專利名稱：一種利用地衣芽孢桿菌制取飼料添加劑的方法
技術領域：
本發明涉及飼用飼料添加劑領域，具體涉及利用地衣芽孢桿菌制備飼料添加劑的方法。
背景技術：
養殖戶在養殖家禽家畜時為了達到預防疾病的目的，往往在飼料中添加大量抗生素，其結果是不可避免的造成抗生素濫用，在動物體內產生藥物殘留，最終通過食物鏈在人類身體中蓄積，嚴重威脅人類健康。研究表明地衣芽孢桿菌均是一類益生菌，用其制成的制劑添加到飼料中可起到如下作用:①芽孢桿菌為一種需氧有益菌，其在不利環境中能形成孢子，耐高溫、耐酸堿和溫度變化，進入腸道后能迅速復活；且能通過與致病菌爭奪有限的營養物質，迅速消耗環境中有限氧氣，有利于維持腸內菌群平衡起著重要作用，從而抑制腸道致病菌生長，達到預防治療畜禽腸道疾病的作用芽孢桿菌能產生多種消化酶，幫助動物對營養物質的消化吸收，從而促進消化和提高飼料利用率，降低飼養成本；③芽孢桿菌能促進動物腸道相關淋巴組織處于高度的“免疫準備狀態”，同時使免疫器官發育加快，免疫系統成熟快而早，T、B淋巴細胞數量增多，動物體液和細胞免疫水平提高芽孢桿菌在動物腸道內生長繁殖，能產生多種營養物質如維生素、氨基酸、有機酸、促生長因子等，參與動物機體新陳代謝，為機體提供營養物質。由于芽孢桿菌制劑具有上述重要優良特征，因此吸引了眾多國內外學者對其進行深入研究，研究內容主要集中于:芽孢桿菌的篩選(楊曉斌，謝擁葵，韋燕鵬等，益生菌納豆芽孢桿菌的篩選，廣州食品工業科技，2003年增刊)、制備纖溶酶(余功保，郭愛玲，秦巧玲等，一株高產納豆激酶菌株的篩選及其發酵條件的優化，食品科學，2007年第4期)、液體深層發酵工藝(朱健輝，杜連祥，路福平，納豆激酶液態發酵工藝優化，食品與發酵工業，2005年第8期)、粉劑制備工藝(鐘青萍，王發祥，劉家暢，納豆菌活菌干燥制劑的研制，食品工業科技，2005年第8期)等方面，而具體的固體發酵工藝未見報道。固體發酵法相比液體發酵最大的優點就是生產成本低、原材料簡單、產品產酶活性高、產品的耐高溫、耐酸堿、耐擠壓等耐受能力強。但是固體發酵技術難度大，不容易生產出高質量的芽孢桿菌制劑。目前的芽孢桿菌制劑的生產工藝和發酵培養基配方所生產的制劑活菌含量不高，制劑有效期短，使得產品難以達到理想的疾病預防和生長促進效果。
發明內容
本發明的內容在于，針對現有技術不足，提供一種利用地衣芽孢桿菌制備飼料添加劑的固體發酵培養方法，該方法制得的飼料添加劑活菌含量高，雜菌率低，芽胞活性強，穩定性強,生產成本不高。本發明采用的技術方案是，一種利用地衣芽孢桿菌制取飼料添加劑的方法，其特征在于包括如下步驟:
(I)囷種制備與活化 把購得的地衣芽孢桿菌的菌種制成懸浮液，加入無菌水稀釋到濃度為10_8時，在固體平板培養基上對其進行涂布分離或劃線分離，挑取部分單菌落進行生產能力的測定；經反復篩選，確定出經發酵產生的芽孢活性強、活菌數高的菌株代替原來的菌株。(2)斜面菌種制作
按配方要求配置斜面培養基，斜面培養基的各組份重量份為:牛肉膏5 g，蛋白胨10g，NaCl 5 g，瓊脂粉20-25 g，加水定容至1000 mL ；pH控制在7.2-7.4 ；
將斜面培養基加熱使各組分充分溶解，調好PH，然后分裝于若干支試管中，密封試管；將試管于121°C滅菌30 min,取出擺斜面，冷卻后備用；
將上述斜面培養基置于干燥箱或培養箱中放置24-48h接入步驟(I)中制備的菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為試管中混合物總重量的1%，在37°C條件下培養24h，制成斜面菌種。(3)三角瓶液體菌種制作
按配方要求配置液體培養基，液體培養基的各組份重量份為:蛋白胨2 g、牛肉膏3 g、酵母膏2 g、硫酸猛0.2 g、磷酸二氫鉀0.4 g、磷酸氫二鉀0.5 g、鹿糖20 g,加水定容至IOOOmL ;pH控制在7.0-7.2 ;分裝于若干個500mL的三角瓶中，每支三角瓶裝量為220mL ;密封后在121°C溫度下滅菌30min，冷卻后備用；
