錄的啟動子，以及引導mRNA至多肽的翻譯的核糖體結合位點和起始信號。將多核苷酸序列在適當的位點和按正確的讀框整合到表達載體，隨后利用載體轉化適當的宿主細胞使得能夠產生由所述多核苷酸序列編碼的多肽。
[0244]多核苷酸序列的"擴增"是多個拷貝的特定核酸序列的體外產生。擴增序列通常以DNA的形式存在。多種用于進行這樣的擴增的技術描述于下列綜述論述(將所述綜述論述的每一篇通過引用整體并入本文):Van Bruntl990, Bio/Technol.，8 (4): 291-294 ;以及Gill 和 Ghaemi, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.2008Mar; 27 (3): 224-43 中。聚合酶鏈式反應或PCR是核酸擴增的原型，并且此處PCR的使用應當被認為是其它適當擴增技術的范例。
[0245]大多數脊椎動物(包括哺乳動物)的抗體的一般結構現已得到良好的理解(Edelman, G.M., Ann.N.Y.Acad.Sc1.，190:5 (1971))。常規抗體由兩個分子量約 23，000 道爾頓(〃輕鏈〃)的相同多肽輕鏈和兩個分子量約53，000-70，000(〃重鏈〃)的相同重鏈組成。4個鏈通過"Y"構型中的二硫鍵連接在一起，在所述"Y"構型中輕鏈括入始于"Y"構型的口部的重鏈。〃Y〃構型的〃分支〃部分稱為Fab區；〃Υ〃構型的莖部分稱為F。區。氨基酸序列取向從"Y"構型的頂部的N末端延伸至每一個鏈的底部的C末端。N末端具有擁有對于引發其的抗原的特異性的可變區，并且在長度上為約100個氨基酸，在輕鏈與重鏈之間以及抗體間存在微小變異。
[0246]可變區在每一條鏈中連接至延續鏈的剩余長度的恒定區，并且特定種類的抗體內的恒定區不隨抗體的特異性(即，引發其的抗原)而變化。存在5個已知大類的決定免疫球蛋白分子的種類的恒定區(對應于Y、μ、α、δ、ε重鏈恒定區的IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)。恒定區和中類決定抗體的隨后效應子功能，包括補體的活化(Kabat, E.A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry,第 2版，第 413-436 頁,Holt, Rinehart, Winston (1976))以及其它細胞反應(Andrews, D.ff.,等，Clinical Immunobiology,第 1-18 頁,W.B.Sanders (1980) ；Kohl, S.,等，Immunology, 48:187(1983));然而可變區決定其與哪個抗原反應。輕鏈被分類為κ和入。可將每一個重鏈種類與K或λ輕鏈配對。輕鏈與重鏈彼此共價鍵合，并且當免疫球蛋白通過雜交瘤或通過B細胞產生時，兩個重鏈的“尾”部分通過共價二硫鍵彼此鍵合。
[0247]措辭”可變區〃或"VR"是指抗體中每一對輕鏈和重鏈內直接參與抗體對抗原的結合的結構域。每一個重鏈在一個末端具有可變結構域(Vh)，隨后許多恒定結構域。每一個輕鏈在一個末端具有可變結構域并且在其另一末端具有恒定結構域；輕鏈的恒定結構域與重鏈的第一恒定結構域對齊，并且輕鏈可變結構域與重鏈的可變結構域對齊。
[0248]措辭”互補性決定區〃、〃高變區〃或〃⑶R"是指抗體的輕鏈或重鏈的可變區內發現的高變區或互補性決定區(⑶幻的一個或多個(See Kabat, E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes ofHealth, Bethesda, Md., (1987))。這些表達包括如由Kabat等定義的高變區("Sequencesof Proteins of Immunological Interest, ^Kabat E.,等，US Dept, of Health and HumanServices, 1983)或抗體的三維結構中的高變環(hypervariable loop) (Chothia和 Lesk, JMol.Biol.196901-917 (1987))。每一條鏈中的CDR通過框架區保持緊密靠近，并且與來自另一條鏈的CDR —起促成了抗原結合位點的形成。在CDR內，存在已被描述為選擇性決定區(SDR)的選擇氨基酸，所述氨基酸代表了在抗體-抗原相互作用中由CDR使用的至關重要的接觸殘基(Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005))。
[0249]措辭”框架區〃或"FR"是指抗體的輕鏈和重鏈的可變區內的框架區的一個或多個(參見Kabat, E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md.，(1987))。這些表達包括插入在抗體的輕鏈和重鏈的可變區內的CDR之間的那些氨基酸序列區。
[0250]抗-NGF抗體及其具有對于NGF的結合活性的片段
[0251]杭體Abl
[0252]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合和/或抑制或預防疼痛的治療有效量，使用單獨的或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合的抗體Abl或其片段，或結合與Abl所結合的表位相同的或與之重疊的表位的抗體或抗體片段(例如下文中所示的)治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法。在一個實施方案中，本發明包括具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列的嵌合抗體:ALVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQNIYSNLAWYQQRPGQRPKLLIYGASNLDAGVPSRFRGSGSGTEYTLTISDLECDDVGTYYCQSAFDSDSTENTFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:1)。
[0253]本發明任選地涉及利用單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列的嵌合抗體:ALVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQNIYSNLAWYQQRPGQRPKLLIYGASNLDAGVPSRFRGSGSGTEYTLTISDLECDDVGTYYCQSAFDSDSTENTFGGGTEWVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:2)。
[0254]本發明任選地涉及單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列的嵌合抗體:
[0255]QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVITSIGSTVYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYDDYDEMTYFNIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:3)。
[0256]本發明任選地涉及單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列的嵌合抗體:
[0257]QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVITSIGSTVYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYDDYD EMTYFNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:4)。
[0258]本發明任選地涉及單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包含對應于SEQ ID NO:1的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 2的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID N0:3的可變重鏈序列或SEQ ID N0:4的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0259]本發明任選地涉及單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體是具有對于NGF的結合特異性的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQID N0:3或SEQ ID NO:4的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0260]在本發明的其它實施方案中，用于治療或預防疼痛的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO:1的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 2的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。[0261]本發明任選地涉及單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性的片段，其包含對應于SEQ ID NO:3的可變重鏈序列或SEQ ID N0:4的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:8, SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0262]本發明還任選地涉及包括本文中描述的抗體片段的一個或多個的抗體片段。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的一個、二個、三個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO:1的可變輕鏈區、SEQID NO: 3的可變重鏈區、SEQ ID NO:1的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 5,SEQ IDN0:6和SEQ ID NO:7)以及SEQ ID NO:3的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID N0:8、SEQID NO:9 和 SEQ ID NO:10)。
[0263]在本發明的特別優選實施方案中，嵌合抗-NGF抗體是Abl，其包含SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:4或可選擇地由SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:4組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0264]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，本文中使用的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段或結合與Abl所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Abl而言，Fab片段包括SEQ ID NO:1的可變輕鏈序列和SEQ ID N0:3的可變重鏈序列。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:3的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0265]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，Fab片段可通過Abl的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如Abl或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NS0或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯`德畢赤酵母。
[0266]杭體 Ab2
[0267]本發明任選地涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性的嵌合或人源化抗體，其中抗體是抗體Ab2或其片段，或結合與Ab2所結合的表位相同的或與之重疊的表位的抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個實施方案中，本發明包括具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列的嵌合或人源化抗體:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLDAGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQSAFDSDSTENTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:11)。
[0268]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列的嵌合或人源化抗體:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLDAGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQSAFDSDSTENTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:12)。[0269]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列的嵌合或人源化抗體:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGVITSIGSTVYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYDDYDEMTYFNIffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)。
[0270]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列的嵌合或人源化抗體:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGVITSIGSTVYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYDDYDEMTYFNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:14)。
[0271]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關障礙的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO: 11的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 12的輕鏈序列的互補性決定區(⑶R，或高變區)的SEQ ID NO: 15,SEQ ID N0:16和SEQ ID NO: 17的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 13的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 14的輕鏈序列的互補性決定區(⑶R，或高變區)的SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體或其片段包含⑶R、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0272]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關障礙的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體包含SEQ ID N0:11或SEQ ID NO: 12的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0273]在本發明的其它實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段任選地包含對應于SEQ ID NO: 11的可變輕鏈序列或SEQID NO: 12的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0274]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片 段任選地包含對應于SEQ ID NO: 13的可變重鏈序列或SEQID NO: 14的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20的多肽序列一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0275]本發明還任選地涉及包括本文中描述的抗體片段的一個或多個的抗體片段。在本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO: 11的可變輕鏈區、SEQ ID NO: 13的可變重鏈區、SEQ ID NO: 11的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO: 17)和 SEQ ID NO: 13的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20) ?[0276]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗-NGF抗體是Ab2，其包含SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14或可選擇地由SEQ IDN0:12和SEQ ID NO: 14組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0277]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段或結合與Ab2所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Ab2而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 11的可變輕鏈序列和SEQ ID NO: 13的可變重鏈序列。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 11和/或SEQ IDNO: 13的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0278]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，Fab片段可通過Ab2的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如Ab2或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NS0或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0279]杭體 Ab3
[0280]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合而未明顯抑制NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性的嵌合或人源化抗體，其中抗體是Ab3或其片段，或結合與Ab3所結合的表位相同的或與之重疊的表位的抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個實施方案中，本發明包括具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列的嵌合抗體:AVLTQTPSPVSAAMGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPRLLIYDASN LPSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDADNAFGGGTEVVVKR(SEQ ID N0:21)。
[0281]本發明還包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:AVLTQTPSPVSAAMGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPRLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDADNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:22)。
[0282]本發明還包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAGGGGSIYDIffGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:23)。
[0283]本發明還包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAGGGGSIYDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:24)。
[0284]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關障礙的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO: 21的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 22的輕鏈序列的互補性決定區(⑶R，或高變區)的SEQ ID NO:25,SEQ ID N0:26和SEQ ID NO:27的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 23的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 24的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 28,SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體或其片段包含⑶R、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0285]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關障礙的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體包含SEQ ID N0:21或SEQ ID N0:22的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:23或SEQ ID NO:24的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0286]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO:21的可變輕鏈序列或SEQ IDNO:22的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:25,SEQ ID N0:26和SEQID NO:27的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0287]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO:23的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 24的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 28,SEQ ID NO: 29和SEQID NO:30的多肽序列的一個或多個`，或可選擇地由其組成。
[0288]本發明還任選地涉及包括本文中描述的用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段的一個或多個的抗體片段。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO:21的可變輕鏈區、SEQ ID NO:23的可變重鏈區、SEQ ID NO:21的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:25,SEQ ID N0:26 和 SEQ ID NO:27)和 SEQ ID NO:23的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:28, SEQ ID N0:29和SEQ ID NO:30) ?
