一種人誘導多能干細胞的傳代方法及應用的制作方法

一種人誘導多能干細胞的傳代方法及應用的制作方法
【專利摘要】一種人誘導多能干細胞的傳代方法及應用，該方法解決了傳統克隆塊傳代方法使細胞易于分化，且轉染效率低，難以進行基因修飾的問題。該方法為單細胞傳代及其培養方法，包括如下步驟：用消化酶添加ROCK抑制劑將誘導多能干細胞克隆充分消化為單細胞；使用血球計數板或細胞計數儀計數；按照20000-30000細胞/平方厘米的密度將細胞鋪至經ECM包被的培養板上；使用添加ROCK抑制劑的培養基對誘導多能干細胞置于37℃，8-15％CO2條件下培養；傳代20代后，誘導多能干細胞的多能性未發生變化，包括多能性基因表達，體內及體外分化潛能等。
【專利說明】一種人誘導多能干細胞的傳代方法及應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及人誘導多能干細胞的傳代方法，具體涉及人誘導多能干細胞單細胞傳代和培養技術。

【背景技術】
[0002]2006年，日本京都大學Shinya Yamanaka在世界著名學術雜志《細胞》上率先報道了誘導多能干細胞的研究。他們把0ct3/4、SoX2、C-MyC和Klf4這四種轉錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細胞，發現可誘導其發生轉化，成功獲得類似于胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES細胞)的多能干細胞，命名為誘導多能干細胞(iPSCs, inducedpluripotent stem cell)。產生的iPSCs在形態、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態、細胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細胞相似，從而對iPSCs多能性進行了肯定。依此證明處于終末分化的成熟細胞可以通過重編程技術逆轉為未分化狀態，而達到恢復多能性分化潛能的目的。
[0003]Shinya Yamanaka研究小組利用相同的技術,將上述同樣的4個轉錄因子導入到人類皮膚成纖維細胞中，也成功獲得了 iPSCs。原代人類成纖維細胞樣滑膜細胞和源自新生兒成纖維細胞的細胞系同樣也可被重構成為iPSCs。這類iPSCs在細胞形態、增殖能力、表面抗原標志、基因表達譜、多潛能干細胞特異性基因的表觀遺傳學狀態、端粒酶活性等方面與hESCs相似，并且在體外培養時和在小鼠體內畸胎瘤形成中均可分化為3個胚層的不同細胞類型(Takahashi K和Yamanaka S等人,利用特定因子誘導成人成纖維細胞到多能干細胞。細胞2007 ;131:861-872)。與此同時，威斯康辛大學J.A Thomson研究小組也報道了成功誘導胎兒成纖維細胞轉化為具有hESCs基本特征的人類iPSCs，所不同的是他們使用慢病毒作為載體，并在14個候選基因中選擇了 0ct4、Sox2、Nanog、Lin28等4個基因進行轉導(俞君英等人，從人的體細胞誘導成為多能干細胞系，科學，2007 ；318:1917-1920)。這一被學界稱為生物科學“里程碑”的重大突破有望幫助科學家繞過克隆技術的倫理、道德紛爭，為醫學應用打開大門。
[0004]iPSCs的出現為研究細胞核重新編程提供了新的思路，在干細胞研究領域、表觀遺傳學研究領域以及生物醫學研究領域都引起了強烈的反響，這不僅是因為它在基礎研究方面的重要性，更為再生醫學帶來了新的希望。在實際應用方面，iPSCs的獲得方法相對簡單和穩定，不需要使用生殖細胞或破壞早期胚胎。這在技術上和倫理上都比其他方法更有優勢。iPSCs的建立進一步拉近了干細胞和臨床疾病治療的距離，在細胞替代性治療以及發病機理的研究、新藥篩選方面具有巨大的潛在價值。此外，iPSCs在神經系統疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈現，iPSCs在體外已成功地被分化為神經元細胞、神經膠質細胞、心血管細胞和原始生殖細胞等，因具有與患者自身相同的基因組成，所以不會引起機體自身的免疫排斥反應。
[0005]目前iPSCs的培養和傳代方法不盡相同，培養基有血清和血清替代品之分，傳代方法有酶消化法和機械傳代法，根據實驗需求采用相應的培養和傳代方法。通常的傳代方式是將克隆使用Dispase或膠原酶初步處理后，使克隆變得較為松散，然后將克隆分割成克隆塊以鋪至滋養層細胞上的方式來傳代，所用的培養條件一般為37°C，5% C02。該方法的缺陷是細胞易于分化，難于大規模擴增。而利用單細胞的傳代方法通常會影響細胞的多能性，且長期培養對細胞核型有影響。