在無菌條件下，每個三角瓶中的液體培養基接入步驟(2)制得的斜面菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為三角瓶中混合物總重量的10%，對三角瓶進行搖床培養，溫度控制在37°C，轉速為180-200 r/min ;搖床培養24h后制得三角瓶液體菌種，備用。(4)罐頭瓶固體發酵
按配方要求配置固體發酵培養基，固體發酵培養基的各組份重量份為:紅糖0.5%、石灰0.5 %，無菌水45%，其余為麩皮；
將固體發酵培養基混和均勻后分裝入若干罐頭瓶中，瓶口用報紙蓋住，用線系緊；在121°C的溫度下對上述罐頭瓶滅菌60 min ;冷卻后，接入步驟(3)制取的液體菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為混合物總重量的5% ;放入37°C的培養間中培養60 h，當芽孢形成率達到90%以上發酵結束，出料后制得成品。進一步，所述步驟(2 )中的密封是指在試管上蓋上棉塞，將棉塞和試管口部分包上報紙，用線系緊。進一步，在步驟(I)中每支試管中斜面培養基的裝量為試管總容量的1/3-1/2。進一步，在步驟(4)中還包括將制得的成品進一步在發酵瓷盤中發酵的步驟，發酵溫度控制在37°C，培養時間為60 h。所述發酵瓷盤為普通的瓷盤，在發酵瓷盤進一步發酵，起到擴大培養的作用，可以提高產量。本發明的有益效果是:主要利用麩皮這種廉價的介質作為主要培養底物，有效降低了生產成本。國內許多學者對地衣芽孢桿菌的發酵條件進行研究，但所用培養基為實驗室常用的葡萄糖、酵母浸膏、尿素等，工業生產成本很高。采用固體發酵方法，固體發酵具有節水、節能的獨特優勢，生產成本低，耐高溫、耐酸堿、耐擠壓，飼料加工過程中受損小，添加量小、飼喂效果更明顯，屬于清潔生產技術，具有大規模操作的潛能。采用罐頭瓶這種價格低廉的發酵容器，設備投資低。由于各個罐頭瓶的發酵空間相互獨立，便于進行底物特性檢測，便于檢驗發酵效果，便于試驗和控制發酵參數，便于運用單因素和多因素正交試驗對地衣芽孢桿菌的發酵條件進行優化，從而得到最佳溫度和PH，便于分析接種量對發酵周期的影響；可以靈活的制定避免染菌的對策，便于對水活度、通風與傳質、傳熱及PH等進行控制；各個發酵容器內的雜菌不容易相互影響。環境比較控制，搖晃均勻，溫度均勻。在罐頭瓶這個小環境下，菌種通過自然選擇，產生的菌株活性高，便于擴大培養。發酵效果好。采用本工藝，地衣芽孢桿菌的固體發酵活菌數達到5.0XIOki cfu/g,有效地提高了地衣芽孢桿菌產量。保持活菌率>90%，保留大約85%生物活性成分。衛生指標符合微生物飼料添加劑地衣芽孢桿菌衛生指標。生產成本低。利用固體發酵方法，以麩皮作為培養底物生產的地衣芽孢桿菌具有生產成本增加較少，單位飼料添加量明顯減少的特點，以每噸全價飼料添加100 g地衣芽孢桿菌計算，每噸飼料節約5元成本。在應用方面,提高了動物的生產性能,減少疾病的發生，可以替代部分抗生素的用量，在水質改良方面，有效分解水中有機質，降低水中氨氮的含量，為水產動物提供良好的生長環境，為畜牧業的發展提供有利保障。本發明采用了獨特的固體發酵培養基和固態發酵技術，加快了菌種繁殖速度，縮短了發酵周期，降低了生產成本，提高了產品的芽胞形成率。
具體實施例方式下面通過實施例作進一步描述。實施例1。利用地衣芽孢桿菌制備飼料添加劑，包括如下步驟:
(I)囷種制備與活化
把購得的地衣芽孢桿菌的菌種制成懸浮液，加入無菌水稀釋到濃度為10_8時，在固體平板培養基上對其進行涂布分離或劃線分離，挑取部分單菌落進行生產能力的測定；經反復篩選，確定出經發酵產生的芽孢活性強、活菌數高的菌株代替原來的菌株。地衣芽孢桿菌菌種從中國農業微生物菌種保藏管理中心購得。(2)斜面菌種制作
按配方要求配置斜面培養基，斜面培養基的各組份重量份為:牛肉膏5 g，蛋白胨10g，NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，加水定容至1000 mL ;pH控制在7.2 ；
將斜面培養基加熱使各組分充分溶解，加熱溫度控制在50-60°C，調好pH，然后分裝于若干支試管中，每支試管中斜面培養基的裝量為試管總容量的1/3 ;在試管上蓋上棉塞，將棉塞和試管口部分包上報紙，用線系緊；將試管于121°C滅菌30 min，取出擺斜面，冷卻后備用;