[0289]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗-NGF抗體是Ab3，其包含SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 24或可選擇地由SEQ ID NO: 22和SEQ ID N0:24組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0290]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段或結合與Ab3所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Ab3而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 21的可變輕鏈序列和SEQ ID NO: 23的可變重鏈序列。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 21和/或SEQ IDNO:23的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0291]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，Fab片段可通過Ab3的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如Ab3或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CHO、NSO或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0292]杭體Ab4
[0293]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合而未明顯抑制NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性的嵌合或人源化抗體，其中抗體是抗體Ab4或其片段，或結合與Ab4所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:
[0294]DIQMTQSPSTLSASV⑶RVTITCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGKAPKLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGDYDDDADNAFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:31)。
[0295]本發明還包括用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGKAPKLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCL⑶YDDDADNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:32)。
[0296]本發明還包括用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGGGSIYDIffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:33)。
[0297]本發明還包括用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGGGSIYDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:34)。
[0298]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO:31的可變輕鏈序列或SEQ ID NO:32的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:35,SEQ ID N0:36和SEQ ID NO:37的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO:33的可變重鏈序列或SEQ ID NO:34的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:38, SEQ ID N0:39和SEQ ID N0:40的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0299]本發明還任選地涉及用于 治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體包含SEQ IDN0:31或SEQ ID NO:32的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:33或SEQ ID NO:34的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0300]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO:31的可變輕鏈序列或SEQ IDNO:32的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:35,SEQ ID N0:36和SEQID NO:37的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0301]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 33的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 34的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 38,SEQ ID NO: 39和SEQID NO:40的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。[0302]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID N0:31的可變輕鏈區、SEQ ID NO:33的可變重鏈區、SEQ ID N0:31的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:35,SEQ ID N0:36 和 SEQ ID NO:37)和 SEQ ID NO:33的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:38, SEQ ID N0:39和SEQ ID NO:40) ?
[0303]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合和人源化抗-NGF抗體是Ab4，其包含SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO: 34或可選擇地由SEQ IDN0:32和SEQ ID NO:34組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0304]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段或結合與Ab 14所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Ab4而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 31的可變輕鏈序列和SEQ IDNO: 33的可變重鏈序列。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 31和/或SEQ ID NO:33的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0305]在本文(下文)中描述的本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Ab4的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如Ab4或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NS0或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0306]杭體Ab5
[0307]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體任選地包括抗體Ab5或其片段，或結合與Ab5所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個實施方案中，本發明包括具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列的嵌合抗體:AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSIYSNLAWYQQRPGQPPKLLIYDASTLESGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGVECADAASYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:41)。
[0308]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSIYSNLAffYQQRPGQPPKLLIYDASTLESGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGVECADAASYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:42)。
[0309]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYAVGffVRQAPGKGLEWIGIIGRNGNTWYASffARGRFTISKTSTTVDLKITSPTSEDTATYFCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:43)。
[0310]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYAVGffVRQAPGKGLEWIGIIGRNGNTWYASffARGRFTISKTSTTVDLKITSPTSEDTATYFCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQID NO:44)。
[0311]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO:41的可變輕鏈序列或SEQ ID NO:42的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:45,SEQ ID N0:46和SEQ ID N0:47的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO:43的可變重鏈序列或SEQ ID N0:44的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:48, SEQ ID N0:49和SEQ ID N0:50的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體或其片段任選地包含CDR、可變重鏈和可變`輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0312]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體包含SEQ ID N0:41或SEQ ID N0:42的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:43或SEQ ID N0:44的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0313]在本發明的其它實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO:41的可變輕鏈序列或SEQ ID NO:42的輕鏈序列的互補性決定區(⑶R，或高變區)的SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 47的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0314]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID N0:43的可變重鏈序列或SEQ IDN0:44的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:48,SEQ ID N0:49和SEQID NO:50的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0315]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO:41的可變輕鏈區、SEQ ID NO:43的可變重鏈區、SEQ ID NO:41的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:45,SEQ ID N0:46 和 SEQ ID NO:47)和 SEQ ID NO:43的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:48, SEQ ID N0:49和SEQ ID NO:50) ?
[0316]在本發明的特別優選實施方案中，任選地包括的用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗-NGF抗體是Ab5，其包含SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44或可選擇地由SEQID N0:42和SEQ ID N0:44組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0317]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段或結合與Ab5所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或抗體片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Ab5而言，Fab片段包括SEQ ID NO:41的可變輕鏈序列和SEQ ID N0:43的可變重鏈序列。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 41和/或SEQ ID NO: 43的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0318]在本文(下文)中描述的本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Ab5的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如Ab5或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NS0或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。`
[0319]杭體 Ab6
[0320]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體任選地包括Ab6或其片段，或結合與Ab6所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個實施方案中，本發明包括具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列的嵌合或人源化抗體:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:51)。
[0321]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:52)。
[0322]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:53)。[0323]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:54)。
[0324]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO:51的可變輕鏈序列或SEQ ID NO:52的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO:53的可變重鏈序列或SEQ ID NO:54的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID N0:60的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體或其片段任選地包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0325]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:51或SEQ ID NO: 52的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:53或SEQ ID NO:54的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0326]在本發明的其它實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID N0:51的可變輕 鏈序列或SEQ ID NO:52的輕鏈序列的互補性決定區(⑶R，或高變區)的SEQ ID NO: 55,SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0327]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO:53的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 54的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 58,SEQ ID NO: 59和SEQID NO:60的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0328]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO:51的可變輕鏈區、SEQ ID NO:53的可變重鏈區、SEQ ID NO:51的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:55,SEQ ID N0:56 和 SEQ ID NO:57)和 SEQ ID NO:53的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID NO:60) ?
[0329]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗-NGF抗體是Ab6，其包含SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 54或可選擇地由SEQ IDN0:52和SEQ ID NO:54組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0330]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段或結合與Ab6所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Ab6而言，Fab片段包括SEQ ID NO:51的可變輕鏈序列和SEQ ID NO:53的可變重鏈序列。本發明的該任選實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 51和/或SEQID NO: 53的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0331]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Ab6的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如Ab6或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NSO或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0332]杭體Ab7
[0333]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括Ab7或其片段，或結合與Ab7所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:ADVVMTQTPASVSQPVGGTVTIKCQASEDIYNLLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGLECADAATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTEVVVKR(SEQ ID N0:61)。
[0334]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:ADVVMTQTPASVSQPVGGTVTIKCQASEDIYNLLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGLECADAATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:62)。
`[0335]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:QEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYASWVKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSYAAYGGYPATFDPWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:63)。
[0336]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYASWVKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSYAAYGGYPATFDPWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:64)。
[0337]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO:61的可變輕鏈序列或SEQ ID N0:62的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66和SEQ ID NO: 67的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO:63的可變重鏈序列或SEQ ID N0:64的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:68, SEQ ID N0:69和SEQ ID N0:70的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體或其片段任選地包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0338]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:61或SEQ ID N0:62的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:63或SEQ ID N0:64的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0339]在本發明的其它實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO:61的可變輕鏈序列或SEQ ID NO:62的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:65, SEQ ID N0:66和SEQ IDNO:67的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0340]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID N0:63的可變重鏈序列或SEQ IDN0:64的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:68,SEQ ID N0:69和SEQID NO:70的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0341]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO:61的可變`輕鏈區、SEQ ID NO:63的可變重鏈區、SEQ ID NO:61的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:65,SEQ ID N0:66 和 SEQ ID NO:67)和 SEQ ID NO:63的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:68, SEQ ID N0:69和SEQ ID NO:70) ?
[0342]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗-NGF抗體是Ab7，其包含SEQ ID NO: 62和SEQ ID NO: 64或可選擇地由SEQ ID NO: 62和SEQ ID N0:64組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0343]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段或結合與Ab7所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Ab7而言，Fab片段包括SEQ ID NO:61的可變輕鏈序列和SEQ ID NO:63的可變重鏈序列。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID N0:61和/或SEQ IDNO:63的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0344]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Ab7的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如Ab7或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NSO或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。[0345]杭體Ab8
[0346]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括Ab8或其片段，或結合與Ab8所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或片段(例如下文中所示的)。在一個實施方案中，本發明包括具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列的嵌合或人源化抗體:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIYNLLAWYQQKPGKVPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:71)。
[0347]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIYNLLAWYQQKPGKVPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:72)。
[0348]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYASSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSYAAYGGYPATFDPWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:73)。
[0349]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYASSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSYAAYGGYPA TFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:74)。
[0350]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO:71的可變輕鏈序列或SEQ ID NO:72的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76和SEQ ID NO: 77的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 73的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 74的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:78, SEQ ID N0:79和SEQ ID N0:80的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個任選實施方案中，本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0351]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:71或SEQ ID NO: 72的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:73或SEQ ID NO:74的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0352]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 71的可變輕鏈序列或SEQ IDNO:72的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:75,SEQ ID N0:76和SEQID NO:77的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0353]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO:73的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 74的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 78,SEQ ID NO: 79和SEQID NO:80的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0354]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO:71的可變輕鏈區、SEQ ID NO:73的可變重鏈區、SEQ ID NO:71的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:75,SEQ ID N0:76 和 SEQ ID NO:77)和 SEQ ID NO:73的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:78, SEQ ID N0:79和SEQ ID NO:80) ?
