專利名稱：一種定點突變改造的基因工程腈水解酶的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，涉及一種定點突變方法制備具有改善的腈水解酶活性及降低的酰胺生成能力的基因工程真菌腈水解酶。其關鍵是真菌腈水解酶的定點改造、克隆、表達及產物的發酵表達及分離純化制備，以及定點突變的基因工程菌在煙酸合成中的應用。
背景技術：
自1964年哈佛大學學者Thimann等人首次在大麥葉中發現并分離到了一種植物蛋白，也就是所說的腈水解酶。它能有效地水解吲哚乙腈合成生長激素吲哚乙酸(Thimann等，Arch Biochem Biophys 1964, 105 (I): 133-141 )。至今為止已發現來源于細菌、絲狀真菌、酵母及植物體中的腈水解酶產生機體上百種，他們能將苯甲腈、丙烯腈、乙腈、甘氨腈等腈類化合物轉化為相應的有機酸及氨基酸，并且能應用于腈污染廢水的生物除污以及紡織工業中聚合材料的表面修飾。其中一些高效的腈水解酶應用于工業規模的羧酸生產中也已經取得了良好效果，如廣州龍沙的煙酸工業生產工藝及三菱化工的扁桃酸生產工藝都是非常成功的案例，這也充分體現了腈水解酶的應用潛力。相關的研究與開發使得腈水解酶在制藥、食品、化工、環保等領域具有廣闊的應用前景。煙酸是維生素B3的前體，作為維生素類藥物，可用于防治糙皮病等煙酸缺乏癥；可用作血管擴張藥，治療高脂血癥；也可用于治療頭痛、肺栓賽、凍傷等病癥；作為醫藥中間體，煙酸可用于異煙肼、煙酰胺、煙酸肌醇酯等的生產；另外，煙酸的一個重要用途是可用做飼料添加劑。因此，目前市場需求量非常大。煙酸生產的傳統工藝主要采用氨氧化法、氣相氧化法及喹啶羥基化法等化學方法來進行生產(CN201210089804.4)。但是這些方法需要采用昂貴的催化劑進行反應，使用強酸堿使設備腐蝕嚴重，而且產率較低，使得產品的分離純化難度加大，此外生產工藝過程對環境存在比較嚴重的污染(CN101550432)。
采用綠色環保的生物催化工藝進行煙酸生產在近年來受到了極大的關注。生物催化法反應條件溫和、催化劑特異性高、選擇性強、能耗少、催化劑制作成本低廉、工藝環境友好。這是化學生產工藝所無法比擬的。自上世紀80年代后期以來，全球已有多家機構開展了腈水解酶催化法制備煙酸工藝的研究。至今已有來自不同單位的學者分別采用細菌歸屬的玫瑰紅球菌rhodochrous Jl (Mathew 等，Appl Environ Microbiol 1988, 54 (4):1030-1032),蒼白芽抱桿菌 ifeciJJiAs pallidus (Almatawah 等，Enzyme Microb Technoll999, 25(8-9): 718-724),小球諾卡氏菌 Abcart/ia globerula (Sharma 等，Process Biochem2006,41 (9): 2078-2081),以及紅球菌 TPAot/ococci/s sp.NDB 1165 (Prasad 等，World JMicrobiol Biotechnol2007, 23 (3):345-353)產生的腈水解酶作為催化劑生物轉化3-氰基吡啶制備得到煙酸。而進入21世紀以來，來自捷克的學者研究發現真菌腈水解酶在比酶活、選擇性方面特征具有更明顯的優勢，表現出比細菌腈水解酶更大的催化潛力(Vejvoda等，Process Biochem 2010, 45 (7): 1115-1120),他們以爺病鍵刀菌solaniOl和黑曲霉菌As/76 r^777w5.niger KlO為研究目標,將其應用于3-, 4-氰基卩比唳制備煙酸和異煙酸的生物轉化中，取得了良好的效果(Martinkovdi等，Biotechnol Adv 2009, 27(6):661-670)。但是這兩株菌所產生的真菌腈水解酶均存在微弱的腈水合酶活性，轉化過程中在生成羧酸的同時會產生一定量的酰胺類化合物。而且研究表明這一副反應幾乎存在于所有真菌腈水解酶的生物轉化反應中。定點突變技術近年來在酶的基因工程改造中應用日益廣泛，在提高酶活性、改善酶的催化特征等方面取得了非常有益的效果。但是該技術在腈水解酶的改造中還應用較少，尤其對于真菌腈水解酶，鮮有定點突變改造的文獻報道，而在國內，尚未見任何關于基因工程改造真菌腈水解酶的文獻或專利報道。因此，定點突變改造真菌腈水解酶的研究具有極佳的理論和應用價值。
