一種誘導小鼠誘導型多能干細胞骨向分化的方法及其培養基的制作方法

一種誘導小鼠誘導型多能干細胞骨向分化的方法及其培養基的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種誘導小鼠誘導型多能干細胞骨向分化的方法及其培養基。本發明提供的方法是將小鼠多能干細胞接種到分化培養基I中形成間質細胞富集的擬胚體，再分離擬胚體并在分化培養基II中培養獲得成骨細胞。本發明公開的分化培養基I是在成纖維細胞培養基基礎上添加全反式維甲酸和堿性成纖維細胞生長因子，分化培養基II是在成骨細胞培養基的基礎上降低D-葡萄糖含量，并添加BMP4或BMP7。本發明提供方法和培養基能夠顯著促進小鼠多能干細胞的骨向分化，具備周期短、分化率高、效果穩定等特點，具有廣闊的應用前景和實用價值。
【專利說明】一種誘導小鼠誘導型多能干細胞骨向分化的方法及其培養基
【技術領域】
[0001]本發明涉及了一種誘導小鼠誘導型多能干細胞骨向分化的方法及其培養基，屬于生物【技術領域】。
技術背景
[0002]多能性干細胞是指具有形成動物個體所有類型細胞的多向分化潛能，并能夠不斷自我更新的一類細胞。它們一方面通過細胞分裂維持自身群體的大小或擴增，另一方面可以進一步分化為特異的細胞類型。由于多能性干細胞的上述特性，使其在細胞替代治療、基因治療、發育生物學、藥理學等領域發揮著獨特的作用和優勢。目前，多能性干細胞根據其來源分為三類:來源于胚胎囊胚內細胞團的胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES)、來源于胚胎生殖嵴原始生殖細胞的胚胎生殖細胞(embryonic germ cell,EGC)和通過體細胞重編程而獲得的誘導型多能干細胞(induced pluripotent stem cell, iPS)。由于ES和EG細胞來源于發育期的胚胎，它們的獲得，特別是人類ES及EG細胞的獲得引發了許多倫理學上的爭議。另外，將ES及EG細胞應用到人類臨床治療還面臨著免疫排斥的風險。這兩點限制了 ES及EG細胞在臨床醫學及基礎科學領域的應用。
[0003]2006年，Yamanaka等首次將0ct4、Sox2、Klf4及c_myc導入小鼠皮膚成纖維細胞獲得了類似于小鼠ES細胞的iPS細胞系(Takahashi and Yamanaka, 2006),經證實,這類細胞能夠參與正常胚胎發育和組織器官的形成，并獲得了生殖系嵌合的小鼠(Zhao et al.，2009)。2007年，Thomson實驗室和Yamanaka實驗室幾乎同時宣布了人類iPS細胞系的建立(Yu et al., 2007 ；Takahashi et al.，2007)。此后，iPS細胞的研究得到了迅速發展，到目前為止，小鼠、大鼠、兔、狗、豬、猴、人等物種的iPS細胞系都已成功建立，并且它們在形態學、表觀遺傳學、全基因組表達圖譜及分化能力等方面均表現出與其ES細胞相似的特性。iPS技術的建立，使最初基于胚胎和卵母細胞的“治療性克隆”的設想在體細胞上得到了實現-通過體外建立、擴增及定向誘導iPS細胞可以獲得足夠數量的目標細胞用于細胞移植治療和基因治療，并且這一系列操作均不受倫理學上的限制。另外，獲得病人特異的iPS細胞也可以避免外源移植引起的免疫排斥、交叉感染的風險。這一思路為許多細胞缺損性疾病的治療帶來了新的希望，例如:進行性肌營養不良、老年癡呆癥、糖尿病、骨質疏松癥、心肌梗死等。
[0004]現已證明，iPS細胞在適當的培養條件下可以分化為多種細胞類型，如:肌肉細胞(Zhang et al.，2009)、脂肪細胞(Tashiro et al.，2009)、膜腺細胞(Tateishi etal.，2008)、造血細胞(Chio et al.，2009)、神經細胞(Chamber et al.，2009)、成骨細胞等(Pepoo et al., 2009 ；Tashiro et al.，2009)。但現有的定向誘導技術普遍存在著培養基成分不明確、分化細胞純度低的問題。此外，要想達到臨床標準，研究者們在優化培養體系的同時，還應該對移植細胞的致瘤性、有效性進行評價，而這些檢測顯然不能在人類上進行。作為最常用的模式動物，現代醫學中90%的亞臨床試驗實是在小鼠中開展的。小鼠生長周期短、譜系明確，其發育機制普遍通用于哺乳動物。所以，通過對小鼠iPS細胞骨誘導條件的優化，一方面有利于后期檢測中自體移植試驗的開展，另一方面將為人類細胞骨誘導條件的優化和骨再生醫學的研究提供有益參考。