將上述斜面培養基置于干燥箱或培養箱中放置24 h接入步驟(I)中制備的菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為試管中混合物總重量的1% ;在37°C條件下培養24 h，制成斜面菌種。(3)三角瓶液體菌種制作
按配方要求配置液體培養基，液體培養基的各組份重量份為:蛋白胨2 g、牛肉膏3 g、酵母膏2 g、硫酸猛0.2 g、磷酸二氫鉀0.4 g、磷酸氫二鉀0.5 g、鹿糖20 g、加水定至1000mL ；pH控制在7.0 ;分裝于若干個500mL的三角瓶中，每支三角瓶裝量為220 mL ;密封后在121 °C溫度下滅菌30 min，冷卻后備用；
在無菌條件下，每個三角瓶中的液體培養基接入步驟(2)制得的斜面菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為三角瓶中混合物總重量的10% ;對三角瓶進行搖床培養，溫度控制在37°C，轉速為180-200 r/min;搖床培養24 h后制得三角瓶液體菌種，備用。(4)罐頭瓶固體發酵
按配方要求配置固體發酵培養基，固體發酵培養基的各組份重量份為:紅糖0.5%、石灰0.5 %，無菌水45%，其余為麩皮；
將固體發酵培養基混和均勻后分裝入若干罐頭瓶中，瓶口用報紙蓋住，用線系緊；在121 °C的溫度下對上述罐頭瓶滅菌60 min ；
冷卻后，接入步驟(3)制取的液體菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為總重量的5% ;放入37°C的培養間中培養60 h，當芽孢形成率達到90%以上發酵結束，出料后制得成品。實施例2。利用地衣芽孢桿菌制備飼料添加劑，包括如下步驟:
(I)囷種制備與活化
把購得的地衣芽孢桿菌的菌種制成懸浮液，加入無菌水稀釋到濃度為10_8時，在固體平板培養基上對其進行劃線分離，挑取部分單菌落進行生產能力的測定；經反復篩選，確定出經發酵產生的芽孢活性強、活菌數高的菌株代替原來的菌株。(2)斜面菌種制作
按配方要求配置斜面培養基，斜面培養基的各組份重量份為:牛肉膏5 g，蛋白胨10g，NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，加水定容至止1000 mL ；pH控制在7.4 ；
將斜面培養基加熱使各組分充分溶解，調好PH值，然后分裝于若干支試管中，每支試管中斜面培養基的裝量為試管總容量的1/2 ;在試管上蓋上棉塞，將棉塞和試管口部分包上報紙，用線系緊；將試管于121°C滅菌30 min,取出擺斜面，冷卻后備用；
將上述斜面培養基置于干燥箱或培養箱中放置48h接入步驟(I)中篩選的活力高的的菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為試管中混合物總重量的1% ;在37°C條件下培養24 h，制成斜面菌種。(3)三角瓶液體菌種制作
按配方要求配置液體培養基，液體培養基的各組份重量份為:蛋白胨2 g、牛肉膏3 g、酵母膏2 g、硫酸猛0.2 g、磷酸二氫鉀0.4 g、磷酸氫二鉀0.5 g、鹿糖20 g、加水定容至1000 mL ;pH控制在7.2 ;分裝于若干個500 mL的三角瓶中，每支三角瓶裝量為220 ml ;密封后在121°C溫度下滅菌30 min，冷卻后備用；
在無菌條件下，每個三角瓶中的液體培養基接入步驟(2)制得的斜面菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為三角瓶中混合物總重量的10% ;對三角瓶進行搖床培養，溫度控制在37°C，轉速為180-200 r/min;搖床培養24 h后制得三角瓶液體菌種，備用。(4)罐頭瓶固體發酵
按配方要求配置固體發酵培養基，固體發酵培養基的各組份重量份為:紅糖0.5%、石灰0.5 %，無菌水45%，其余為麩皮；
將固體發酵培養基混和均勻后分裝入若干罐頭瓶中，瓶口用報紙蓋住，用線系緊；在121 °C的溫度下對上述罐頭瓶滅菌60 min ；