[0355]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗-NGF抗體是Ab8，其包含SEQ ID NO: 72和SEQ ID NO: 74或可選擇地由SEQ IDN0:72和SEQ ID NO:74組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0356]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Ab8而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 71的可變輕鏈序列和SEQ IDNO: 73的可變重鏈序列或結合與Ab8所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID N0:71和/或SEQ IDNO: 73的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
`[0357]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過AbS的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如Ab8或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NSO或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0358]杭體 Ab9
[0359]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括Ab9或其片段，或結合與Ab9所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個任選實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASENIGSYLAWYQQKPGQPPELLIYRASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTEVVVKR(SEQ ID N0:81)。
[0360]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASENIGSYLAWYQQKPGQPPELLIYRASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:82)。
[0361]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASWAKGRFTISKTSTTVELKITSPTIEDTATYFCARETPVNYYLDIffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:83)。
[0362]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASffAKGRFTISKTSTTVELKITSPTIEDTATYFCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:84)。
[0363]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO:81的可變輕鏈序列或SEQ ID N0:82的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86和SEQ ID NO: 87的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO:83的可變重鏈序列或SEQ ID N0:84的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:88, SEQ ID N0:89和SEQ ID N0:90的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個任選實施方案中，本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0364]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:81或SEQ ID N0:82的多肽序列，或可選`擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:83或SEQ ID N0:84的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0365]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID N0:81的可變輕鏈序列或SEQ IDN0:82的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:85,SEQ ID N0:86和SEQID NO:87的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0366]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID N0:83的可變重鏈序列或SEQ IDN0:84的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:88,SEQ ID N0:89和SEQID NO:90的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0367]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO:81的可變輕鏈區、SEQ ID NO:83的可變重鏈區、SEQ ID NO:81的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:85,SEQ ID N0:86 和 SEQ ID NO:87)和 SEQ ID NO:83的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:88, SEQ ID N0:89和SEQ ID NO:90) ?
[0368]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗-NGF抗體是Ab9，其包含SEQ ID NO: 82和SEQ ID NO: 84或可選擇地由SEQ ID NO: 82和SEQ ID N0:84組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。[0369]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Ab9而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 81的可變輕鏈序列和SEQ IDNO:83的可變重鏈序列或結合與Ab9所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO:81和/或SEQ IDNO:83的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0370]在本文(下文)中描述的本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Ab9的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個任選實施方案中，抗-NGF抗體例如Ab9或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NSO或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0371]杭體 AblO
[0372]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括AblO或其片段，或結合與AblO所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個任選實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIGSYLAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTKVEIKR(SEQ IDN0:91)。
[0373]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIGSYLAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:92)。
[0374]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARETPVNYYLDIffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:93)。
[0375]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:94)。
[0376]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO:91的可變輕鏈序列或SEQ ID N0:92的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO:93的可變重鏈序列或SEQ ID N0:94的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:98,SEQ ID N0:99和SEQ ID NO: 100的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0377]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:91或SEQ ID N0:92的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:93或SEQ ID N0:94的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0378]在本發明的其它實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO:91的可變輕鏈序列或SEQ ID NO:92的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:95, SEQ ID N0:96和SEQ IDNO:97的多肽序列的一 個或多個，或可選擇地由其組成。
[0379]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID N0:93的可變重鏈序列或SEQ IDN0:94的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:98,SEQ ID N0:99和SEQID NO: 100的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0380]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID N0:91的可變輕鏈區、SEQ ID NO:93的可變重鏈區、SEQ ID N0:91的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97)和SEQ ID NO:93的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:98,SEQ IDNO:99 和 SEQ ID NO:100)。
[0381]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗-NGF抗體是Ab 10，其包含SEQ ID N0:92和SEQ ID NO:94或可選擇地由SEQ IDN0:92和SEQ ID N0:94組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0382]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體AblO而言，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段包括SEQ ID NO:91的可變輕鏈序列和SEQ ID NO:93的可變重鏈序列或結合與AblO所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID N0:91和/或SEQ ID N0:93的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0383]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過AblO的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如AblO或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NSO或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0384]杭體 Abll
[0385]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括AblI或其片段，或結合與AblI所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個任選實施方案中，本發明包括具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列的嵌合抗體:AFELTQTPSSVEAAVGGTVTIKCQASQNIVTNLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYFCQSYDGFNSAGFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:101)。
[0386]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:AFELTQTPSSVEAAVGGTVTIKCQASQNIVTNLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYFCQSYDGFNSAGFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:102)。
[0387]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEYIGLISYDGNTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:103)。
[0388]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，所述抗體具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEYIGLISYDGNTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:104)。
[0389]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO: 101的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 102的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的 SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106 和 SEQ ID NO: 107 的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 103的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 104的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區) 的SEQ ID NO: 108,SEQ ID NO: 109和SEQ ID NO: 110的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體或其片段任選地包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0390]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID NO: 101或SEQ ID NO: 102的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個任選實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:103或SEQ ID NO: 104的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0391]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 101的可變輕鏈序列或SEQ IDNO: 102的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 105,SEQ ID NO: 106SEQ ID NO: 107的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0392]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 103的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 104的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 108,SEQ ID NO: 109和SEQ ID NO: 110的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0393]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO: 101的可變輕鏈區、SEQ ID NO: 103的可變重鏈區、SEQ ID NO: 101的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 105,SEQ ID N0:106和SEQ ID NO: 107)和SEQ IDNO: 103 的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 108,SEQ ID N0:109和 SEQ ID NO: 110) ?
[0394]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗-NGF抗體是Abll，其包含SEQ ID `NO: 102和SEQ ID NO: 104或可選擇地由SEQ ID NO: 102和SEQ ID NO: 104組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0395]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Abll而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 101的可變輕鏈序列和SEQID NO: 103的可變重鏈序列或包括結合與Abll所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 101和/或SEQ ID NO: 103的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0396]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Abll的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個任選實施方案中，抗-NGF抗體例如Abll或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0,NSO或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0397]杭體 Abl2
[0398]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括Abl2或其片段，或結合與Abl2所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個任選實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:AFQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIVTNLAWYQQKPGKVPKLLIYGASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQSYDGFNSAGFGGGTKVEIKR(SEQ IDN0:111)。
[0399]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:AFQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIVTNLAWYQQKPGKVPKLLIYGASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQSYDGFNSAGFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:112)。
[0400]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEWVGLISYDGNTYYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:113)。
[0401]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEWVGLISYDGNTYYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS`RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:114)。
[0402]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO: 111的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 112的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的 SEQ ID NO: 115, SEQ ID N0:116 和 SEQ ID NO: 117 的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 113的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 114的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 118,SEQ ID N0:119和SEQ ID N0:120的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個任選實施方案中，本發明的抗體或其片段任選地包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0403]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 112的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:113或SEQ ID NO: 114的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0404]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 111的可變輕鏈序列或SEQ IDNO: 112的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 115,SEQ ID NO: 116和SEQ ID NO: 117的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0405]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 113的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 114的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 118,SEQ ID NO: 119和SEQ ID NO: 120的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0406]本發明還任選地涉及包括本文中描述的抗體片段的一個或多個的抗體片段。在本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO: 111的可變輕鏈區、SEQ ID NO: 113的可變重鏈區、SEQ ID NO: 111的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 115,SEQ ID N0:116和SEQ ID NO: 117)和SEQ IDNO: 113 的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 118,SEQ ID N0:119和 SEQ ID NO: 120) ?
[0407]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗-NGF抗體是Ab 12，其包含SEQ ID NO: 112和SEQ ID NO: 114或可選擇地由SEQ IDN0:112和SEQ ID NO: 114組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0408]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Abl2而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 111的可變輕鏈序列和SEQID NO: 113的可變重鏈序列或包括結合與Abl2所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片 段。本發明的該任選實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 111和/或SEQ ID NO: 113的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0409]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Abl2的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗-NGF抗體例如Abl2或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NS0或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0410]杭體 Abl3
[0411]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括Abl3或其片段，或結合與Abl3所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGGGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:121)。
[0412]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGGGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:122)。
[0413]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:QSVEASGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETNYASWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:123)。
[0414]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QSVEASGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWI⑶IYFSNEETNYASWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:124)?
[0415]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO: 121的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 122的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的 SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126 和 SEQ ID NO: 127 的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 123的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 124的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 128,SEQ ID NO: 129和SEQ ID NO: 130的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個任選實施方案中，本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0416]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID NO: 121或SEQ ID NO: 122的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID NO: 123或SEQ ID NO: 124的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。`
[0417]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 121的可變輕鏈序列或SEQ IDNO: 122的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 125,SEQ ID NO: 126和SEQ ID NO: 127的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0418]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 123的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 124的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 128,SEQ ID NO: 129SEQ ID NO: 130的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0419]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO: 121的可變輕鏈區、SEQ ID NO: 123的可變重鏈區、SEQ ID NO: 121的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 125,SEQ ID N0:126和SEQ ID NO: 127)和SEQ IDNO: 123 的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 128,SEQ ID N0:129和 SEQ ID NO: 130) ?
[0420]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗-NGF抗體是Ab 13，其包含SEQ ID NO: 122和SEQ ID NO: 124或可選擇地由SEQ ID NO: 122和SEQ ID NO: 124組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0421]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Abl3而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 121的可變輕鏈序列和SEQID NO: 123的可變重鏈序列，或包括結合與Abl3所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段。本發明的該任選實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 121和/或SEQ ID NO: 123的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0422]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Abl3的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如Abl3或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NSO或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0423]杭體 Ab 14
[0424]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性的嵌合抗體，其中抗體為Abl4或其片段，或結合與Abl4所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個任選實施方案`中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:131)。
[0425]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:132)。
[0426]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:133)。
[0427]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:134)。
[0428]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO: 131的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 132的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的 SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136 和 SEQ ID NO: 137 的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 133的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 134的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 138,SEQ ID NO: 139和SEQ ID NO: 140的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個任選實施方案中，本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0429]本發明還任選地涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID NO: 131或SEQ ID NO: 132的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID NO: 133或SEQ ID NO: 134的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0430]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 131的可變輕鏈序列或SEQ IDNO: 132的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 135,SEQ ID NO: 136和SEQ ID NO: 137的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0431]在本發明的其 它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 133的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 134的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 138,SEQ ID NO: 139和SEQ ID NO: 140的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0432]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO: 131的可變輕鏈區、SEQ ID NO: 133的可變重鏈區、SEQ ID NO: 131的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 135,SEQ ID N0:136和SEQ ID N0:137)和SEQ IDNO: 133 的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 138,SEQ ID N0:139和 SEQ ID NO: 140) ?
