一種定量檢測食烷烴戈登氏菌的特異性引物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種定量檢測食烷烴戈登氏菌的特異性引物，屬于環境微生物【技術領域】，引物由SEQ?ID?NO.1所示的上游引物和由SEQ?ID?NO.2所示的下游引物組成。通過環境樣品DNA提取、定量PCR檢測、PCR產物分析等步驟，采用本發明提供的特異性引物可以進行食烷烴戈登氏菌的定量檢測。本發明具有特異性高、靈敏度高和檢測速度快耗時短等優點。
【專利說明】一種定量檢測食烷烴戈登氏菌的特異性引物
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物定量檢測【技術領域】，涉及一種定量檢測食烷烴戈登氏菌的特異性引物。
技術背景
[0002]食燒烴戈登氏菌(Gordonia alkanivorans)是一種不具備運動能力、橘紅色菌落、過氧化氫酶陽性、氧化酶陰性、高GC含量的革蘭氏陽性放線菌。特別是對直鏈烷烴等石油烴具有較高的降解速率，在石油污染土壤和水體治理過程中起重要作用，因而受到各國研究者的廣泛關注。此外，該菌還具有較好的耐鹽特性，可以在6%NaCl的高鹽環境下生存。因而可以在高鹽環境下對石油烴污染物進行降解。我們前期分離得到了一株食烷烴戈登氏菌CGMCC N0.6845，并以該菌株為核心制備了石油降解復合菌劑，對石油污染海水等高鹽環境下的石油污染治理具有明顯促進效果。該菌數量在石油污染治理過程中的動態變化極大地影響石油降解效果。然而目前對于環境中該菌數量的定量分析方法并不完善。因此，如何有效地檢測其數量變化成為亟待解決的重要問題。
[0003]目前，關于定量檢測環境中微生物數量的技術主要是稀釋涂布平板技術。稀釋涂布平板技術具有操作簡便的優點，然而由于該菌生長速度緩慢，平均檢測耗時約5天，因此難以使用該技術快速定量分析該菌數量變化。定量PCR技術具有靈敏度高、檢測速度快的優點，因此被應用于多種微生物的檢測。例如:中國專利(200910272677)公布了一種檢測蠟樣芽孢桿菌所需的特異引物及方法；中國專利(201010590692)公布了一種針對產氣莢膜梭菌的快速檢測方法及檢測引物組；美國專利(US20060141492)公布了一系列定量檢測多氯聯苯脫氯菌群的特異性引物。影響定量PCR技術定量準確度的因素有很多，其中特異性引物的設計是關鍵因素之一。隨著微生物基因組數據的不斷積累，采用基因組比對的生物信息學方法識別微生物的特異基因已逐漸成為一種有效的策略。根據特異基因進一步采用計算機軟件設計特異性引物可以大大提高定量PCR技術的準確度。`
【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對環境中食烷烴戈登氏菌定量檢測的問題，提供一種定量檢測食烷烴戈登氏菌的特異性引物。
[0005]本發明的技術方案概述如下:
[0006]一種定量檢測食烷烴戈登氏菌的特異性引物，由SEQ ID N0.1所示的上游引物和由SEQ ID N0.2所示的下游引物組成。
[0007]本發明的優點:
[0008]①特異性高，僅針對食烷烴戈登氏菌進行定量檢測；②靈敏度高，最高可達1.2X105cfu/ml ;③檢測速度快，最快12小時即可完成定量檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】[0009]圖1為采用本發明的特異性引物進行MPN-PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。其中，泳道M為λ -Hind III digest ;泳道I~5為實施例1的結果，泳道8~12為實施例2的結
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【具體實施方式】
[0010]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0011]本發明涉及的食燒烴戈登氏菌(Gordonia alkanivorans)由本申請的發明人從石油污染鹽潰化土壤中分離篩選得到，具有石油烴高效降解特征和耐鹽特征。菌株于2012年11月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心并已存活，保藏單位地址:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編:100101，電話:010-64807355，其微生物保藏編號為CGMCC N0.6845。 [0012]將食烷烴戈登氏菌(CGMCC N0.6845)基因組序列與同屬菌株進行BLAST比對，采用0RTH0MCL剔除高度同源序列，獲得食烷烴戈登氏菌種內特異性序列。進一步將其與全部微生物基因組序列進行BLAST比對，剔除高度同源序列，獲得食烷烴戈登氏菌的特異性序列。針對獲得的特異性序列，采用Primer Primier設計引物。根據Tm值和長度等指標對引物進行篩選，最終獲得針對食烷烴戈登氏菌的特異性引物，其中上游引物G0R_F2 (SEQID N0.1所示)和下游引物G0R_R2 (SEQ ID N0.2所示)長度均為19bp的核苷酸。其序列如下:
[0013]G0R_F2:5，-GGTCGGATTGTCGCAGGAG-3，；(SEQ ID N0.1)
[0014]G0R_R2:5，-TCGAGCGTGACGAGGGTGT-3，。(SEQ ID N0.2)
[0015]采用本發明的一種定量檢測食烷烴戈登氏菌的特異性引物定量檢測食烷烴戈登氏菌:
[0016](I)采用常規酚-氯仿抽提方法提取含有食烷烴戈登氏菌的環境樣品DNA ；
[0017](2 )采用 MPN-PCR 進行定量檢測，PCR 反應體系 50ul 包括 20pM G0R_F1、20pM G0R_Rl (或 20pM G0R_F2 和 20pM G0R_R2)、lul DNA 模板、200uM dNTP、15uM 鎂離子和 2.5U Taq酶。PCR反應條件:94°〇預變性51^11，941:變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，最后72°C延伸 IOmin ；
[0018](3) PCR產物分析，取2ul PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，100V電壓45min,紫外光下拍照；
[0019](4)根據PCR反應結果計算環境樣品中的食烷烴戈登氏菌濃度。
[0020]本發明以環境微生物學為理論依據，綜合微生物基因組學和微生物生態學的相關理論知識，針對食烷烴戈登氏菌難以定量檢測的問題，設計特異性引物，可以用于環境中食烷烴戈登氏菌的定量檢測，特別是可以用于評價石油污染修復過程中的食烷烴戈登氏菌數量的動態變化。
[0021]以下通過具體實施例闡述本發明，目的在于幫助讀者更好地理解本發明的精神實質，但不作為對本發明實施范圍的限定。
[0022]實施例1
[0023]采用本發明的一種定量檢測食烷烴戈登氏菌的特異性引物定量檢測食烷烴戈登氏菌:[0024](1)將含有食烷烴戈登氏菌CGMCC N0.6845的石油降解菌劑加入到石油污染海水中，培養10天后，采用常規酚-氯仿抽提方法提取DNA ；
[0025](2)采用SEQ ID N0.1所示上游引物和SEQ ID N0.2所示下游引物對步驟(1)獲得的DNA進行MPN-PCR定量檢測。PCR反應體系50ul包括:20pM SEQ ID N0.1所示上游引物、20pMSEQ ID N0.2所示下游引物、lul DNA模板(采用無菌水梯度稀釋至101、ΙΟ2、ΙΟ3、104 和 ΙΟ5 倍)、200uM dNTP、15uM 鎂離子和 2.5U Taq 酶。PCR 反應條件:94°C預變性 5min,94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，最后72°C延伸lOmin。取2ulPCR產物進行
1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，100V電壓45min，紫外光下拍照(結果如圖1所示。其中，泳道Μ為λ -Hind III digest ;泳道1~5為本實施例的結果。泳道1為采用稀釋101倍的DNA進行MPN-PCR的結果，泳道2為采用稀釋102倍的DNA進行MPN-PCR的結果，泳道3為采用稀釋103倍的DNA進行MPN-PCR的結果，泳道4為采用稀釋104倍的DNA進行MPN-PCR的結果，泳道5為采用稀釋105倍的DNA進行MPN-PCR的結果)。計算得到食烷烴戈登氏菌濃度為6.2X106cfu/ml，檢測共花費時間13小時。
[0026]實施例2
[0027]采用本發明的一種定量檢測食烷烴戈登氏菌的特異性引物定量檢測食烷烴戈登氏菌:
[0028](1)同實施例1;
[0029](2)采用SEQ ID N0.1所示上游引物和SEQ ID N0.2所示下游引物對步驟(1)獲得的DNA進行MPN-PCR定量檢測。PCR反應體系同實施例1。PCR反應條件:94°C預變性5min，94°C變性lmin，57°C退火lmin，72°C延伸2min，最后72°C延伸lOmin。PCR產物分析同實施例1。(結果如圖1所示。其中，泳`道Μ為λ-Hind III digest ;泳道8~12為本實施例的結果。泳道8為采用稀釋101倍的DNA進行MPN-PCR的結果，泳道9為采用稀釋102倍的DNA進行MPN-PCR的結果，泳道10為采用稀釋103倍的DNA進行MPN-PCR的結果，泳道11為采用稀釋104倍的DNA進行MPN-PCR的結果，泳道12為采用稀釋105倍的DNA進行MPN-PCR的結果)。計算得到食烷烴戈登氏菌濃度為7.8X 106cfu/ml，檢測共花費時間12小時。
【權利要求】
1.一種定量檢測食烷烴戈登氏菌的特異性引物，其特征在于由SEQ ID N0.1所示的上游引物和 由SEQ ID N0.2所示的下游引物組成。
【文檔編號】C12N15/11GK103695528SQ201310304653
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年7月19日 優先權日:2013年7月19日
【發明者】王新新, 吳亮, 譚耀模, 楊勇, 亓俊良, 安偉, 牛志剛, 陳宇 申請人:中國海洋石油總公司, 中海油能源發展股份有限公司, 中海石油環保服務（天津）有限公司