【發明內容】

[0005]本發明提供了一種誘導小鼠誘導型多能干細胞骨向分化的培養基，采用的技術方案如下:
[0006]—種誘導小鼠iPS細胞骨向分化的培養基由分化培養基I和分化培養基II組成，其中分化培養基I是在成纖維細胞培養基基礎上添加全反式維甲酸和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)制得，分化培養基II是在成骨細胞培養基的基礎上降低D-葡萄糖含量，并添加BMP4或BMP7制得。
[0007]優選地，所述培養基由以下兩種培養基組成:
[0008]分化培養基I是在成纖維細胞培養基的基礎上添加10_8-10_7mol/L的全反式維甲酸(美國Sigma公司)和3-10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(美國Peprotech公司)，ρΗ7.0-7.4 ；
[0009]分化培養基II是在成骨細胞培養基的基礎上降低D-葡萄糖含量為原濃度的20-40%,并添加 60-120ng/mL BMP4 (美國 P^rotech 公司)或 40_120ng/mL BMP7 (美國Peprotech 公司)，pH7.0-7.4。
[0010]所述成纖維細胞培養基為含有10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養基(美國Hyclone公司)。
[0011]進一步地，所述成骨細胞培養基為含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、50mg/L抗壞血酸、IOmmo I/L β -甘油磷酸鈉、10_8mol/L地塞米松的高糖DMEM培養基。
[0012]進一步地，所述分化培養基I是添加5X10_8mol/mL的全反式維甲酸和10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子，含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養基，pH7.0-7.4 ;分化培養基 II 是添加 100ng/mL BMP4 或 100ng/mL BMP7，含有 10%FBS、1% 青霉素-鏈霉素、50mg/L抗壞血酸、10mmol/L β -甘油磷酸鈉、10_8mol/L地塞米松，葡萄糖含量為原濃度25%的高糖DMEM培養基，pH7.0-7.4。
[0013]本發明的另一目的是提供了一種誘導小鼠iPS細胞分化為成骨細胞的方法，步驟如下:
[0014]I)將小鼠誘導型多能干細胞接種到超低粘附培養皿中，加入分化培養基I，培養3-6天，形成擬胚體；
[0015]所述分化培養基I組成為:是在成纖維細胞培養基的基礎上添加10_8-10_7mol/L的全反式維甲酸和3-10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，pH7.0-7.4 ；
[0016]2)將步驟I)所得擬胚體離心分離后，收集擬胚體并添加分化培養基II，吹打后接入到明膠鋪底的培養皿中，補充分化培養基II，培養并隔天更換培養基，培養7-14天，得成骨細胞；
[0017]所述分化培養基II組成為:是在成骨細胞培養基的基礎上降低D-葡萄糖含量為原濃度的 20-40%，并添加 60-120ng/mL BMP4 或 40_120ng/mLBMP7，pH7.0-7.4。