[0433]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗-NGF抗體是Abl4，其包含SEQ ID NO: 132和SEQ ID NO: 134或可選擇地由SEQ IDNO: 132和SEQ ID NO: 134組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0434]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Abl4而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 131的可變輕鏈序列和SEQID NO: 133的可變重鏈序列，或結合與Abl4所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 131和/或SEQ ID NO: 133的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。[0435]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Abl4的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗-NGF抗體例如Abl4或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NS0或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0436]杭體 Abl5
[0437]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合而不顯著地抑制NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性的嵌合抗體，其中抗體為Ab15或其片段(例如下文中所示的)，或包括結合與Abl5所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段。在一個實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:AAVLTQTPSPVSAAVGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDTDNGFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:141)。
[0438]本發明還包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:AAVLTQTPSPVSAAVGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDTDNGFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:142)。
[0439]本發明還包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGIIffSGGTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLQITSPTTEDAATYFCAAGGGSIYDVWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:143)。
`[0440]本發明還包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGIIffSGGTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLQITSPTTEDAATYFCAAGGGSIYDVffGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:144)。
[0441]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO: 141的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 142的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的 SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146 和 SEQ ID NO: 147 的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 143的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 144的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 148,SEQ ID NO: 149和SEQ ID NO: 150的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0442]本發明還涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:141或SEQID NO: 142的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:143或SEQ ID NO: 144的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0443]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 141的可變輕鏈序列或SEQ IDNO: 142的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 145,SEQ ID NO: 146和SEQ ID NO: 147的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0444]在本發明的其它實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 143的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 144的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 148,SEQ ID NO: 149SEQ ID NO: 150的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0445]本發明還涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO: 141的可變輕鏈區、SEQ ID N0:143的可變重鏈區、SEQ ID NO: 141的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 145,SEQ ID NO: 146和SEQ ID NO: 147)和 SEQ ID NO: 143的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 148,SEQID NO:149 和 SEQ ID NO:150)。
[0446]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗-NGF抗體是Ab 15，其包含SEQ ID NO: 142和SEQ ID NO: 144或可選擇地由SEQ IDNO: 142和SEQ ID NO: 144組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0447]在本發明的其它特別優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Abl5而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 141的可變輕鏈序列和SEQ IDNO: 143的可變重鏈序列，或包括結合與Abl5所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID N0:141和/或SEQ ID NO: 143的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0448]在本文(下文)中描述的本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Abl5的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗-NGF抗體例如Abl5或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NS0或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0449]杭體 Ab 16
[0450]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合而不顯著地抑制NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性的嵌合抗體，其中抗體為Abl6或其片段(例如下文中所示的)，或包括結合與Abl6所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段。在一個實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:ALVMTQTPSSTSEPVGGTVTINCQASQNIGNDLSWYQQKPGQPPELLIYSTSKLATGVPKRFSGSRSGTQFTLTISDLECDDAATYYCLGVYSYISDDGNAFGGGTEVWKR(SEQ ID NO:151)。
[0451]本發明還包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:ALVMTQTPSSTSEPVGGTVTINCQASQNIGNDLSWYQQKPGQPPELLIYSTSKLATGVPKRFSGSRSGTQFTLTISDLECDDAATYYCLGVYSYISDDGNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:152)。
[0452]本發明還包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈鏈序列:QSVEEFGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMTWVRQAPGKGLEWIGIIGSIGTTYYASffAKGRFFISKTSTTVDLKIISPTTEDTATYFCARDAGVTVDGYGYYFNIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:153)。
[0453]本發明還包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈鏈序列:QSVEEFGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMTWVRQAPGKGLEWIGIIGSIGTTYYASffAKGRFFISKTSTTVDLKIISPTTEDTATYFCARDAGVTVDGYGYYFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:154)。
[0454]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO: 151的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 152的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的 SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156 和 SEQ ID NO: 157 的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 153的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 154的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 158,SEQ ID NO: 159和SEQ ID NO: 160的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0455]本發明還涉及用于治療疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:151或SEQID NO: 152的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體片段包含SEQ ID NO: 153或SEQ IDNO: 154的多肽序列或可 選擇地由所述多肽序列組成。
[0456]在本發明的其它實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 151的可變輕鏈序列或SEQ IDNO: 152的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 155,SEQ ID NO: 156SEQ ID NO: 157的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0457]在本發明的其它實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 153的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 154的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 158,SEQ ID NO: 159SEQ ID NO: 160的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0458]本發明還涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO: 151的可變輕鏈區、SEQ ID NO: 153的可變重鏈區、SEQ ID NO: 151的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 155,SEQ ID N0:156和SEQ ID N0:157)和SEQ ID NO: 153的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159和SEQ ID NO: 160)。
[0459]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗-NGF抗體是Ab 16，其包含SEQ ID NO: 152和SEQ ID NO: 154或可選擇地由SEQ IDNO: 152和SEQ ID NO: 154組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0460]在本發明的其它特別優選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Ab 16而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 151的可變輕鏈序列和SEQ ID NO: 153的可變重鏈序列，或包括結合與Abl6所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或另一種雙價或單價抗體片段。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 151和/或SEQ ID NO: 153的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
`[0461]在本文(下文)中描述的本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Abl6的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗-NGF抗體例如Abl6或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NS0或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0462]杭體Abl7
[0463]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性的嵌合抗體，其中抗體為Abl7或其片段(例如下文中所示的)，或包括結合與Abl7所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段。在一個實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:AIEMTQTPFSVSAAVGGTVTIKCQASQTISNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:161)。
[0464]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:AIEMTQTPFSVSAAVGGTVTIKCQASQTISNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:162)。
[0465]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCAASGFSLTGYNLVWVRQAPGKGLEWIGFISYGDTTYYASWAKGRFTISKTSTTVTLTITDLQPSDTGTYFCARETANTYDYGIffGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:163)。[0466]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCAASGFSLTGYNLVWVRQAPGKGLEWIGFISYGDTTYYASWAKGRFTISKTSTTVTLTITDLQPSDTGTYFCARETANTYDYGIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:164)。
[0467]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO: 161的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 162的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的 SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166 和 SEQ ID NO: 167 的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 163的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 164的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 168,SEQ ID NO: 169和SEQ ID NO: 170的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0468]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ IDNO: 161或SEQ ID NO: 162的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個任選實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID NO: 163或SEQ ID NO: 164的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0469]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 161的可變輕鏈序列或SEQ IDNO: 162的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 165,SEQ ID NO: 166SEQ ID NO: 167的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0470]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 163的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 164的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 168,SEQ ID NO: 169和SEQ ID NO: 170的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0471]本發明還涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO: 161的可變輕鏈區、SEQ ID N0:163的可變重鏈區、SEQ ID NO: 161的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 165,SEQ ID NO: 166和SEQ ID NO: 167)和SEQ ID NO: 163的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 168,SEQID NO:169 和 SEQ ID NO:170)。
[0472]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗-NGF抗體是Ab 17，其包含SEQ ID NO: 162和SEQ ID NO: 164或可選擇地由SEQ ID NO: 162和SEQ ID NO: 164組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0473]在本發明的其它特別地優選的任選實施方案中，用于治療或預防疾病和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Abl7而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 161的可變輕鏈序列和SEQID NO: 163的可變重鏈序列，或包括結合與Abl5所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價或雙價抗體片段。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ IDNO: 161和/或SEQ ID NO: 163的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0474]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Abl7的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如Abl7或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NSO或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0475]杭體 Ab 18
[0476]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性的嵌合抗體，其中抗體為Abl8或其片段(例如下文中所示的)，或包括結合與Abl`8所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段。在一個實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQTISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:171)。
[0477]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQTISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:172)。
[0478]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSGYNLVWVRQAPGKGLEWVGFISYGDTTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETANTYDYGIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:173)。
[0479]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSGYNLVWVRQAPGKGLEWVGFISY⑶TTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETANTYDYGIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:174)。
[0480]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO: 171的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 172的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的 SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176 和 SEQ ID NO: 177 的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 173的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 174的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 178,SEQ ID NO: 179和SEQ ID NO: 180的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0481]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ IDN0:171或SEQ ID NO: 172的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個任選實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID NO: 173或SEQ ID NO: 174的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0482]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 171的可變輕鏈序列或SEQ IDNO: 172的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 175,SEQ ID NO: 176SEQ ID NO: 177的多肽序列的`一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0483]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 173的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 174的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 178,SEQ ID NO: 179和SEQ ID NO: 180的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0484]本發明還涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO: 171的可變輕鏈區、SEQ ID N0:173的可變重鏈區、SEQ ID NO: 171的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 175,SEQ ID NO: 176和SEQ ID NO: 177)和SEQ ID NO: 173的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 178,SEQID NO:179 和 SEQ ID NO:180)。
[0485]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗-NGF抗體是Ab 18，其包含SEQ ID NO: 172和SEQ ID NO: 174或可選擇地由SEQ IDNO: 172和SEQ ID NO: 174組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。[0486]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體AblS而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 171的可變輕鏈序列和SEQ ID NO: 173的可變重鏈序列，或包括結合與Abl8所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或抗體片段。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 171和/或SEQ ID NO: 173的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0487]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過AblS的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如Abl8或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NSO或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0488]杭體 Ab 19
[0489]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性的嵌合抗體，其中抗體為Abl9或其片段(例如下文中所示的)，或包括結合與Abl9所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段。在一個實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGSGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYSSSSDNAFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:181)。
[0490]本發明還任選地 包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGSGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYSSSSDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:182)。
[0491]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:QSVEASGGRLVMPGGSLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWI⑶IYFSNEETNYATWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:183)。
[0492]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:QSVEASGGRLVMPGGSLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWI⑶IYFSNEETNYATWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:184)。
[0493]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO: 181的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 182的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的 SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186 和 SEQ ID NO: 187 的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 183的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 184的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 188,SEQ ID NO: 189和SEQ ID NO: 190的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0494]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ IDNO: 181或SEQ ID NO: 182的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個任選實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID NO: 183或SEQ ID NO: 184的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0495]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 181的可變輕鏈序列或SEQ IDNO: 182的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 185,SEQ ID NO: 186和SEQ ID NO: 187的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0496]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 183的可變重鏈序列或SEQ IDNO: 184的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 188,SEQ ID NO: 189SEQ ID NO: 190的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0497]本發明還涉及 用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個任選實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO: 181的可變輕鏈區、SEQ ID NO: 183的可變重鏈區、SEQ ID NO: 181的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186 和 SEQ ID NO: 187)和 SEQ IDNO: 183 的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 188,SEQ ID N0:189和 SEQ ID NO: 190) ?
