專利名稱：一種用于軟骨損傷修復的改良脂肪干細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及用基因技術改造干細胞以提高它的性能及分泌蛋白的表達，并且這種改良后的細胞可以應用于軟骨損傷的修復。
背景技術：
軟骨損傷是比較難以治愈的病變，尤其是淺層性的軟骨損傷。多種原因可以造成軟骨損傷，如外力沖擊、自生免疫性疾病如類風濕性關節炎、老齡化導致的機體退化等。軟骨的自我修復能力很弱，即使是很小的軟骨缺損也很難愈合。因軟骨組織內無血液供應，軟骨內基質合成活躍度低。但如果傷口深到軟骨下骨層，傷口反而有自我愈合的能力，這是因為軟骨下骨內的血液滲透出來形成的血塊附帶有干細胞，其有可能被激活以促進傷口的愈合。在臨床治療中，可通過鉆孔至軟骨下層導致出血或微骨折的方式來治療軟骨缺損。干細胞是一類具有自我復制與更新能力的多潛能細胞，在一定條件下，可以分化成多種功能細胞。干細胞獨特的性質使其成為再生醫學和疾病治療的研究熱點，理論上干細胞療法可以治療包括軟骨損傷的組織器官損傷疾病。據美國官方的某個臨床試驗登記網站顯示，與軟骨修復相關的干細胞治療臨床試驗就有上百個。在科研界，針對干細胞應用于軟骨損傷的治療效果也有不少樂觀的報道。脂肪組織中含有一種具有間充質干細胞特性的細胞群體，被稱作脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ASC),這種細胞具有自我更新和分化能力。大量的文獻證實了 ASCs不僅能分化成間充質細胞如脂肪、軟骨、成骨、肌肉，還能分化成神經、血管來源的細胞。過去10年，脂肪干細胞在器官組織損傷的修復應用中逐漸受到重視。自體脂肪干細胞的使用相比其它來源的間充質干細胞有較好的安全性，因其來源于自體組織，不會出現排異反應，是理想的移植物。雖然針對于干細胞用于軟骨損傷修復的研究報道較多，但無論是動物試驗還是臨床研究，其治療效果差異很大。可能原因是脂肪干細胞的活性差異所致，治療前的處理方法、來源部位以及伴隨干細胞注射的生長因子的不同均會造成脂肪干細胞的活性差異。很多關于間充質干細胞在組織修復及填充的臨床試驗表明，干細胞主要通過兩種方式發揮作用:1.分化成目標組織的細胞以替代損傷組織；2.分泌各種生長因子來促進受損部位的修復，包括促進附近干細胞的激活和轉化，這個作用方式有時候發揮的作用更大。有研究表明，某些生長因子即使單獨使用也有促進軟骨自我修復的功能。然而一般情況下，大部分干細胞移植到損傷部位后存活的時間只有1-2周，這表明干細胞發揮作用的時間是比較短的。如果在這段時間內組織的損傷沒有修復，干細胞的治療效果就不能達到。針對這種短效作用的特點，目前臨床試 驗上一般采用多次干細胞治療的方式或同時添加生長因子來提高干細胞的治療效果。雖然這些生長因子可以通過注射的方式使用，但是它們的半衰期很短，需要一次性注射量很大或需反復注射來達到理想的作用濃度，這給臨床治療造成不便。考慮讓細胞作為載體使其長期穩定表達這些生長因子的方式是比較理想的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種用于軟骨損傷修復的改良脂肪干細胞。為了能滿足臨床治療中軟骨修復的要求，脂肪干細胞要具備穩定的活性，并能針對性的促進有軟骨修復能力的生長因子和營養因子的分泌。基于大量的相關研究，我們選擇讓細胞表達TGF-0 3或BMP4。TGF-β 3屬于TGF-β家族，不但能誘導脂肪干細胞成軟骨分化，還能提高生長速度。臨床研究也表明TGF-β 3在促進軟骨修復過程中有更多的膠原II和蛋白聚糖產生，作為歸巢效應的誘導因子，TGF-β 3還可以促進鄰近的細胞向傷處遷移，同時TGF- β 3本身也可以激活損傷部位附近的間充質干細胞。