[0018]所述方法步驟I)中，培養時間5天。[0019]所述方法步驟2)中，培養時間14天，且第一次更換培養基時，用37°C溫浴的PBS清洗1_3次。
[0020]所述方法步驟I)和步驟2)中分化培養基培養的溫度為37°C，含有5%C02。
[0021]所述方法的具體步驟如下:
[0022]I)間質細胞富集的擬胚體的誘導:利用差速貼壁法去除飼養層細胞，獲得純凈的小鼠誘導型多能干細胞，將所得到的小鼠誘導型多能干細胞以2X105個/mL的密度接種到超低粘附培養皿中，加入分化培養基I，于37°C、5%C02條件下培養，從第2天起，每天搖動培養基2次，從第3天開始，每天補加10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子，培養5天形成擬胚體；
[0023]所述分化培養基I組成為:是在成纖維細胞培養基的基礎上添加5 X 10_8mOl/L的全反式維甲酸和10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，pH7.0-7.4 ；
[0024]2)成骨細胞的誘導:將步驟I)所得擬胚體于1200rpm下離心lmin，收集擬胚體并添加少量分化培養基，機械吹打為小細胞團塊后接種到明膠鋪底的培養皿中，補充分化培養基II，于37°C、5%C02條件下培養并隔天更換培養基，培養14天，獲得成骨細胞；
[0025]所述分化 培養基II組成為:是在成骨細胞培養基的基礎上降低D-葡萄糖含量為原濃度的 25%，并添加 100ng/mL BMP4 或 100ng/mLBMP7，pH7.0-7.4。
[0026]本發明的有益效果:
[0027]本發明提供了一種誘導小鼠iPS細胞定向分化為成骨細胞的方法及其培養基。所使用的分化培養基I中添加的全反式維甲酸可以促進擬胚體形成的同時間質類型細胞的富集。在動物胚胎發育過程中，形成的間質細胞可以進一步分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等類型。培養基I中添加的bFGF —方面可以通過激活ERK信號通路抑制細胞的成脂分化，另一方面可以抑制細胞凋亡。該步驟無需換液，若培養時間超過3天，僅需每天補充bFGF即可。檢測結果證明，培養基I中形成的擬胚體中，間質細胞特異性基因的表達水平髙于自發分化形成的擬胚體(圖3)。所使用的培養基II中添加的BMP可以提高細胞骨向分化的效率并促進成骨細胞的進一步成熟，在此基礎上降低培養液中D-葡萄糖的含量可以起到促進細胞分化的作用，鑒于分化細胞的代謝水平遠低于增殖期細胞。檢測結果顯示，培養基II中形成的分化細胞的礦化水平及成骨基因Rux2、0ste0calcin的表達水平均得到顯提高(圖4-5)。
[0028]本發明所采用的骨誘導方法力求模擬動物體內的成骨模式，因而是一種比較合理的誘導方案。用本發明及其專用培養基誘導小鼠iPS細胞分化為成骨細胞只需兩步完成，具有周期短、分化率高、效果穩定等特點。小鼠作為最常用的模式動物，對其骨誘導條件的優化一方面為人類胚胎發育機制的探索提供了良好的實驗材料，另一方面將為人類再生醫學的研究提供有益參考，具有廣闊的應用前景和實用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為誘導小鼠iPS細胞分化為成骨細胞的技術流程圖。
[0030]圖2為對小鼠iPS細胞的鑒定。
[0031]圖3為對培養基I中培養3天后形成的擬胚體進行中胚層分化基因表達檢測的結
果O[0032]圖4為對培養基II中培養14天后的細胞進行茜素紅染色的結果。
[0033]圖5為對培養基II中培養14天后的細胞進行成骨基因Runx2和osteocalcin表達水平檢測的結果。
【具體實施方式】[0034]下面結合具體實例來進一步闡述本發明，下述實例是對本發明的說明而非限定本發明的試用范圍，實例中若無特別說明均為常規方法。
[0035]實施例1小鼠iPS細胞的培養及鑒定