[0498]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合抗-NGF抗體是Ab 19，其包含SEQ ID NO: 182和SEQ ID NO: 184或可選擇地由SEQ ID NO: 182和SEQ ID NO: 184組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0499]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Abl9而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 181的可變輕鏈序列和SEQID NO: 183的可變重鏈序列，或包括結合與Abl9所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或抗體片段。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 181和/或SEQ ID NO: 183的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0500]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Abl9的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，抗-NGF抗體例如Abl9或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NSO或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0501]杭體Ab20
[0502]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性的嵌合抗體，其中抗體為Ab20或其片段(例如下文中所示的)，或包括結合與Ab20所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段。在一個實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:191)。
[0503]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:192)。
[0504]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:193)。
`[0505]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:194)。
[0506]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO: 191的可變輕鏈序列或SEQ ID NO: 192的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的 SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196 和 SEQ ID NO: 197 的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO: 193的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 194的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 198,SEQ ID NO: 199和SEQ ID N0:200的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0507]本發明還任選地涉及具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體片段包含SEQ IDNO: 191或SEQ ID NO: 192的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個任選實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID NO: 193或SEQ ID NO: 194的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0508]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 191的可變輕鏈序列或SEQ IDNO: 192的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 195,SEQ ID NO: 196和SEQ ID NO: 197的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0509]在本發明的其它任選實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO: 193的可變重鏈序列或SEQ ID NO: 194的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199和SEQ ID NO:200的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0510]本發明還涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO: 191的可變輕鏈區、SEQ ID NO: 193的可變重鏈區、SEQ ID NO: 191的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 195,SEQ ID N0:196和SEQ ID N0:197)和SEQ ID NO: 193的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199和SEQ ID NO: 200) ?
[0511]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗-NGF抗體是Ab20，其包含SEQ ID NO: 192和SEQ ID NO: 194或可選擇地由SEQ IDNO: 192和SEQ ID NO: 194組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0512]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Ab20而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 191的可變輕鏈序列和SEQID NO: 193的可變重鏈序列。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID NO: 191和/或SEQ ID NO: 193的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0513]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Ab20的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗-NGF抗體例如Ab20或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NS0或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0514]杭體 Ab21
[0515]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，單獨地或與另一種活性劑例如NSAID或阿片類鎮痛藥結合地治療疼痛和特定疼痛相關障礙的方法，其中抗體包括具有對于NGF的結合特異性的嵌合抗體，其中抗體為Ab21或其片段，或結合與Ab5所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種抗體或抗體片段(例如下文中所示的)。在一個實施方案中，本發明包括具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變輕鏈序列的嵌合或 人源化抗體:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKR(SEQID N0:51)。
[0516]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:401)。
[0517]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的可變重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:53)。
[0518]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗體，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:402)。
[0519]本發明還任選地 涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體，所述抗體包含對應于SEQ ID NO:51的可變輕鏈序列或SEQ ID N0:401的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO:53的可變重鏈序列或SEQ ID N0:402的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID N0:60的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體或其片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0520]本發明還任選地涉及具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:51或SEQ ID N0:401的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體片段包含SEQ ID NO:53或SEQ ID N0:402的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0521]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO:51的可變輕鏈序列或SEQ IDN0:401的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:55, SEQ ID N0:56和SEQ ID N0:57的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0522]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO:53的可變重鏈序列或SEQ IDN0:402的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID N0:60的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0523]本發明還涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO:51的可變輕鏈區、SEQ ID NO:53的可變重鏈區、SEQ ID NO:51的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 55,SEQ ID NO: 56 和 SEQ ID NO: 57)和 SEQ ID NO: 53 的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO: 58, SEQ ID N0:59和SEQ ID NO:60) ?
[0524]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗-NGF抗體是Ab21，其包含SEQ ID NO:401和SEQ ID NO:402或可選擇地由SEQ IDN0:401和SEQ ID N0:402組成，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0525]在本發明的其它特別地任選的優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段包含具有對于NGF的結合特異性的Fab (片段抗原結合)片段，或可選擇地由所述片段組成。就抗體Ab21而言，Fab片段包括SEQ ID NO: 51的可變輕鏈序列和SEQ IDNO:53的可變重鏈序列或結合與Ab5所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或單價抗體片段。本發明的該實施方案還涉及所述Fab中的SEQ ID N0:51和/或SEQ IDNO:53的添加、缺失和變體(同時保持對于NGF的結合特異性)。
[0526]在本文(下文)中描述的本發明的一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過Ab21的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗-NGF抗體例如Ab21或其Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CH0、NS0或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。
[0527]杭體片段Fabl
[0528]本發明涉及以抑制NGF與T`rkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，使用抗體片段Fabl或其片段(例如下文中所示的)治療疼痛的方法。在一個實施方案中，本發明任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab抗體片段，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列:
[0529]DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:405)。
[0530]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab抗體片段，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTH(SEQ ID NO:406)。