ΒΜΡ4屬于BMP家族蛋白，同時也屬于TGF-β多肽家族，它具有促進脂肪干細胞成軟骨分化的功能。研究表明，在脂肪干細胞成軟骨分化過程中，ΒΜΡ4具有促進細胞成團并使之具有軟骨細胞形態的作用。此外ΒΜΡ4還可以促進軟骨蛋白形成，實現較快的透明狀軟骨修復。為實現上述目的，通過病毒載體轉導的方式改良脂肪干細胞。逆轉錄病毒的制備方法為:1)ΒΜΡ-4的逆轉錄病毒載體的構建:人ΒΜΡ-4的cDNA通過PCR從相應的噬菌體克隆擴增出來，ΒΜΡ4-1 (CCGCTCGAGGCGGCCGCCCACCATGCTGATGGTCGTTTTATTATG)和 BMP4-2 (TCCATCGATAGATCTATCCTCAAGGACTGCCTG)引物被用來擴增表達BMP4的構架，cDNA克 隆到pBluescript II KS后，通過測序cDNA雙鏈的方法來驗證克隆序列；2)表達TGF-P3的逆轉錄病毒載體的構建:將TGF-P3cDNA從plasmidpTGF- β 3 (GenBank:ΝΜ_009368, ATCC, Manassas, VA)中擴出，克隆到 pBluescript IIKS，通過測序cDNA雙鏈的方法來驗證克隆序列；3)這些載體通過共轉染到包裝細胞GP-293 (CLONTECH, California, USA)的方式被轉換成復制缺陷型逆轉錄病毒，pVSVG表達血管炎病毒糖蛋白，用作病毒包膜。病毒載體的滴度是5XIO5—2XIO6的CFUs/ml。改良后的脂肪干細胞能選擇性的表達TGF-β 3或ΒΜΡ-4生長因子。 表達TGF- β 3或ΒΜΡ-4的脂肪干細胞可以單獨使用，也可混合使用。改良后的脂肪干細胞與軟骨細胞共同培養，比例是2: I。改良的脂肪干細胞和軟骨細胞共培養在成軟骨誘導培養基中向軟骨細胞分化的能力比普通的脂肪干細胞高，產生更多的II型膠原，形成的軟骨球更大更致密，同時，移植的干細胞可以在體內存活周期延長達10周，延長了生長因子和營養因子對損傷部位的修復作用，促進軟骨的生長和傷口的較快愈合。
圖1:脂肪干細胞與軟骨細胞共培養形成的軟骨塊，脂肪干細胞和軟骨細胞在成軟骨誘導培養基中共培養4周后，進行的切片經過阿爾新藍染色，結果表明轉導后的脂肪干細胞促進形成的軟骨塊更致密光滑。A)，C):普通脂肪干細胞和軟骨細胞共培養形成的軟骨快，A)放大培數100X，B)放大倍數400。B)，D):BMP+TGF-^3脂肪干細胞和軟骨細胞共同培養形成的軟骨塊，C)放大培數100X，D)放大倍數400。圖2:脂肪干細胞在轉導后能持續的顯著表達BMP-4和TGF-β 3，轉導后脂肪干細胞的培養基中ΒΜΡ-4蛋白水平通過Western Blot方法來估計，TGF-β 3由相應的ELISA試劑盒檢驗(R&D System, Inc., Minneapolis, Minnesota, USA), 一周后，BMP-4 的分泌濃度達到每24小時產生120ng/106細胞，之后繼續保持這個水平范圍。TGF-β 3的濃度達到每24小時產生220ng/106細胞。圖3:轉導后的脂肪干細胞和軟骨細胞共培養產生的II型膠原有顯著增加，4周后，通過qPCR的方法來檢測II型膠原的mRNA表達，為了便于在不同樣本間進行比較，我們采用mRNA相對于GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的相對表達量，在共培養的條件下,II型膠原表達的更多。圖4:轉導后的脂肪干細胞和軟骨共培養能促進糖胺聚糖(Glycosaminoglycans)的產生，培養基質的切片去石蠟化后用含1，9_氯化二甲基亞甲基藍(DMMB)的PBE溶液染色，然后用分光光度測定GAG的含量，經過矯正，在軟骨數目相同情況下，與轉導后的脂肪干細胞共同培養條件下產生的GAG比與普通脂肪干細胞共同培養高出2-3倍，GAG的含量增加表明了基質含量的增強。