[0036]獲得并維持具有良好的多能性及分化能力的小鼠iPS細胞系是后期開展細胞定向誘導分化的基礎。本實例為對本發明所使用的小鼠iPS細胞進行的培養、鑒定操作過程的描述。
[0037]一、小鼠iPS細胞的培養
[0038]本實例采用的小鼠iPS細胞系pl4-2-2由中國科學院干細胞庫提供。
[0039]絲裂霉素C工作液:2mg絲裂霉素C溶于200mL含10%胎牛血清的高糖DMEM中，過濾除菌。
[0040]0.1%明膠:0.1g明膠粉末溶解于IOOmL雙蒸水中，高壓滅菌。
[0041]成纖維細胞培養液:內含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM。
[0042]LN 培養液:內含 48%DMEM/F12、48%Neurobasal、1000U/mL LIF,0.5%N2、1%B27、
0.5mg/mLBSA、100U/mL 青霉素和 100 μ g/mL 鏈霉素。
[0043]1、飼養層細胞的制備
[0044]取13.5天的孕鼠，斷頸處死后，取出子宮置于盛有PBS的培養皿中；分離胎鼠，去其頭、尾和內臟；PBS清洗數次后充分剪碎，加入0.05%的胰酶/EDTA，吹打2分鐘后加入成纖維細胞培養液終止消化；離心、棄上清，加入成纖維細胞培養液重懸細胞后接種于培養皿中，記為原代。
[0045]取上述3-5代的細胞，去除培養液加入終濃度為10ug/mL絲裂霉素C工作液；37°C培養3小時后去除絲裂霉素C工作液，PBS充分清洗；0.05%胰酶/EDTA處理后，加入成纖維細胞培養液終止消化；離心、棄上清，按照7 X IO4個細胞/ml接種于0.1%明膠包被的培養皿中；37°C培養12-24小時，得到用以培養小鼠iPS細胞的飼養層。
[0046]2、小鼠iPS細胞的常規培養
[0047]飼養層使用前用PBS清洗3次，將小鼠iPS細胞接種于飼養層鋪底的培養皿中，加入LN培養液，搖勻后置于37°C、5.0%C02飽和濕度的培養箱中培養。每天換液，每3天以Tryple酶消化傳代一次，如若發現克隆密度或面積過大應及時傳代。圖2A左圖為傳代34代的小鼠iPS細胞形態，從圖中可見克隆呈島狀或鳥巢狀，邊界清晰，細胞間界限不明顯。
[0048]二、小鼠iPS細胞的鑒定
[0049]1、核型鑒定
[0050]小鼠iPS細胞經過34次傳代后，向培養皿中加入秋水仙素，終濃度為0.4ug/mL ；
2.5小時后收集細胞，接種于明膠包被的培養皿中用以除去飼養層細胞，10分鐘后收集細胞懸液，并在37°C下于低滲液中孵育15分鐘；配置新鮮的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1 (V/V))，將細胞于室溫固定5分鐘后，離心、棄上清；向沉淀中加入冰冷的固定液，并置于冰上固定20分鐘；重復上述步驟一次后離心，向沉淀中加入200 μ I冷固定液，滴片(載玻片在凍箱中預冷，滴片要迅速，以免載玻片回溫或干燥)；載玻片干燥后進行吉姆薩染色，5分鐘后可以鏡檢。圖2Α右圖為34代的小鼠iPS細胞核型,小鼠iPS細胞經過多次傳代后其染色體的數目、形態未見明顯異常。
[0051]2、免疫熒光鑒定多能性基因表達
[0052]除去細胞培養液，PBS清洗3次后，4%多聚甲醛室溫固定30分鐘；PBS清洗3次，加入0.l%Triton-100在37°C透膜I小時；PBS清洗3次后，室溫下用含0.1%BSA的封閉液孵育細胞30分鐘；此后，分別加入封閉液稀釋的抗0ct-4、SoX2、SSEAl或Nanog的一抗在4°C下孵育過夜；PBS震蕩清洗細胞3次后，加入二抗，37°C下避光孵育I小時；HOCheSt33342染色液染核10分鐘；PBS震蕩清洗后加入防熒光淬滅劑，顯微鏡下觀察并拍照。如圖2B (小鼠iPS細胞多能性基因表達檢測結果)所示，本實例條件下培養的小鼠iPS細胞，多能性基因0ct4、SOX2、NanOg、SSEAl均呈陽性表達，證明本發明所使用的小鼠iPS細胞具有良好的多能性。 [0053]3、小鼠iPS細胞分化能力檢測