冷卻后，接入步驟(3)制取的液體菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為總重量的5% ;放入37°C的培養間中培養60 h，當芽孢形成率達到90%以上發酵結束，出料后制得成品。經過上述步驟生產飼料添加劑活菌含量高，經檢測活菌總數大于5.0X 101° cfu/g，也能保持活菌率>90%，保留大約85%生物活性成分。該復合飼料添加劑具有耐高溫、耐酸堿、耐膽汁的特點，并具有較好的貯存穩定性。實施例3。利用地衣芽孢桿菌制備飼料添加劑，包括如下步驟:
(I)囷種制備與活化
把購得的地衣芽孢桿菌的菌種制成懸浮液，加入無菌水稀釋到濃度為10_8時，在固體平板培養基上對其進行涂布分離，挑取部分單菌落進行生產能力的測定；經反復篩選，確定出經發酵產生的芽孢活性強、活菌數高的菌株代替原來的菌株。所述芽孢活性強、活菌數高的菌株是指經過試產，對其產量進行比較，選出的菌株。(2)斜面菌種制作
按配方要求配置斜面培養基，斜面培養基的各組份重量份為:牛肉膏5 g，蛋白胨10
g,NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，加水定容至1000 mL ;pH控制在7.2 ;
將斜面培養基加熱使各組分充分溶解，調好PH值，然后分裝于若干支試管中，每支試管中斜面培養基的裝量為試管總容量的1/3 ;在試管上蓋上棉塞，將棉塞和試管口部分包上報紙，用線系緊；將試管于121°C滅菌30 min,取出擺斜面，冷卻后備用；
將上述斜面培養基置于干燥箱或培養箱中放置48h接入步驟(I)中制備的菌種，每個試管中地衣芽孢桿菌接種量為試管中混合物總重量的1% ;在37°C條件下培養24 h，制成斜面菌種。(3)三角瓶液體菌種制作
按配方要求配置液體培養基，液體培養基的各組份重量份為:蛋白胨2 g、牛肉膏3 g、酵母膏2 g、硫酸猛0.2 g、磷酸二氫鉀0.4 g、磷酸氫二鉀0.5 g、鹿糖20 g、加水定容至1000 mL ;pH控制在7.2 ;分裝于若干個500mL的三角瓶中，每支三角瓶裝量為220 ml ;密封后在121°C溫度下滅菌30 min，冷卻后備用；
在無菌條件下，每個三角瓶中的液體培養基接入步驟(2)制得的斜面菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為三角瓶中混合物總重量的10% ;對三角瓶進行搖床培養，溫度控制在37°C，轉速為180-200 r/min;搖床培養24 h后制得三角瓶液體菌種，備用。(4)罐頭瓶固體發酵
按配方要求配置固體發酵培養基，固體發酵培養基的各組份重量份為:紅糖0.5%、石灰0.5 %，無菌水45%，其余為麩皮；
將固體發酵培養基混和均勻后分裝入若干罐頭瓶中，瓶口用報紙蓋住，用線系緊；在121 °C的溫度下對上述罐頭瓶滅菌60 min ；
冷卻后，接入步驟(3)制取的液體菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為總重量的5% ;放入37°C的培養間中培養60 h，當芽孢形成率達到90%以上發酵結束，出料制得成品；
將步驟4制得的成品進一步在發酵瓷盤中發酵，發酵溫度控制在37°C，培養時間為60
h。經過進一步發酵，提高成品產量。由于罐頭瓶的容量有限，在發酵瓷盤中進一步發酵，起到了擴大培養的作用。在發酵瓷盤中發酵，便于攪動物料，使其發酵均勻。經過上述步驟生產飼料添加劑活菌含量高，經農業部飼料質量監督檢驗測試中心檢測活菌總數大于5.0 X 101° cfu/g,保持活菌率>90%，保留大約85%生物活性成分。該復合飼料添加劑具有耐高溫、耐酸堿、耐膽汁的特點，并具有較好的貯存穩定性。實驗例I。根據在山東金銘實業有限公司實驗，選差兩個月出欄長白豬共12頭，分為對照組和試驗組，每組各6頭。對照組選用豐潤大豬配合飼料305，不添加任何其他東西喂食。試驗組同樣選用豐潤大豬配合飼料305，同時按1000g/t的比例添加本發明制得的飼料添加劑，試驗期均為2個月。結果如下:
表I 0.1%本飼料添加劑對差兩個月出欄長白豬體重增重情況