發明內容
本發明總的目的是通過定點突變的方法對真菌腈水解酶基因進行改造，使改造后的基因工程腈水解酶在酶活性方面有所提高，在酰胺生成能力方面有所減弱；進一步，使定點突變改造后的腈水解酶得到高效表達，最終能達到工業化生產的要求。本發明的首要目的是對赤霉菌{GibberellaCA3-1 (該菌株為赤霉菌{Gibberella intermedia) CA3-1,保藏在位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.4903，保藏日期為2011年5月24日。)提供一種定點突變改造的基因工程腈水解酶，所述的基因工程腈水解酶具有更好的酶活性和更低的酰胺生成能力。本發明提供了一種定點突變改造的基因工程腈水解酶，所述的基因工程腈水解酶的成熟蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0.1，該成熟蛋白是由SEQ ID N0.2的核苷酸序列所編碼的。本發明所述的一種定點突變改造的基因工程腈水解酶，它是由氨基酸序列為SEQID N0.3的來源于赤霉菌的真菌腈水解酶中制造氨基酸取代而產生的，其特征在于所述的基因工程腈水解酶氨基酸序列相對于未突變的天然真菌腈水解酶氨基酸序列的第144位谷氨酸Glu突變為缺失。本發明所述的氨基酸取代產生氨基酸序列為SEQ ID N0.3的真菌腈水解酶。本發明同時提供了一種改善氨基酸序列為SEQ ID N0.1的基因工程腈水解酶的酶活性的方法，該方法是通過在SEQ ID N0.3的氨基酸序列第144位Glu敲除以改變來源于赤霉菌的天然真菌腈水解酶的氨基酸序列。本發明同時提供了一種降低氨基酸序列為SEQ ID N0.1的基因工程腈水解酶的酰胺生成能力的方法，該方法是通過在SEQ ID N0.3的氨基酸序列第144位Glu敲除以改變來源于赤霉菌的天然真菌腈水解酶的氨基酸序列。本發明還提供了一種DNA分子，其編碼如前所述的基因工程腈水解酶。本發明還提供了一種重組質粒，`其含有如前所述的DNA分子。本發明還提供了一種宿主細胞，其含有如前所述的DNA分子，或含有如前所述的重組質粒。將定點突變獲得的基因工程腈水解酶重組質粒轉入大腸桿菌疋coliRosetta-gami (DE3)宿主中，實現高效表達。本發明所述的具有生物活性的基因工程腈水解酶可以通過IPTG誘導的方式大量產生獲得。通過親和層析方法，對定點突變的基因工程腈水解酶進行了分離純化，得到了高活性的基因工程腈水解酶。結果表明，以3-氰基吡啶為底物，定點突變的基因工程腈水解酶較未突變的天然腈水解酶比酶活提高了 80%以上，比酶活達到5.1 U/mg ;酰胺生成量降低了 30%，僅為 1.75%。本發明還提供了一種基因工程腈水解酶用于煙酸合成的方法，該方法包括:在適合的條件下收集如前所述的基因工具腈水解酶產生的宿主細胞，添加底物3-氰基吡啶在一定溫度下進行生物轉化反應。本發明所提供的基因工程腈水解酶具有更高的催化活力和更低的酰胺生成能力，具備一定的工業應用潛力，為真菌腈水解酶在煙酸合成中的大規模、低成本應用奠定了基礎。本發明的優點和有益效果:
通過定點突變，對真菌腈水解酶的氨基酸序列第144位Glu進行了敲除，構建了一種基因工程腈水解酶，大大提高了真菌腈水解酶的催化活力，并且使真菌腈水解酶的酰胺生成能力顯著降低，減少了轉化過程中的酰胺生成量。目前，這是國內對真菌腈水解酶進行定點改造的首次研究報道。