[0054]除去細胞培養液，收集細胞，并用明膠貼壁法去掉飼養層細胞；將純化的小鼠iPS細胞以107/ml注入6周齡裸鼠大腿內側；3周后處死小鼠，取畸胎瘤樣本固定；按照標準的石蠟切片制作及HE染色步驟操作，封片后觀察三胚層的形成情況。結果顯示(圖2C小鼠iPS細胞形成的畸胎瘤切片HE染色情況)，本實例所使用的小鼠iPS細胞在體內具有良好的分化潛能，形成的畸胎瘤具有三胚層來源的典型結構，包括神經組織(外胚層，圖2C左)、脂肪組織(中胚層，圖2C中)、分泌腺管樣組織(內胚層，圖2C右)。
[0055]實施例2小鼠iPS細胞的骨向誘導分化
[0056]在本發明中，小鼠iPS細胞的骨向誘導分化是通過兩步完成的:第一步是在適當地培養條件下獲得間質細胞富集的擬胚體；再經過第二步定向誘導分化獲得成骨細胞。操作流程參見圖1。
[0057]一、擬胚體的制備
[0058]分化培養基1:成纖維細胞培養液中添加5X 10_8mol/L全反式維甲酸和10ng/mL的bFGF，pH為7.0-7.4。其中，成纖維細胞培養液為含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMHM。
[0059]該步驟的操作過程包括:參照實例1，明膠貼壁法去除飼養層細胞并收集懸浮細胞；調整細胞密度為2 X IO5個細胞/mL，將細胞接種到超低粘附培養皿中；加入分化培養基I，于37°C、5%C02條件下培養5天，可見擬胚體形成。從第2天開始，每天搖動培養皿2次，每次間隔12小時；從第3天開始,每天補加10ng/mL的bFGF。
[0060]誘導5天后，采用免疫熒光法檢測擬胚體中分化基因的表達情況。結果如圖3所示，分化培養基I中形成的擬胚體，其前段中胚層標志分子Brachyury、PDGFRa的表達水平低于未添加全反式維甲酸和bFGF的成纖維細胞培養液中形成的擬胚體，而間質細胞標志分子CD105、CD133的表達水平顯著高于后者，可見培養基I促進了構成擬胚體的細胞向間質細胞方向分化。
[0061]二、細胞的骨向誘導分化
[0062]分化培養基I1:將成骨細胞培養基的D-Gluc0se含量降低為原濃度的25%，并添加 100ng/mL BMP4 或 100ng/mL BMP7, pH 為 7.0-7.4。其中，成骨細胞培養基為含 10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、50mg/L抗壞血酸、10mmol/L β -甘油磷酸鈉、l(T8mol/L地塞米松的高糖DMEM。
[0063]該步驟的操作過程如下:
[0064]1、分化培養基11的準備:將高糖DMEM和無糖DMEM以1:3的比例混合均勻，在此基礎上添加1%青霉素-鏈霉素、50mg/L抗壞血酸、10^3mol/L β -甘油磷酸鈉和10_8mol/L地塞米松備用，pH 為 7.0-7.4。使用前加入 10%FBS 和 100ng/mL BMP4 或 100ng/mL BMP7。
[0065]2、細胞的骨向誘導分化:將實例2步驟一所獲得的擬胚體經1200轉/分鐘離心I分鐘，收集沉淀并添加少量分化培養基II重懸，機械吹打為小細胞團塊后接種到明膠鋪底的培養皿中。補充培養基II，于37°C、5%C02條件下培養14天。隔天更換一次培養基，第一次換液時，用37°C溫浴的PBS清洗3次。
[0066]實施例3成骨分化細胞的鑒定
[0067]一、鈣沉積水平檢測
[0068]1% 茜素紅 S:0.1M 的 tris-HcllOOmL (ρΗ8.3)，加入 0.1g 茜素紅 S，4°C保存。
[0069]本實例中，茜素紅染色法被用于檢測分化細胞的鈣沉積水平，其步驟包括:將經過分化培養基I誘導5天(實例2步驟一)和分化培養基II誘導14天(實例2步驟二)的細胞除去培養液，用PBS清洗3次；95%乙醇在室溫下固定細胞10分鐘后，PBS清洗3遍，加入1%茜素紅S染液，37°C孵育30分鐘；PBS清洗細胞3遍，于倒置顯微鏡下觀察拍照。