具體實施例方式為詳細說明本發明的技術內容，所實現目的及效果，以下結合實施方式并配合附圖詳予說明。應理解，這些實施僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明的授權之后，本領域技術人員可以對本發明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。1.人脂肪干細胞的分離和培養I)在軟骨取樣前10天左右，從患者大腿或腹部提取大約20ml脂肪，進行脂肪間質血管部分細胞分離和培養傳代:無菌條件下取脂肪組織，小心去除附著的纖維和血管，用滅菌的PBS充分洗脫以去除雜質和血細胞[I]。I型膠原蛋白酶(lmg/mL)消化(放入37°C震顫水浴槽中60min)，產物通過100 μ m的尼龍篩過濾去除雜質，470 X g離心5min，去除漂浮的脂肪細胞及上清液，DMEM培養液(DMEM，Invitrogen ;含10%胎牛血清、0.2mM抗壞血酸，1001^*1111-1青霉素和1001^*1111-1鏈霉素)重懸細胞，470X g離心5min。去除上清液，重懸沉淀細胞，在37°C、5% C02培養箱中孵育。24小時后，用顯微鏡觀察，沒貼壁的細胞用PBS 洗去，培養液換成 Keratinocyte-SFM (Invitrogen,含 0.2mM 抗壞血酸,0.09mM I丐，5ng/mLrEGF, and5% FBS)。細胞生長至75 % 90 %融合時傳代，每2 3d更換培養液。2)脂肪干細胞培養2周后，進行逆轉錄病毒轉導。2.軟骨細胞的分離培養I)在征得風濕性關節炎患者同意后，活檢期間，通過關節鏡手術，從非負重區取一塊所需量軟骨組織，例如膝關節股骨髁間窩。為了得到純度高的軟骨細胞，沒有其它類型細胞的污染，在距離滑膜5mm遠的地方取一小塊軟骨，重IOOmg左右，大約米粒大小。2)用精細剪刀將其剪成lmm3的小塊，用PBS沖洗后置于II型膠原酶(0.15% )中，370C條件下消化20-22小時。用軟骨細胞增殖培養基配置膠原酶溶液。該培養基成分是 Dulbecco’ s Modified Eagle Medium(DMEM),并添加 10% FBS, I %非必需氨基酸,0.2mM抗壞血酸-2-磷酸(AsAP), 0.4mM脯氨酸，100U/mL青霉素，100mg/mL鏈霉素。3)將軟骨細胞收集起來，計數，不需要進行平板細胞培養，直接混合準備好的脂肪干細胞共同培養。3.逆轉錄病毒制備
1)ΒΜΡ-4的逆轉錄病毒載體的構建:人BMP-4的cDNA通過PCR從相應的噬菌體克隆擴增出來，BMP4-1 (CCGCTCGAGGCGGCCGCCCACCATGCTGATGGTCGTTTTATTATG)和 BMP4-2 (TCCATCGATAGATCTATCCTCAAGGACTGCCTG)引物被用來擴增表達BMP4的構架。cDNA克隆到pBluescript II KS后，通過測序cDNA雙鏈的方法來驗證克隆序列。2)表達TGF- β 3的逆轉錄病毒載體的構建:將TGF- β 3cDNA從plasmidpTGF- β 3 (GenBank:NM_009368, ATCC, Manassas, VA)中擴出，克隆到 pBluescript II KS,通過測序cDNA雙鏈的方法來驗證克隆序列。3)這些載體通過共轉染到包裝細胞GP-293 (CLONTECH，California, USA)的方式被轉換成復制缺陷型逆轉錄病毒。PVSVG表達血管炎病毒糖蛋白，用作病毒包膜。病毒載體的滴度，估計是5 X105—2 XIO6的CFUs/ml。4.逆轉錄病毒轉導脂肪干細胞I)將脂肪干細胞接種于IOcm細胞培養皿，5X106cell/皿(總共IOml完全培養基)，置于37°C、5% CO2培養箱內培養。24h待細胞密度達70% -80%時即可用于轉導。2)這些細胞分別用逆轉錄病毒轉導。在MOI為5，聚凝胺(polybrene)為8微克