【發明內容】

[0006]針對現有技術的上述問題，本發明提供了一種人誘導多能干細胞(hiPSCs)的單細胞傳代及培養的方法，該方法可以迅速擴增hiPSCs，使細胞保持較好的生長狀態，克服了hiPSCs易于分化、難于大規模擴增、凍存及復蘇效率低的問題，易于進行核轉染及單細胞克隆，為基因修飾等操作帶來極大方便。
[0007]為實現上述目的，本發明采取以下技術方案:
[0008]一種人誘導多能干細胞的傳代方法，該方法包括如下步驟:
[0009]A.細胞傳代前l_2h鋪細胞外基質到多孔板；
[0010]B.從培養箱中取出匯合率75% -85%需要傳代的細胞，用DMEM/F12培養基洗一次，加Accutase消化酶置于37°C、體積分數8_15%的CO2培養箱中消化；細胞基本被消化下來時，加mTeSRl培養基終止消化；
[0011]C.離心，棄上清液，使用添加ROCK抑制劑的mTeSRl培養基重懸細胞，輕輕吹打均勻記數；
[0012]D.按20000-30000細胞/平方厘米的密度將細胞鋪至經細胞外基質包被的培養板上，置于37°C、體積分數為8-15%的CO2培養箱培養；
[0013]E.第二天觀察細胞密度、貼壁情況，若一切正常即撤去ROCK抑制劑，換新鮮mTeSRl培養基進行培養，以后每天換液，至匯合率再次達到75% -85%既可傳代或凍存。
[0014]如上所述的傳代方法，優選地，所述步驟A中的細胞外基質為ECM、Matrigel Geltrex? LDEV-Free hESC Qualified> Vitronectin(VTN-N)或 CELLstart?CTStm0
[0015]如上所述的傳代方法，優選地，所述步驟B中需要傳代的細胞為生長處于對數期時的細胞；更優選地，以Accutase加Y27632作為消化酶，消化時間為7min，這樣既保證是單細胞傳代，又不會因消化過度而影響細胞生長狀態。
[0016]如上所述的傳代方法，所述ROCK抑制劑可抑制細胞在單細胞狀態下的凋亡，從而提高細胞存活率，優選為 Y27632，HA-100，Blebbistatin 或 Thiazovivin，更優選為 Y27632。
[0017]如上所述的傳代方法，優選地，所述步驟C中用臺盼藍對細胞進行計數，為保證計數的準確性，調整細胞密度為每一大格細胞數30-50個時細胞計數。
[0018]一種人誘導多能干細胞的傳代方法，該方法采用如上所述的方法，除了所述Accutase消化酶替換為胰酶。
[0019]一種人誘導多能干細胞的傳代方法，該方法采用如上所述的方法，除了所述mTeSRl 培養基(StemCelI, Cat#05850)替換為 TeSR2 (StemCell，Cat#05860)，Essential8?Medium (Life, Cat#A14666SA)，或 NutriStem (BI，Cat#05-100_1A/B)。
[0020]如上所述的傳代方法應用于hiPSCs細胞大規模擴增。
[0021]如上所述的傳代方法應用于高效轉染hiPSCs及外源基因導入。
[0022]如上所述的傳代方法應用于獲得單個細胞來源的克隆，以純化細胞或篩選具有特定標記的細胞群體。
[0023]如上所述的傳代方法應用于獲取突變體等位基因的同基因型細胞株。
[0024]如上所述的傳代方法應用于獲取用于基因修飾的單細胞懸液。
[0025]本發明的有益效果在于，本發明的方法將hiPSCs細胞處理成單細胞形式，且置于高CO2濃度的條件下培養。其有益效果體現在以下幾個方面:
[0026]I)使傳代的細胞較為均一地鋪與培養板中，接種密度為20000-30000細胞/平方厘米，太稀的話細胞間信息交流比較少、不利于生長，太密的話細胞生長較快，若傳代不及時的話細胞容易老化，從而導致分化；
[0027]2)可使hiPSCs大規模擴增，適于該類細胞的工業化生產；
[0028]3)凍存后的細胞可獲得大于70%復蘇后成活率；
[0029]4)使hiPSCs單細胞克隆的效率提高3-5倍，易于進行基因修飾篩選具有相同基因型的克隆；
[0030]5)傳代超過20代后，使用該方法傳代的hiPSCs細胞仍具有人胚胎干細胞相似特征，且核型也沒有發生變化。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1A為實施例1培養第二天顯微鏡照片。
[0032]圖1B為實施例1培養第三天顯微鏡照片。