[0070]染色結果如圖4所示(其中，A為對照組；B為成骨細胞培養基組；C為分化培養基II組(BMP4);D為分化培養基II組(BMP7))，在分化培養基II中誘導14天后，細胞中有大量鈣結節產生，茜素紅陽性細胞比例大`于70% (圖4C-D);成骨細胞培養基組有少量鈣結節產生，茜素紅陽性細胞比例僅為30% (圖4B);此外，作為對照的成纖維細胞培養基組未見明顯的鈣結節形成(圖4A)。結果表明，分化培養基II能夠促進經分化培養基I誘導形成的擬胚體細胞骨向分化，其誘導效率較現有成骨細胞培養液高出一倍。
[0071]二、成骨基因表達水平檢測
[0072]Runx2和osteocalcin是成骨分化過程中的兩個重要的基因。本實例中，real-time PCR法被用于檢測分化細胞中Runx2和osteocalcin的表達水平。其操作步驟如下:
[0073]1、參照Trizol Reagant說明書提取細胞的mRNA。
[0074]2、參照 TaKaRa SYBR PrimeScriptTM Kit 說明書將提取的 mRNA 反轉錄為 cDNA。
[0075]3、米用 real-time PCR 檢測成骨基因 Runx2 和 osteocalcin 表達水平，β-actin為內參。
[0076]引物序列為:
[0077]osteocalcin-F:TCTGACAAAGCCTTCATGTCC,
[0078]osteocalcin-R:AAATAGTGATACCGTAGATGCG ；
[0079]Runx2-F: CCTGAACTCTGCACCAAGTC,
[0080]Runx2-R:GAGGTGGCAGTGTCATCATC ；
[0081]β -actin-F:GACGGCCAGGTCATCACTATTG,
[0082]β -actin-R:CCACAGGATTCCATACCCAAGA[0083]檢測結果如圖5所示(對于同一基因(Runx2或osteocalcin),上標不同代表差異顯著(P〈0.05)),作為對照的成纖維細胞培養基組中，Runx2和osteocalcin均不表達,而添加BMP4的分化培養基II組的Runx2和osteocalcin的表達水平均顯著高于成骨細胞培養基組，盡管添加BMP7的分化培養基II組的osteocalcin的表達水平與成骨細胞培養基組無顯著區別，但Runx2的表達水平顯著高于成骨細胞培養基組。該結果從分子水平上證實了分化培養基II能夠促進細胞的成骨分化，盡管添加不同的細胞因子效果略有不同。
[0084]以上檢測結果顯示，本發明所提供的骨誘導培養液可以有效地促進小鼠iPS細胞的成骨分化，所采用的“雞尾酒”式的分步誘導方法符合動物體內的成骨模式，能夠提高小鼠iPS細胞的體外成骨 效率。
【權利要求】
1.一種誘導小鼠誘導型多能干細胞骨向分化的培養基，其特征在于，由分化培養基I和分化培養基II組成，其中分化培養基I是在成纖維細胞培養基基礎上添加全反式維甲酸和堿性成纖維細胞生長因子制得，分化培養基II是在成骨細胞培養基的基礎上降低D-葡萄糖含量，并添加BMP4或BMP7制得。
2.權利要求1所述培養基，其特征在于，所述分化培養基I是在成纖維細胞培養基的基礎上添加l(T8-l(T7mol/L的全反式維甲酸和3-10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，PH7.0-7.4 ;所述分化培養基II是在成骨細胞培養基的基礎上降低D-葡萄糖含量為原濃度的 20-40%，并添加 60-120ng/mL BMP4 或 40_120ng/mL BMP7, ρΗ7.0-7.4。
3.權利要求1所述培養基，其特征在于，所述成纖維細胞培養基為含有10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養基。