/毫升。2周培養后使用。 5.轉導后的脂肪干細胞和軟骨細胞共培養將軟骨細胞和未感染或感染后的脂肪干細胞進行共同培養，以觀察干細胞性能的增強對軟骨形成的影響。表達BMP-4和TGF-0 3的脂肪干細胞以1:1比例混合。在共培養體系中，脂肪干細胞和軟骨細胞的比例是2: I。將細胞混合后，500g離心5分鐘，形成一個扁平的塊狀物。在成軟骨誘導培養基中進行培養。在相應的時間段取樣進行分析。
權利要求
1.一種用于軟骨損傷修復的改良脂肪干細胞，其特征在于，通過病毒載體轉導的方式改良脂肪干細胞。
2.根據權利要求1所述的病毒載體轉導方式，其逆轉錄病毒制備方法為: DBMP-4的逆轉錄病毒載體的構建:人BMP-4的cDNA通過PCR從相應的噬菌體克隆擴增出來，BMP4-1(CCGCTCGAGGCGGCCGCCCACCATGCTGATGGTCGTTTTATTATG)和BMP4-2 (TCCATCGATAGATCTATCCTC AAGGACTGCCTG)引物被用來擴增表達 BMP4 的構架，cDNA克隆到pBluescript II KS后,通過測序cDNA雙鏈的方法來驗證克隆序列； 2)表達TGF-β3的逆轉錄病毒載體的構建:將TGF-β 3 cDNA從plasmidpTGF-β 3 (GenBank:NM_009368, ATCC, Manassas, VA)中擴出，克隆到 pBluescript II KS,通過測序cDNA雙鏈的方法來驗證克隆序列；3)這些載體通過共轉染到包裝細胞GP-293(CLONTECH，California, USA)的方式被轉換成復制缺陷型逆轉錄病毒，PVSVG表達血管炎病毒糖蛋白，用作病毒包膜。病毒載體的滴度是5 XIO5—2 XIO6 的 CFUs/ml。
3.根據權利要求1所述的脂肪干細胞，其特征在于，改良后的脂肪干細胞能選擇性的表達TGF- β 3或ΒΜΡ-4生長因子。
4.根據權利要求3所述的脂肪干細胞，其特征在于，表達TGF-4或ΒΜΡ-7的脂肪干細胞可以單獨使用，也可混合使用。
5.根據權利要求1所述的脂肪干細胞，其特征在于，改良后的脂肪干細胞與軟骨細胞共同培養，比例是2: I。
6.根據權利要求4或5所述的脂肪干細胞，其特征在于，改良的脂肪干細胞和軟骨細胞共培養在成軟骨誘導培養基中向軟骨細胞分化的能力比普通的脂肪干細胞高，產生更多的II型膠原，形成的軟骨球更大更致密，同時，移植的干細胞可以在體內存活周期延長達10周，延長了生長因子和營養因子對損傷部位的修復作用，促進軟骨的生長和傷口的較快愈合。
全文摘要
本發明通過基因轉導技術誘導脂肪干細胞表達骨形態發生蛋白(BMP-4)或轉化生長因子(TGF-β3)，這種性能增強的干細胞具有很好的增殖能力和軟骨修復能力，是一種很好的用于軟骨損傷修復的工具。考慮到BMP-4和TGF-β3對干細胞的調節和營養作用，本發明通過病毒載體轉導的方法讓干細胞充分的表達這些營養因子，這些改良的脂肪干細胞和軟骨細胞共培養在成軟骨誘導培養基中向軟骨細胞分化的能力比普通的脂肪干細胞高，產生更多的II型膠原，形成的軟骨球更大更致密，同時，移植的干細胞在體內存活周期延長，延長了生長因子和營養因子對損傷部位的修復作用，促進軟骨的生長和傷口的較快愈合。
文檔編號C12N15/867GK103087992SQ20131001596
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月15日 優先權日2013年1月15日
發明者付擎昊, 康賢通, 章戴榮 申請人:廣州萊德爾生物科技有限公司