[0531]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體片段，所述抗體片段包含對應于SEQ ID NO:51的可變輕鏈序列或SEQ ID NO:405的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:55, SEQ ID N0:56和SEQ ID N0:57的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO:53的可變重鏈序列或SEQ ID N0:406的重鏈序列的互補性決定區(CDR,或高變區)的SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID N0:60的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0532]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ IDN0:51或SEQ ID NO:405的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個任選實施方案中，本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:53或SEQ ID NO:406的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0533]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含對應于SEQ ID NO:51的可變輕鏈序列或SEQ IDN0:405的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56SEQ ID N0:57的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0534]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體片段包含對應于SEQ ID NO:53的可變重鏈序列或SEQ IDN0:406的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID N0:60的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0535]本發明還涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO:51的可變輕鏈區、SEQ ID NO:53的可變重鏈區、SEQ ID NO:51的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID `NO:55,SEQ ID N0:56 和 SEQ ID NO:57)和 SEQ ID N0:53 的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID NO:60) ?
[0536]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的嵌合或人源化抗-NGF抗體是Fabl，其包含SEQ ID NO:405和SEQ ID NO: 406，或結合與Fabl所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或抗體片段，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。在本發明的一個實施方案中，抗體片段Fabl可通過Ab21的酶促降解(例如，木瓜蛋白酶)產生。
[0537]杭體片段Fab2
[0538]本發明涉及以抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合的治療有效量，使用抗體片段Fab2或其片段(例如下文中所示的)治療疼痛的方法。在一個實施方案中，本發明包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab抗體片段，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的輕鏈序列的:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:407)。
[0539]本發明還任選地包括用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab抗體片段，其具有對于NGF的結合特異性并且具有包含下文中所示序列的重鏈序列的:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTH(SEQ ID NO:408)。[0540]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和特定疼痛相關病況的抗體片段，所述抗體片段包含對應于SEQ ID NO:51的可變輕鏈序列或SEQ ID NO:407的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:55, SEQ ID N0:56和SEQ ID N0:57的多肽序列的一個或多個，和/或對應于SEQ ID NO:53的可變重鏈序列或SEQ ID N0:408的重鏈序列的互補性決定區(CDR,或高變區)的SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59和SEQ ID N0:60的多肽序列的一個或多個，或這些多肽序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體片段包含CDR、可變重鏈和可變輕鏈序列以及上文中所示的重鏈和輕鏈序列的一個或多個的組合(包括它們全部)，或可選擇地由其組成。
[0541]本發明還任選地涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段。在本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:51或SEQ ID N0:407的多肽序列，或可選擇地由所述多肽序列組成。在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的本發明的抗體片段包含SEQ ID N0:53或SEQ ID N0:408的多肽序列或可選擇地由所述多肽序列組成。
[0542]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體片段包含對應于SEQ ID NO:51的可變輕鏈序列或SEQ IDN0:407的輕鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:55, SEQ ID N0:56和SEQ ID N0:57的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0543]在本發明的其它任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體片段包含對應于SEQ ID NO:53的可變重鏈序列或SEQ IDN0:408的重鏈序列的互補性決定區(CDR，或高變區)的SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59SEQ ID N0:60的多肽序列的一個或多個，或可選擇地由其組成。
[0544]本發明還涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體片段，其包括本文中描述的抗體片段的一個或多個。在本發明的一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的具有對于NGF的結合特異性的抗體的片段包含下列抗體片段的I個、2個、3個或更多個(包括全部)或可選擇地由其組成:SEQ ID NO: 51的可變輕鏈區、SEQ ID NO: 53的可變重鏈區、SEQ ID NO:51的可變輕鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57)和SEQ ID NO:53的可變重鏈區的互補性決定區(SEQ ID NO:58,SEQ IDNO:59 和 SEQ ID NO:60)。
[0545]在本發明的特別優選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗-NGF抗體是Fab2，其包含SEQ ID N0:407和SEQ ID N0:408，或結合與Fab2所結合的表位相同的或與之重疊的表位的另一種Fab或抗體片段，并且具有本文中所示的生物活性的至少一種。
[0546]在本文(下文)中描述的本發明的另一個任選實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的Fab片段可通過在哺乳動物細胞例如CHO、NSO或HEK293細胞、真菌、昆蟲、植物或微生物系統例如酵母細胞(例如二倍體酵母例如二倍體畢赤酵母)和其它酵母菌株中表達來產生。適當的畢赤酵母的種包括但不限于巴斯德畢赤酵母。在本發明的一個實施方案中，抗體片段Fab2可通過使用在本文中在實施例中所示的方案在巴斯德畢赤酵母中表達來實現。
[0547]在另一個任選實施方案中，抗體片段可以以下列非限定形式的一個或多個形式存在:Fab、Fab’、F (ab’)2、Fv和單鏈Fv抗體形式。在優選實施方案中，本文中所述的抗-NGF抗體還包含含有下文中所示序列的K恒定輕鏈序列:
[0548]VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:412)。
[0549]在另一個優選的任選實施方案中，本文中描述的用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗-NGF抗體還包含含有下文中所示序列的Y -1恒定重鏈多肽序列:
[0550]ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:413)。
[0551]在另一個任選實施方案中，本發明涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的分離抗-NGF抗體，其包含選自如下序列的VhS肽序列:SEQ ID NO: 3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、153、163、173、183、193 或 402 或其變體，并且還包含選自如下序列的 Vl 多肽序列:SEQ ID N0:l、ll、21、31、41、51、61、71、81、91、101、lll、121、131、141、151、161、171、181、191或401或其變體，其中所述Vh或Vl多肽中的框架殘基(FR殘基)的一個或多個已被另一個氨基酸殘基置換，從而導致特異性結合NGF的抗-NGF抗體。本發明涉及用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的這些抗體的人源化和嵌合形式。嵌合抗體包括來源于 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgGlO、IgGll、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18 或 IgG19 恒定區的 Fc。
[0552]在本發明的一個實施方案中，在本文中提及的人源化過程開始之前，抗體或Vh或Vl多肽源自或選自一個或多個兔B細胞群體。
[0553]在本發明的另一個實施方案中，用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗-NGF抗體及其片段不具有對于P75或TrkA的結合特異性。在本發明的其它實施方案中，涉及了用于治療疼痛的方法，包括使用抗-NGF抗體及其片段抑制NGF與p75和/或TrkA締合。在本發明的另一個實施方案中，涉及用于治療疼痛的方法，包括使用抗-NGF抗體及其片段抑制NGF與TrkA和/或其多聚體的締合和/或拮抗其生物學作用。在本發明的另一個實施方案中，涉及用于使用治療疼痛的方法，包括使用抗-NGF抗體及其片段抑制NGF與p75和/或其多聚體的締合以 及NGF與TrkA和/或其多聚體的締合，和拮抗p75和TrkA的生物學作用。
[0554]如上文中所提及的，可對抗體和其部分進行翻譯后修飾以添加效應物部分例如化學接頭、可檢測部分例如熒光染料、酶、底物、生物發光物質、放射性物質和化學發光部分或功能性部分例如鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、生物素、細胞毒素、細胞毒性劑和放射性物質。[0555]關于可檢測的部分，其它示例性酶包括但不限于辣根過氧化物酶、乙酰膽堿酯酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和螢光素酶。其它示例性熒光物質包括但不限于羅丹明、熒光素、異硫氰酸熒光素、傘形花內酯、二氯三嗪胺、藻紅蛋白和丹磺酰氯。其它示例性化學發光部分包括但不限于魯米諾。其它示例性生物發光物質包括但不限于螢光素和水母熒光蛋白。其它示例性放射性物質包括但不限于碘125 (125I)、碳H(14C)、硫35 (35S)、氣(3H)和磷32 (32P)。
[0556]關于功能性部分，示例性細胞毒性劑包括但不限于甲氨蝶呤、氨基蝶呤、6-巰嘌呤、6-巰鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟脲嘧啶達卡巴嗪；烷化劑例如氮芥、硫噴妥苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法侖、卡莫司汀(BSNU)、絲裂霉素 C、SimSun ; (CCNU)、1-甲基亞硝脲、環磷酰胺、氮芥、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C、順二氯二氨基鉬(cis-dichlorodiamine platinum) (II) (DDP)順鉬和順鉬(伯爾定);蒽環類，包括柔紅霉素(先前稱為道諾霉素)、多柔比星、地托比星、洋紅霉素、伊達比星、表柔比星、米托蒽醌和比生群；抗生素類，包括更生霉素(放線菌素D)、博來霉素、卡奇霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC);以及抗有絲分裂劑例如長春花生物堿類、長春新堿和長春堿。其它細胞毒素劑包括紫杉醇(泰素)、蓖麻毒素、假單胞菌外毒素、吉西他濱、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴乙啶、依米丁、依托泊苷、鬼白噻吩甙、秋水仙堿、二羥基蒽二酮、1-去氫睪丸素、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤霉素、丙卡巴肼、羥基脲、門冬酰胺酶、皮質類固醇、米托坦(0，P’ -(DDD))、干擾素及這些細胞毒素劑的混合物。
[0557]其它細胞毒性劑包括但不限于化學治療劑例如卡鉬、順鉬、紫杉醇、吉西他濱、卡奇霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C、放線菌素D、環磷酰胺、長春新堿和博來霉素。可將來自植物和細菌的毒性酶例如蓖麻毒素、白喉毒素和假單胞菌屬(Pseudomonas)毒素綴合至人源化或嵌合抗體或其結合片段，以產生細胞類型特異性殺傷試劑(Youle等，Proc.Nat' I Acad.Sc1.USA77: 5483 (1980) ；Gilliland 等，Proc.Nat' I Acad.Sc1.USA77:4539 (1980) ；Krolick 等，Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA77:5419 (1980))。
[0558]其它細胞毒性劑包括如由Goldenberg在美國專利N0.6，653，104中描述的細胞毒性核糖核酸酶。本發明的實施方案還涉及放射免疫綴合物，其中在使用或不使用復合物形成劑的情況下將發射α、β粒子的放``射性核素穩定地偶聯至抗體，或其結合片段。這樣的放射性核素包括β發射體例如磷-32 (32P)、鈧-47 (47Sc)、銅-67 (67Cu)、鎵-67 (67Ga)、釔-88 (88Y)、釔-90 (9ciY)、碘-125 (125I)、碘-131 (131I)、釤-153 (153Sm)、镥-177 (177Lu)、錸-186 (186Re)或錸-188 (188Re)，和 α -發射體例如砹-211 (211At)、鉛-212 (212Pb)、鉍-212 (212Bi)或-213 (213Bi)或錒-225 (225Ac)。
[0559]其它示例性放射性物質包括但不限于碘125 (125I)、碳H(14C)、硫35 (35S)、氚(3H)和磷 32 (32P)。
[0560]關于功能性部分，示例性細胞毒性劑包括但不限于甲氨蝶呤、氨基蝶呤、6-巰嘌呤、6-巰鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟脲嘧啶達卡巴嗪；烷化劑例如氮芥、硫噴妥苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)、絲裂霉素C、SimSun ； (CCNU)U-甲基亞硝脲、環磷酰胺、氮芥、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C、順二氯二氨基鉬(II) (DDP)順鉬和順鉬(伯爾定)；蒽環類，包括柔紅霉素(先前稱為道諾霉素)、多柔比星、地托比星、洋紅霉素、伊達比星、表柔比星、米托蒽醌和比生群；抗生素類，包括更生霉素(放線菌素D)、博來霉素、卡奇霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC);以及抗有絲分裂劑例如長春花生物堿類、長春新堿和長春堿。其它細胞毒素劑包括紫杉醇(泰素)、蓖麻毒素、假單胞菌外毒素、吉西他濱、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴乙啶、依米丁、依托泊苷、鬼白噻吩甙、秋水仙堿、二羥基蒽二酮、1-去氫睪丸素、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤霉素、丙卡巴肼、羥基脲、門冬酰胺酶、皮質類固醇、米托坦(O，P’ -(DDD))、干擾素及這些細胞毒素劑的混合物。