權利要求
1.一種利用地衣芽孢桿菌制取飼料添加劑的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)囷種制備與活化 把購得的地衣芽孢桿菌的菌種制成懸浮液，加入無菌水稀釋到濃度為10_8時，在固體平板培養基上對其進行涂布分離或劃線分離，挑取部分單菌落進行生產能力的測定；經反復篩選，確定出經發酵產生的芽孢活性強、活菌數高的菌株代替原來的菌株； (2)斜面菌種制作 按配方要求配置斜面培養基，斜面培養基的各組份重量份為:牛肉膏5 g，蛋白胨10g,NaCl 5 g，瓊脂粉20-25 g，加水定容至1000 mL ;pH控制在7.2-7.4 ; 將斜面培養基加熱使各組分充分溶解，調好PH，然后分裝于若干支試管中，密封試管；將試管于121°C滅菌30 min,取出擺斜面，冷卻后備用； 將上述斜面培養基置于干燥箱或培養箱中放置24-48h接入步驟(I)中制備的菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為試管中混合物總重量的1%，在37°C條件下培養24h，制成斜面菌種； (3)三角瓶液體菌種制作 按配方要求配置液體培養基，液體培養基的各組份重量份為:蛋白胨2 g、牛肉膏3 g、酵母膏2 g、硫酸猛0.2 g、磷酸二氫鉀0.4 g、磷酸氫二鉀0.5 g、鹿糖20 g,加水定容至IOOOmL ;pH控制在7.0-7.2 ;分裝于若干個500mL的三角瓶中，每支三角瓶裝量為220mL ;密封后在121°C溫度下滅菌30min，冷卻后備用； 在無菌條件下，每個三角瓶中的液體培養基接入步驟(2)制得的斜面菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為三角瓶中混合物總重量的10%，對三角瓶進行搖床培養，溫度控制在37°C，轉速為180-200 r/min ;搖床培養24h后制得三角瓶液體菌種，備用； (4)罐頭瓶固體發酵 按配方要求配置固體發酵培養基，固體發酵培養基的各組份重量份為:紅糖0.5%、石灰0.5 %，無菌水45%，其余為麩皮； 將固體發酵培養基混和均勻后分裝入若干罐頭瓶中，瓶口用報紙蓋住，用線系緊；在121 °C的溫度下對上述罐頭瓶滅菌60 min； 冷卻后，接入步驟(3)制取的液體菌種，其中地衣芽孢桿菌接種量為混合物總重量的5% ;放入37°C的培養間中培養60 h，當芽孢形成率達到90%以上發酵結束，出料后制得成品O
2.如權利要求1所述的一種利用地衣芽孢桿菌制取飼料添加劑的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的密封是指在試管上蓋上棉塞，將棉塞和試管口部分包上報紙，用線系緊。
3.如權利要求1所述的一種利用地衣芽孢桿菌制取飼料添加劑的方法，其特征在于:在步驟(2)中每支試管中斜面培養基的裝量為試管總容量的1/3-1/2。
4.如權利要求1到3任意一權利要求所述的一種利用地衣芽孢桿菌制取飼料添加劑的方法，其特征在于:步驟(4)中還包括將制得的成品進一步在發酵瓷盤中發酵的步驟，發酵溫度控制在37 °C，培養時間為60 h。
全文摘要
本發明提供了一種利用地衣芽孢桿菌制備飼料添加劑的方法。該方法通過菌種制備與活化、斜面菌種制作、三角瓶液體菌種制作、罐頭瓶固體發酵等步驟，得到飼料添加劑。本發明采用了獨特的培養基和固態發酵技術，加快了菌種繁殖速度，縮短了發酵周期，降低了生產成本，提高了產品的芽胞形成率。主要利用麩皮這種廉價的介質作為主要培養底物，有效降低了生產成本。生產工藝具有節水、節能、副產物少、環保的獨特優勢，生產成本低，產品耐高溫、耐酸堿、耐擠壓，飼料加工過程中受損小，添加量小、飼喂效果更明顯，屬于清潔生產技術，具有大規模推廣應用的價值。
文檔編號C12N1/20GK103109981SQ201310083068
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月15日 優先權日2013年3月15日
發明者郝志剛, 羅明, 王奎明 申請人:高唐華農生物工程有限公司