具體實施例方式實施例1
本發明以赤霉菌來源的真 菌腈水解酶基因序列為參考，設計并合成兩條寡聚核苷酸引物，采用未突變的重組質粒，通過反向PCR的方法擴增突變質粒。兩條寡聚核苷酸引物如下:
Forward primer:TACGGTGACGGACAGGGCTCTCTGAReverse primer:ATTGGTCAGAGAGCCCTGTCCGTCACPCR反應體系為:__
Pfuenzyme0.5 μ L
IOXbuffer5 μ L
TemplateDNAIuL
ddH2Q■ 38.5 μ L
dNTP~3μ L Forwardprimer IuL Reverseprimer IuL Total 50 μ L
PCR程序條件設定為:94°C預變性4 min;94°C變性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸8
min，35個循環；72°C終延伸60 min。對擴增獲得的PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，采用DNA膠回收試劑盒對目的片段進行割膠回收。實施例2
割膠回收獲得的PCR產物采用/I限制性內切酶進行酶切消化，酶切條件:37°C溫浴0.5 h。酶切反應體系如下
權利要求
1.一種定點突變改造的基因工程腈水解酶，所述的基因工程腈水解酶的成熟蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0.1 ο
2.權利要求1所述的基因工程腈水解酶的生產方法，其特征在于:它是由氨基酸序列為SEQ ID N0.3的來源于赤霉菌的真菌腈水解酶中制造氨基酸取代而產生的，所述的基因工程腈水解酶氨基酸序列相對于未突變的天然真菌腈水解酶氨基酸序列的第144位谷氨酸Glu突變為缺失。
3.一種改善權利要求1所述的基因工程腈水解酶的酶活性的方法，該方法是通過在SEQ ID N0.3的氨基酸序列第144位Glu敲除以改變來源于赤霉菌的天然真菌腈水解酶的氨基酸序列。
4.一種降低權利要求1所述的基因工程腈水解酶的酰胺生成能力的方法，該方法是通過在SEQ ID N0.3的氨基酸序列第144位Glu敲除以改變來源于赤霉菌的天然真菌腈水解酶的氨基酸序列。
5.一種DNA分子，其編碼如權利要求1所述的基因工程腈水解酶。
6.根據權利要求5所述的DNA分子，其特征在于:其核苷酸序列為SEQID N0.2。
7.—種重組質粒，其特征在于:其含有權利要求6所述的核苷酸序列。
8.一種宿主細胞，其特征在于:其含有權利要求6所述的核苷酸序列，或者含有權利要求7所述的重組質粒。
9.一種基因工程腈水解酶用于煙酸合成的方法，其特征在于，該方法包括:在適合的條件下收集如前所述的基因工具腈水解酶產生的宿主細胞，添加底物3-氰基吡啶在一定溫度下進行生物轉化反應 。
全文摘要
本發明涉及通過基因工程改造得到的真菌腈水解酶。本發明所述的一種定點突變改造的基因工程腈水解酶，其特征在于所述定點突變的基因工程腈水解酶氨基酸序列相對于天然的真菌腈水解酶氨基酸序列的第144位Glu被敲除。本發明還公開了所述的基因工程腈水解酶的生產方法及其在煙酸合成中的應用。本發明所述的基因工程腈水解酶在催化活力方面更加優良，副產物酰胺的生成能力明顯降低，為其在煙酸合成中的大規模、低成本的工業應用奠定了基礎。
文檔編號C12P17/12GK103184210SQ201310069190
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者龔勁松, 熊雷, 許正宏, 史勁松, 李恒, 孫文敬, 周強 申請人:江南大學, 江西省德興市百勤異Vc鈉有限公司