[0561]其它細胞毒性劑包括但不限于化學治療劑例如卡鉬、順鉬、紫杉醇、吉西他濱、卡奇霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C、放線菌素D、環磷酰胺、長春新堿和博來霉素。可將來自植物和細菌的毒性酶例如蓖麻毒素、白喉毒素和假單胞菌屬毒素綴合至人源化或嵌合抗體或其結合片段，以產生細胞類型特異性殺傷試劑(Youle,等，Proc.Nat' IAcad.Sc1.USA77:5483 (1980) ；Gilliland,等，Proc.Nat’I Acad.Sc1.USA77:4539 (1980)；Krolick,等，Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA77:5419 (1980))。
[0562]其它細胞毒性劑包括如由Goldenberg在美國專利N0.6，653，104中描述的細胞毒性核糖核酸酶。本發明的實施方案還涉及放射免疫綴合物，其中在使用或不使用復合物形成劑的情況下將發射α、β粒子的放射性核素穩定地偶聯至抗體，或其結合片段。這樣的放射性核素包括β發射體例如磷-32 (32P)、鈧-47 (47Sc)、銅-67 (67Cu)、鎵-67 (67Ga)、釔-88 (88Y)、釔-90 (9ciY)、碘-125 (125I)、碘-131 (131I)、釤-153 (153Sm)、镥-177 (177Lu)、錸-186 (186Re)或錸-188 (188Re)和 α -發射體例如砹-211 (211At)、鉛-212 (212Pb)、鉍-212 (212Bi)或-213 (213Bi)或錒-225 (225Ac)。
[0563]用于將抗體或其結合片段綴合至可檢測的部分等的方法在本領域是已知的，例如由 Hunter 等，Naturel44:945 (1962) ；David 等，Biochemistryl3:1014 (1974) ；Pain 等，J.Tmmunol.Meth.40:219(1981)和 Nygren, J., Histochem.and Cytochem.30:407 (1982)描述的那些方法。
[0564]本文中描述的實施方案還包括與本文中所示的抗體、抗體片段、雙體抗體、SMIP、駱鴕體、納米抗體、IgNA R、多肽、可變區和⑶R具有顯著同源性的變體和等同物。這些變體和等同物可包含例如保守置換突變(即，相似氨基酸對一個或多個氨基酸的置換)。例如，保守置換是指相相同的一般種類中的另一個氨基酸對氨基酸的置換，例如用另一個酸性氨基酸置換一個酸性氨基酸，用另一個堿性氨基酸置換一個堿性氨基酸，或用另一個中性氨基酸置換一個中性氨基酸。期望進行保守氨基酸置的情形在本領域是公知的。
[0565]在另一個任選實施方案中，本發明涉及與本文中所示的抗體片段、可變區和CDR的多肽序列的任一個或多個具有至少90%或更大的序列同源性的多肽序列。更優選地，本發明涉及與本文中所示的抗體片段、可變區和CDR的多肽序列的任一個或多個具有至少95%或更大的序列同源性，更優選至少98%或更大的序列同源性，更優選至少99%或更大的序列同源性的多肽序列。用于測定核酸與氨基酸序列之間的同源性的方法對于本領域技術人員來說是公知的。
[0566]在另一個任選實施方案中，本發明還涉及還具有抗-NGF活性的本文中所示的抗體片段、可變區和CDR的上述多肽同源物。抗-NGF活性的非限定性實例示于本文中。
[0567]在另一個任選實施方案中，本發明還涉及結合前述序列的任何序列的抗獨特型抗體的產生和用途。在示例性實施方案中，可給已接受抗-NGF抗體的受試者施用這樣的抗獨特型抗體來調節、減小或中和抗-NGF抗體的作用。這樣的抗獨特型抗體還可用于治療特征在于抗-NGF抗體的存在的自身免疫疾病。這樣的抗獨特型抗體的其它示例性用途是用于檢測本發明的抗-NGF抗體，例如以監測存在于受試者的血液或其它體液中的抗-NGF抗體的水平。
[0568]本發明還涉及抗-NGF抗體，其包括用本文中描述的其它多核苷酸序列的任何序列置換本文中描述的多肽或多核苷酸序列的任何序列。例如，但不限于其，本發明涉及包含本文中描述的可變輕鏈和可變重鏈序列的任一個組合的抗體，并且還涉及因本文中描述的其它CDR序列的任何CDR序列置換本文中描述的CDR序列的任何CDR序列而產生的抗體。
[0569]編碼抗-NGF抗體多肽的多核苷酸
[0570]杭體 Abl
[0571]本發明還任選地涉及下文中所示的多核苷酸用于治療個體的疼痛的方法(包括給所述個體施用抗體Abl多肽)中產生用于治療或預防疼痛和疼痛相關病況的抗體Abl多肽(所述抗體多肽具有對于NGF的結合特異性，其抑制NGF與TrkA的締合和NGF與p75的締合)的用途。在本發明的一個實施方案中，本發明的多核苷酸包含下列編碼SEQ ID NO:1的可變輕鏈多肽序列的多核苷酸序列，或可選擇地由所述多核苷酸序列組成:
[0572]GCCCTTGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAACAGAGACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGATGCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGTTGGCACTTACTACTGTCAAAGTGCTTTTGATAGTGATAGTACTGAAAATACTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT(SEQ ID NO:20I)。
[0573]在本發明的一個任選實施方案中，本發明的多核苷酸包含下列編碼SEQ ID NO:2的輕鏈多肽序列的多核苷酸序列或可選擇地由所述多核苷酸序列組成:
[0574]GCCCTTGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAACAGAGACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGATGCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGTTGGCACTTACTACTGTCAAAGTGCTTTTGATAGTGATAGTACTGAAAATACTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO:202)。
[0575]在本發明的另一個任選實施方案中，本發明的多核苷酸包含下列編碼SEQ IDNO:3的可變重鏈多肽序列的多核苷酸序列或可選擇地由所述多核苷酸序列組成:
[0576]CAGTCGCTGGAGGAGTCC GGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGCTTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTACTAGTATTGGTAGCACAGTCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGCTACGATGACTATGATGAGATGACCTACTTTAACATCTGGGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO:203)。
[0577]在本發明的一個任選實施方案中，本發明的多核苷酸包含下列編碼SEQ ID NO:4的重鏈多肽序列的多核苷酸序列或可選擇地由所述多核苷酸序列組成:
【權利要求】
1.一種產生多亞基復合物的方法，其包括: (a)提供包含含有提供所述多亞基復合物的亞基的表達的基因的真核細胞的培養物； (b)將大劑量的乙醇添加至所述培養物；和 (C)培養所述培養物以產生所述多亞基復合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述大劑量乙醇相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法增加穩定的二硫鍵的形成。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述多亞基復合物包含一個或多個包含至少一個二硫鍵的多妝。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述多亞基復合物包含抗體。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法降低一種或多種產物相關變體的相對豐度。
6.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法降低產物相關變體的相對豐度，所述變體具有比所述期望的多亞基復合物更高或更低的表觀分子量，如通過尺寸排阻色譜法或凝膠電泳所檢測的。
7.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法降低具有異常化學計量的復合物的相對豐度。
8.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法降低具有異常二硫鍵的復合物的相對豐度。·
9.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法降低具有降低的半胱氨酸的復合物的相對豐度。
10.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法降低具有異常糖基化的復合物的相對豐度。
11.根據權利要求4所述的方法，其調節重鏈間二硫鍵的形成或穩定性。
12.根據權利要求4或11所述的方法，其調節連接輕鏈與重鏈的二硫鍵的形成或穩定性。
13.根據權利要求4或11至12中任一項所述的方法，其相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述相同方法降低一種或多種產物相關變體的相對豐度。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述產物相關變體包括H1L1、H2L1和H4L4產物相關變體的一種或多種。
15.根據權利要求4或11至14中任一項所述的方法，其相對于在所述大劑量乙醇不存在的情況下進行的所述方法增加所述抗體的純度。
16.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟(c)之前進行步驟(b)。
17.根據權利要求1至15中任一項所述的方法，其中在步驟(c)后進行步驟(b)。
18.根據權利要求1至15中任一項所述的方法，其中將步驟(b)與步驟(c)同時進行。
19.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(b)導致所述培養物中的乙醇濃度在約0.01%與約4%(w/v)之間。
20.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(b)導致所述培養物中的乙醇濃度在約0.01%與約4%之間、約0.02%與約3.75%之間、約0.04%與約3.5%之間、約0.08%與約3.25%之間、約0.1%與約3%之間、約0.2%與約2.75%之間、約0.3%與約2.5%之間、約0.4%與約2.25%之間、約0.5%與約1.5%之間、約0.5%與約2%之間、約0.6%與約1.75%之間、約0.7%與約1.5%或約0.8%與約1.25%之間。
21.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(b)導致所述培養物中的乙醇濃度為至少約 0.01%,0.02%,0.03%,0.04%,0.05%,0.06%,0.07%,0.08%,0.09%,0.10%,0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.6%、0.7%、0.8% 或 0.9%(w/v)。
22.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(b)導致所述培養物中的乙醇濃度為至多約 4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.8%、1.6%、1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.35%、0.3%、0.25%、0.2% 或 0.15%(w/v)。
23.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括將乙醇添加至所述培養物，將包含乙醇的載體添加至所述培養物，將所述細胞添加至培養基或包含乙醇的載體，或替換部分所述培養基。
24.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在I至20分鐘的時間段內將所述大劑量乙醇添加至所述培養基。
25.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(c)包括給所述細胞提供氧。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述提供氧包括攪拌所述培養物。
27.根據權利要求25或26所述的方法，其中所述提供氧包括將所述培養物與包含氧的氣體混合物接觸。
28.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(c)包括將含有碳源的進料添加至所述培養物。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述進料包含至少一種可發酵碳源。
30.根據權利要求28所述的方法`，其中所述進料包含葡萄糖、乙醇、檸檬酸鹽、山梨醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麥芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露醇和棉子糖的一種或多種。
31.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其進一步包括在步驟(c)期間將乙醇的濃度維持在上設置點與下設置點之間。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述下設置點為約0.01%,0.02%,0.03%,0.04%、0.05%,0.06%,0.07%,0.08%,0.09%,0.10%,0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.6%、0.7%、0.8% 或0.9% (w/V)。
33.根據權利要求31或32所述的方法，其中所述上設置點為約4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.8%、1.6%、1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.35%、0.3%、0.25%、0.2% 或 0.15%(w/v)。
34.根據權利要求31或32所述的方法，其中所述上設置點至多為約1.5%、1.4%、1.3、1.2% 或 1.l%(w/v)。
35.根據權利要求1至30中任一項所述的方法，其進一步包括在步驟(c)期間將乙醇濃度維持在設置點。
36.根據權利要求35所述的方法，其中所述設置點為約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、01.%、O 1.1%、01.2%、01.3%、01.4% 或 01.5%(w/v)。
37.根據權利要求1至30中任一項所述的方法，其中步驟(c)包括將所述培養物中的乙醇濃度維持在約0.01%與約4%之間、約0.02%與約3.75%之間、約0.04%與約3.5%之間、約0.08%與約3.25%之間、約0.1%與約3%之間、約0.2%與約2.75%之間、約0.3%與約，2.5%之間、約0.4%與約2.25%之間、約0.5%與約2%之間、約0.6%與約1.75%之間、約0.7%與約1.5%或約0.8%與約1.25%之間。