[0033]圖1C為實施例1培養第四天顯微鏡照片。
[0034]圖1D為實施例1培養第五天顯微鏡照片。
[0035]圖2A為實施例3克隆團懸浮培養顯微鏡照片。
[0036]圖2B為實施例3利用qPCR檢測三個胚層標記物的表達。
[0037]圖2C為實施例3畸胎瘤照片。
[0038]圖3為實施例4核型分析圖。
[0039]圖4為實施例5GFP表達顯微鏡照片。

【具體實施方式】
[0040]實施例1hiPSCs單細胞傳代
[0041]I)細胞傳代前l_2h鋪ECM到6孔板。
[0042]2)從培養箱中取出匯合率75% -85%左右的細胞，用DMEM/F12培養基洗一次，加Accutase消化酶置于37°C、體積分數12%的CO2培養箱中消化，細胞基本被消化下來時，加入mTeSRl終止消化。
[0043]3) 200g離心3min，棄上清液，含有Y27632的mTeSRl重懸細胞，輕輕吹打均勻。
[0044]4)用血球計數板對細胞進行記數，按20000-30000/平方厘米的密度接種于預先鋪有ECM的6孔板上，置于37°C、體積分數12%的CO2培養箱培養。
[0045]5)第二天顯微鏡下觀察細胞密度及貼壁情況(圖1A)。細胞之間具有接觸且細胞密度合適，撤去Y27632，換新鮮mTeSRl培養基進行培養。
[0046]6)第三天細胞開始聚集成團(圖1B)，細胞狀態穩定，換新鮮mTeSRl培養基進行培養。
[0047]7)第四天至第五天，細胞生長活躍，密度逐步增大(圖1C，圖1D)，至75-85%密度時，細胞即可進行傳代或凍存。
[0048]實施例2hiPSCs單細胞克隆
[0049]I)從培養箱中取出匯合率75%-85%左右的細胞，加Accutase消化酶置于37°C、體積分數8-15%的CO2培養箱中消化，細胞基本被消化下來時，加入mTeSRl終止消化。
[0050]2)臺盼藍染色，利用血球計數板計活細胞數目，使用mTeSRl+Y27632抑制劑稀釋細胞懸液至5-15個細胞/毫升，向ECM包被的96孔板中加入10ul細胞懸液/孔，放入8-15%的CO2培養箱中培養。
[0051]3) 10天后鏡檢，將長至克隆狀的hiPSCs傳代，擴增，即獲得單細胞來源的hiPSCs。
[0052]實施例3-hiPSCs單細胞傳代后的多能性鑒定
[0053]hiPSCs采用實施例1的方法單細胞傳代20代后，取部分細胞進行擬胚體形成(EBformat1n)實驗和畸胎瘤形成實驗(Teratomas format1n)。
[0054]I)擬胚體形成
[0055]復蘇hiPSCs至ECM上，待細胞長至75%時將細胞轉移至feeder上培養。當克隆團在feeder上生長5-6天后，轉移克隆團懸浮培養(圖2A)。懸浮培養8天后轉移EB球至包被Gelatin的6孔板內貼壁生長。當EB球貼壁生長8天后，收集貼壁細胞的RNA，利用qPCR檢測三個胚層標記物的表達情況(圖2B)。結果顯示通過EB方式分化得到的細胞均比hiPSCs在三個胚層細胞的標記物上均有增長，且與hiPSCs相比，每個胚層至少有一個標記物的差別大于10倍。
[0056]2)畸胎瘤形成
[0057]復蘇hiPSCs至ECM上，待細胞長至75%時，擴增至1cm培養皿，使用Accutase消化細胞為單細胞，離心去上清，使用30%的ECM重懸細胞，然后注射至SCID小鼠腋下及肌肉,8-12周后獲取畸胎瘤,使用石蠟包埋后,切片，Η/E染色,結果顯示畸胎瘤中含有3個胚層的組織(圖2C)。
[0058]實施例4hiPSCs核型分析
[0059]復蘇hiPSCs至ECM上，將匯合率達85%左右的細胞吸棄培養基，DMEM/F12洗兩遍，加10% MEF培養基(90% DMEM高糖、10% FBS)和秋水仙素混合培養基，置于37攝氏度、5% CO2中處理2h，處理完成后用DPBS洗一遍，0.25%胰酶消化后收集細胞，200g離心5min，棄上清液加入37°C預溫的0.075mol/L KCL溶液8ml，用吸管迅速、猛烈吹打細胞沉淀，混勻后置于37°C恒溫水浴鍋低滲處理18min，加入1ml新鮮配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1),用吸管輕柔吹勻，室溫預固定5min, 1200rpm離心5min,棄上清液,沿壁緩慢加入新鮮配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3: 1)，輕輕吹勻，置于37°C水預40min，再重復固定一次，1200rpm離心5min，用吸管吸棄大部分固定液，留約1.5ml輕柔重懸細胞，吸取少量細胞懸液，滴2-3滴于冰水浸泡過的玻片上，馬上置于烘箱中烘干，將標本置于胰酶消化8s、迅速放于生理鹽水中終止消化、再Giemsa染色8min，用自來水輕輕沖洗玻片，室溫干燥后于顯微鏡下觀察分裂相的多少及分散情況。隨機選取20個分裂相，使用G顯帶核型分析法分析所有分裂相的核型。統計結果顯示共有18個分裂相為46條染色體，且形態正常，2個分裂相不正常。可以認定該細胞株經過單細胞20代傳代后核型正常，隨機選取一個分裂相排列出核型圖(圖3)。