4.權利要求1所述培養基，其特征在于，所述成骨細胞培養基為含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、50mg/L抗壞血酸、IOmmo I/L β -甘油磷酸鈉、10_8mo I/L地塞米松的高糖DMEM培養基。
5.權利要求1所述培養基，其特征在于，分化培養基I是添加5X10-8mol/mL的全反式維甲酸和10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子，含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養基，pH7.0-7.4 ;分化培養基II是添加100ng/mL BMP4或100ng/mL BMP7，含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、50mg/L抗壞血酸、10mmol/L β -甘油磷酸鈉、10_8mol/L地塞米松，葡萄糖含量為原濃度25%的高糖DMEM培養基，pH7.0-7.4。
6.一種誘導小鼠誘導型多能干細胞分化為成骨細胞的方法，其特征在于，步驟如下: O將小鼠誘導型多能干細胞接種到超低粘附培養皿中，加入分化培養基I，培養3-6天，形成間質細胞富集的擬胚體；` 所述分化培養基I組成為:是在成纖維細胞培養基的基礎上添加10_8-10_7mol/L的全反式維甲酸和3-10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，pH7.0-7.4 ； 2)將步驟I)所得擬胚體離心分離后，收集擬胚體并添加分化培養基II，吹打后接入到明膠鋪底的培養皿中，補充分化培養基II，培養并隔天更換培養基，培養7-14天，得成骨細胞； 所述分化培養基II組成為:是在成骨細胞培養基的基礎上降低D-葡萄糖含量為原濃度的 20-40%，并添加 60-120ng/mL BMP4 或 40_120ng/mLBMP7，ρΗ7.0-7.4。
7.權利要求5所述方法，其特征在于，所述步驟I)中，培養時間5天。
8.權利要求5所述方法，其特征在于，所述步驟2)中，培養時間14天，且第一次更換培養基時，用37°C溫浴的PBS清洗1-3次。
9.權利要求5所述方法，其特征在于，步驟I)和步驟2)中分化培養基培養的溫度為37°C，含有 5%C02。
10.權利要求5所述方法，其特征在于，具體步驟如下: O間質細胞富集的擬胚體的誘導:利用差速貼壁法去除飼養層細胞，獲得純凈的小鼠誘導型多能干細胞，將所得到的小鼠誘導型多能干細胞以2X IO5個/mL的密度接種到超低粘附培養皿中，加入分化培養基I，于37°C、5%C02條件下培養，從第2天起，每天搖動培養基2次，從第3天開始，每天補加10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子，培養5天形成擬胚體； 所述分化培養基I組成為:是在成纖維細胞培養基的基礎上添加5X 10_8mol/L的全反式維甲酸和10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，pH7.0-7.4 ； 2)成骨細胞的誘導:將步驟I)所得擬胚體于1200rpm下離心lmin，收集擬胚體并添加少量分化培養基，機械吹打為小細胞團塊后接種到明膠鋪底的培養皿中，補充分化培養基II，于37°C、5%C02條件下培養并隔天更換培養基，培養14天，獲得成骨細胞；所述分化培養基II組成為:是在成骨細胞培養基的基礎上降低D-葡萄糖含量為原濃度的25%，并添加100ng/mL BMP4 或 100ng/mLBMP7，ρΗ7.0-7.4。
【文檔編號】C12N5/077GK103710310SQ201310731226
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月26日 優先權日:2013年12月26日
【發明者】張宇, 劉忠華, 史久慧, 邢艦譽 申請人:東北農業大學