38.根據權利要求21至27中任一項所述的方法，其中所述培養物中的乙醇濃度通過控制由所述細胞進行的乙醇產生或通過將乙醇添加至所述培養物來維持。
39.根據權利要求28所述的方法，其中控制乙醇產生的步驟包括控制葡萄糖的濃度、氧的可用度、攪拌的強度、氣壓、供應的空氣或其它氣體混合物的流速、所述培養物粘度、培養物密度、所述供應的空氣或其它氣體混合物中氧的濃度以及溫度的一項或多項。
40.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(a)與步驟(b)之間的時間少于約72小時、少于約48小時、少于約24小時、少于約12小時、少于約9小時、少于約6小時、少于約5小時、少于約4小時、少于約3小時、少于約90分鐘、少于約30分鐘、少于約5分鐘或少于約I分鐘。
41.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(b)與步驟(c)之間的時間少于約10小時、少于約9小時、少于約8小時、少于約7小時、少于約6小時、少于約5小時、少于約4小時、少于約3小時、少于約2小時、少于約90分鐘、少于約80分鐘、少于約70分鐘、少于約60分鐘、少于約50分鐘、少于約40分鐘、少于約30分鐘、少于約20分鐘、少于約10分鐘、少于約5分鐘或少于約I分鐘。
42.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述步驟(a)的培養物通過向所述培養物添加碳源，以及培養所述培養物直至所述碳源被耗盡來產生。
43.根據權利要求42所述的方法，其中所述碳源包括以下的一種或多種:甘油、葡萄糖、乙醇、檸檬酸鹽、山 梨醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麥芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露醇和棉子糖。
44.根據權利要求42或43所述的方法，其中碳源的耗盡通過檢測所述真核細胞的代謝活動的減弱來測定。
45.根據權利要求44所述的方法，其中所述真核細胞的代謝活動的所述減弱通過檢測所述真核細胞對氧的消耗的減少，通過檢測培養物的PH的升高，通過檢測濕細胞團的穩定化，或通過檢測培養物中的氨濃度的增加來鑒定。
46.根據權利要求45所述的方法，其中所述真核細胞對氧的消耗的所述減少通過檢測所述培養物中溶解氧的濃度的增加來鑒定。
47.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述真核細胞包括酵母細胞。
48.根據權利要求47所述的方法，其中所述酵母細胞包括甲醇營養型酵母。
49.根據權利要求48所述的方法，其中所述甲醇營養型酵母屬于畢赤酵母屬。
50.根據權利要求49所述的方法，其中畢赤酵母屬的所述甲醇營養型酵母是巴斯德畢赤酵母。
51.根據權利要求49所述的方法，其中畢赤酵母屬的所述甲醇營養型酵母選自:安格斯畢赤酵母、季也蒙畢赤氏酵母、甲醇畢赤酵母和因諾托畢赤氏酵母。
52.根據權利要求49所述的方法，其中提供所述多亞基復合物的表達的基因被整合到一個或多個基因組基因座中。
53.根據權利要求49所述的方法，其中所述基因組基因座的至少一個選自pGAP基因座、3’ AOX TT 基因座、PpURA5、0CHl、A0Xl、HIS4、GAP、pGAP、3’ AOX TT、ARG 和 HIS4TT 基因座。
54.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在誘導型或組成型啟動子的控制下表達編碼所述多亞基復合物的所述亞基的基因中的至少一個。
55.根據權利要求54所述的方法，其中所述誘導型啟動子選自A0XUCUP1、四環素誘導型啟動子、硫胺酸誘導型啟動子以及FLDl啟動子。
56.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在選自以下的啟動子的控制下表達編碼所述多亞基復合物的所述亞基的基因中的至少一個:CUP1、A0X1、ICL1、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)、FLDU ADH1、醇脫氫酶I1、GAL4、PH03、PH05以及Pyk啟動子、四環素誘導型啟動子、硫胺素誘導型啟動子、來源于其的嵌合啟動子、酵母啟動子、哺乳動物啟動子、昆蟲啟動子、植物啟動子、爬行動物啟動子、兩棲動物啟動子、病毒啟動子和禽類啟動子。
57.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述真核細胞是二倍體、四倍體細胞或多倍體。
58.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其進一步包括從所述真核細胞或從所述培養基純化所述多亞基復合物。
59.根據權利要求58所述的方法，其中從所述真核細胞的細胞內組分、細胞質、核質或膜純化所述多亞基復合物。
60.根據權利要求58所 述的方法，其中所述真核細胞分泌所述多亞基復合物至所述培養基中。
61.根據權利要求60所述的方法，其中從所述培養基純化所述多亞基復合物。
62.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物包括單特異性或雙特異性抗體。
63.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物包括人抗體或人源化抗體或其片段。
64.根據權利要求63所述的方法，其中所述人源化抗體具有小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊或牛來源。
65.根據權利要求62所述的方法，其中所述人源化抗體具有兔來源。
66.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物包括單價、雙價或多價抗體。
67.根據權利要求4或權利要求61至66中任一項所述的方法，其中通過蛋白A和/或蛋白G親和從所述培養物純化所述抗體。
68.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中最優化基因的至少一個以在所述真核細胞中表達，所述基因在所述小組的所述真核細胞的至少一個中提供所述多亞基復合物的亞基的表達。
69.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物包含抗體并且所述抗體的純度通過測量由所述真核細胞產生的抗體的分數來評估，所述抗體包含在具有預期的表觀流體力學半徑的抗體復合物中，包含在具有預期的分子量的抗體復合物中，和/或特異性結合所述抗體的靶。
70.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物包含抗體并且所述抗體的產量通過測定扣除任何產物相關變體的由所述真核細胞產生的抗體的量來評估，所述變體被異常糖基化，包含在除具有預期的表觀流體力學半徑的復合物外的所述抗體復合物中，包含在具有預期的分子量的抗體復合物中，和/或不能特異性結合所述抗體的靶。
71.根據權利要求58或59所述的方法，其中所述抗體復合物的分子量通過非還原SDS-PAGE來測定。
72.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物包含抗體，所述方法還包括純化所述抗體。
73.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述培養細胞產生至少100mg/L、至少 150mg/L、至少 200mg/L、至少 250mg/L、至少 300mg/L、100 至 300mg/L、100 至 500mg/L、100 至 1000mg/L、至少 1000mg/L、至少 1250mg/L、至少 1500mg/L、至少約 1750mg/L、至少約2000mg/L、至少約10000mg/L或更多的上清液抗體滴度。
74.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物的一個或多個亞基從超過Iv基因拷貝表達。
75.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物包含抗體，所述抗體從1-10個拷貝的編碼所述抗體的輕鏈的基因和從1-10個拷貝的編碼所述抗體的重鏈的基因表達。
76.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中將提供所述多亞基復合物的表達的基因整合到所述細胞的基因組中。
77.根據權利要求1-75中任一項所述的方法，其中提供所述多亞基復合物的表達的基因包含在染色體外元件、質粒或人工染色體中。
78.根據權利要求7·6或77所述的方法，其中所述細胞包含比提供所述抗體的重鏈的表達的所述基因的拷貝更多的提供所述抗體的輕鏈的表達的所述基因的拷貝。
79.根據權利要求76或76所述的方法，其中所述細胞中編碼所述抗體的重鏈的所述基因的拷貝數和編碼所述抗體的輕鏈的所述基因的拷貝數各自是:2和2、2和3、3和3、3和4、3和5、4和3、4和4、4和5、4和6、5和4、5和5、5和6或5和7。
80.根據權利要求76或77所述的方法，其中所述細胞中的編碼所述抗體的重鏈的所述基因的拷貝數和編碼所述抗體的輕鏈的所述基因的拷貝數分別為:2和1、3和1、4和1、5和1、6和1、7和1、8和1、9和1、10和1、1和2、2和2、3和2、4和2、5和2、6和2、7和2、8 和 2、9 和 2、10 和 2、1 和 3、2 和 3、3 和 3、4 和 3、5 和 3、6 和 3、7 和 3、8 和 3、9 和 3、10和 3、1和4、2和4、3和4、4和4、5和4、6和4、7和4、8和4、9和4、10和4、1和5、2和 5、3和 5、4 和 5、5 和 5、6 和 5、7 和 5、8 和 5、9 和 5、10 和 5、1 和 6、2 和 6、3 和 6、4 和 6、5 和 6、6和6、7和6、8和6、9和6、10和6、1和7、2和7、3和7、4和7、5和7、6和7、7和7、8和7、9和7、10和7、I和8、2和8、3和8、4和8、5和8、6和8、7和8、8和8、9和8、10和8、I和9、2 和 9、3 和 9、4 和 9、5 和 9、6 和 9、7 和 9、8 和 9、9 和 9、10 和 9、1 和 10、2 和 10、3 和 10、4和 10、5 和 10、6 和 10、7 和 10、8 和 10、9 和 10,10 和 10。
81.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中使所述步驟(c)的培養物在生產培養基中生長。
82.根據權利要求81所述的方法，其中所述生產培養基是基本培養基。
83.根據權利要求81所述的方法，其中所述基本培養基不存在選擇劑。
84.根據權利要求81所述的方法，其中所述基本培養基不存在預形成的氨基酸或其它復合生物分子。
85.根據權利要求81所述的方法，其中所述生產培養基是復合培養基。
86.根據權利要求85所述的方法，其中所述復合培養基包含酵母提取物、大豆蛋白胨和其它植物蛋白胨的一種或多種。
87.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中使所述步驟(c)的培養物生長至高細胞密度。
88.根據權利要求87所述的方法，其中所述高細胞密度為至少50g/L。
89.根據權利要求87所述的方法，其中所述高細胞密度為至少100g/L。
90.根據權利要求87所述的方法，其中所述高細胞密度為至少300g/L。
91.根據權利要求87所述的方法，其中所述高細胞密度為至少400g/L。
92.根據權利要求87所述的方法，其中所述高細胞密度為至少500g/L。
93.根據權利要求87所述的方法，其中所述高細胞密度為至少750g/L。
94.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中將酵母細胞培養至少20個倍增，并且在至少20個倍增后維持所述多亞基復合物的高水平表達。
95.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中將所述步驟(c)的細胞培養至少50個倍增并且在所述至少50個倍增后維持所述多亞基復合物的高水平表達。`
96.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中將所述步驟(c)的細胞培養至少100個倍增并且在所述至少100個倍增后維持所述多亞基復合物的高水平表達。
97.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物的至少一個亞基包含分泌信號。
98.根據權利要求97所述的方法，其中所述多亞基復合物包含抗體。
99.根據權利要求97或98所述的方法或組合物，其中分泌信號包含一種或多種選自:SEQ ID NOS:414至437及其任何組合的多肽。
100.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物不是2010年12月I日提交的美國臨時申請號61/418，832、2011年12月I日提交的PCT/US11/62963、2011年12月I日提交的美國序列號13/309，295、2011年12月I日提交的美國序列號13/309，153,2011年12月I日提交的美國序列號13/308，665和2011年12月I日提交的美國序列號13/308,831中公開的抗體中的任一種。
101.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物不是Abl-NGF、Ab2-NGF、Ab3-NGF、Ab4_NGF、Ab5_NGF、Ab6_NGF、Ab7_NGF、Ab8_NGF、Ab9_NGF、Ab IO-NGF,Ab11-NGF, Abl2-NGF、Abl3_NGF、Abl4_NGF、Abl5_NGF、Abl6_NGF、Abl7_NGF、Abl8_NGF、Abl9-NGF、Ab20-NGF 和 Ab21-NGF 或 Fab2 或其 Fabl 片段。
102.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物不包含以下抗體的任一種中包含的互補性決定區(⑶幻的至少I個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少全部 6 個:Abl-NGF、Ab2_NGF、Ab3_NGF、Ab4_NGF、Ab5_NGF、Ab6_NGF、Ab7_NGF、Ab8-NGF、Ab9-NGF、Ab 10-NGF, Ab 11-NGF, Abl2_NGF、Ab 13-NGF, Abl4_NGF、Abl5_NGF、Abl6-NGF、Abl7-NGF、Abl8_NGF、Abl9_NGF、Ab20_NGF 或 Ab21_NGF，并且所述抗體任選地具有對于NGF的結合特異性。
103.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物不包含如下序列或不由所述序列組成:分別地SEQ ID NO:51和401的輕鏈和重鏈多肽序列、分別地SEQ IDNO: 53和402的輕鏈和重鏈多肽序列、分別地SEQ ID NO:405和406的輕鏈和重鏈多肽序列和分別地SEQ ID NO:407和408的輕鏈和重鏈多肽序列。
104.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物不包含抗體，所述抗體含有SEQ ID NO:55、56、57、58、59和60的CDR的至少I個、至少2個、至少3個、至少4個、至少4個、至少5個或至少全部6個的抗體，并且任選地具有對于NGF的結合特異性。
105.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多亞基復合物不包含本文中在標題為“抗-NGF抗體及其具有 對于NGF的結合活性的結合片段”和“編碼抗-NGF抗體多肽的多核苷酸”的部分中公開的抗體或抗體編碼序列的任一種。
【文檔編號】C12N1/19GK103827290SQ201280035868
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年5月8日 優先權日:2011年5月20日
【發明者】P·D·麥克尼爾, N·詹森, G·L·萊斯尼基, P·齊, J·A·萊瑟姆, L·F·加西亞-馬丁內斯 申請人:奧爾德生物控股有限責任公司