[0060]實施例5向單細胞狀態的hiPSCs轉染mRNA及質粒
[0061]I)消化細胞:用Accutase消化細胞，收集細胞，離心，棄上清，mTeSRl/Y27632重懸;
[0062]2)細胞計數:用臺盼藍計數，計算活細胞數；
[0063]3)取適量的活細胞到1.5ml離心管，115g，3min ；
[0064]4)使用核轉染試劑重懸；
[0065]5)向兩個轉染體系中分別加入適量pMAX-GFP質粒和GFP-mRNA，輕輕吹打混勻；
[0066]6)核轉染:將細胞與DNA混合液轉移到電轉杯中(避免氣泡)，使用AmaxaNucleofactor II，選擇相應程序電擊；
[0067]7)恢復:將500ul培養基(37度提前預熱)加入電轉杯，然后將細胞從電轉杯中輕輕吸出；
[0068]8)鋪板:根據實驗需要將細胞鋪到相應的ECM包被平板上，一般為12孔板的3個孔。
[0069]9) 18小時后 ，顯微鏡下檢查GFP表達情況(圖4)。
[0070]最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
【權利要求】
1.一種人誘導多能干細胞的傳代方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: A.細胞傳代前l_2h鋪細胞外基質到多孔板； B.從培養箱中取出匯合率75%-85%需要傳代的細胞，用DMEM/F12培養基洗一次，加Accutase消化酶置于37°C、體積分數8_15%的CO2培養箱中消化；細胞基本被消化下來時，加mTeSRl培養基終止消化； C.離心，棄上清液，使用添加ROCK抑制劑的mTeSRl培養基重懸細胞，輕輕吹打均勻記數； D.按20000-30000細胞/平方厘米的密度將細胞鋪至經細胞外基質包被的培養板上，置于37°C、體積分數為8-15%的CO2培養箱培養； E.第二天觀察細胞密度、貼壁情況，若一切正常即撤去ROCK抑制劑，換新鮮mTeSRl培養基進行培養，以后每天換液，至匯合率再次達到75% -85%既可傳代或凍存。
2.根據權利要求1所述的傳代方法，其特征在于，所述步驟A中的細胞外基質為 ECM、Matrigel Geltrex? LDEV-Free hESC Qualified, Vitronectin(VTN-N)或CELLstart?CTS?0
3.根據權利要求1所述的傳代方法，其特征在于，所述步驟B中需要傳代的細胞為生長處于對數期時的細胞。
4.根據權利要求1所述的傳代方法，其特征在于，所述ROCK抑制劑為Y27632，HA-100，Blebbistatin 或 Thiazovivin0
5.一種人誘導多能干細胞的傳代方法，其特征在于，該方法采用權利要求1-3中任一項所述的方法，除了所述Accutase消化酶替換為胰酶。
6.一種人誘導多能干細胞的傳代方法，其特征在于，該方法采用權利要求1-3中任一項所述的方法，除了所述mTeSRl培養基替換為TeSR2 (StemCelI，Cat#05860)，Essential8?Medium (Life, Cat#A14666SA)，或 NutriStem (BI，Cat#05-100_1A/B)。
7.如權利要求1-6中任一項所述的傳代方法應用于hiPSCs細胞大規模擴增。
8.如權利要求1-6中任一項所述的傳代方法應用于高效轉染hiPSCs及外源基因導入。
9.如權利要求1-6中任一項所述的傳代方法應用于獲得單個細胞來源的克隆，以純化細胞或篩選具有特定標記的細胞群體。
10.如權利要求1-6中任一項所述的傳代方法應用于獲取突變體等位基因的同基因型細胞株。
11.如權利要求1-6中任一項所述的傳代方法應用于獲取用于基因修飾的單細胞懸液。
【文檔編號】C12N5/10GK104178456SQ201310276246
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年7月3日 優先權日:2013年7月3日
【發明者】楊佳銀, 劉雨晴 申請人:深圳市三啟生物技術有限公司