一種處理畜禽養殖污水的復合生物菌劑及其制造方法
【專利摘要】本發明涉及一種處理畜禽養殖污水的復合生物菌劑及其制造方法，屬于環境生物【技術領域】。本發明的微生物菌株為解淀粉芽孢桿菌IAE（BacillusamyloliquefaciensIAE）、棘孢木霉12（Trichodermaasperellum12）和蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）。本發明適用于污水排放量較大的畜禽養殖業的污水處理，能夠通過微生物分解、絮凝大顆粒固體物質（包括蛔蟲卵等有害生物）、殺滅蚊蠅的有害生物、減少臭氣排放等方式處理養殖業污水。處理后的污水固體懸浮顆粒、COD顯著降低，污水處理后作為液體有機肥或者清水混合灌溉用水能夠有效的降低施用土壤的負載，減少對土壤的污染，有效緩解集約化養殖在一定時空產生高濃度污水導致周圍土壤難以消納的難題。
【專利說明】一種處理畜禽養殖污水的復合生物菌劑及其制造方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及處理畜禽養殖污水的復合生物菌劑及其制造方法，屬于環境生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]我國畜禽養殖業發展迅速，在保障城鄉畜禽產品供應、促進農民增收、活躍農村經濟方面發揮了重要作用。隨著畜禽養殖業不斷發展，養殖污染物排放量也大幅增加，對區域環境安全構成威脅。根據污染源普查動態更新調查數據，2010年畜禽養殖業的化學需氧量、氨氮排放量分別達到1148萬噸、65萬噸，占全國排放總量的比例分別為45%、25%，畜禽養殖業主要水污染物排放量中化學需氧量、氨氮排放量分別為當年工業源排放量的3.23倍、
2.30 倍。
[0003]畜禽規模化養殖水平逐 步提高，2010年，全國生豬、蛋雞和奶牛規模養殖比例分別達到65%、79%、47%，豬、牛、家禽年末存欄量分別達到約4.6億頭、1.1億頭、53.5億只，肉類產量連續22年居世界第一，我國生豬、蛋雞和奶牛優勢省區豬肉、禽蛋和牛奶產量分別占全國總量的92%、68%、88%，海南、天津、北京、新疆、上海、青海、寧夏、西藏等省(區、市)生豬存欄量較低，均不到全國總存欄量的I %。
[0004]國內外對于是畜禽養殖業廢棄物處理主要依靠土地利用消納。但是大型的規模化養殖導致在特定時間和空間產生大量的廢棄物，廢棄物中包括大量的污水，無法長距離運輸，廢棄物排放量嚴重超過土地消納能力，造成農田土壤污染，畜禽糞便中的氮磷等元素、飼料添加劑中的抗生素、激素、銅、鐵、鉻、鋅等物質，長期在土壤中過量累積，導致土壤和地下水環境污染。研究表明，年出欄量10萬頭的養豬場，污染半徑可達5公里，粉塵和氣溶膠攜帶大量包括口蹄疫、豬肺疫、大腸埃希氏菌、炭疽、布氏桿菌、真菌孢子等病原微生物，惡臭、粉塵和微生物排放量遠超過大氣的自凈能力，嚴重影響空氣質量，污染人居環境和人體健康。
[0005]減少養殖企業周圍土壤的污水消納負荷，必須要減少污水中有機物的濃度和病原微生物數量，同時處理過程中減少臭氣的排出。現有處理養殖污水的方法多為堆肥或者沼氣發酵。堆肥方式處理需要大量地添加秸桿、草木灰、鋸屑、泥炭等吸水物質，增加處理量和處理成本。沼氣處理后，固體物質被厭氧消化成更小的物質，污水總量變化不大，但是沼渣固液分離困難，沼渣后續處理也是一大難題。因此，開發一種方法，使污水處理過程相較于常規方法，臭氣、粉塵以及氣溶膠量較少，孳生蚊蠅的有害生物量較少，處理后的污水，有機物濃度低，病原微生物數量少，可以直接作為液體有機肥或者清水混灌用水，十分迫切和必要。
[0006]三、
【發明內容】
發明的目的在于提供一種處理畜禽養殖業污水的復合生物菌劑，供集約化畜禽養殖污水處理應用。
[0007]一種畜禽養殖污水處理復合生物菌劑，其特征為復合生物菌劑含有解淀粉芽孢桿菌 IAE {Bacillus amy1liquefaciens IAE)
)、棘抱木霉12 (Trichoderma.asperellum 12)和蘇云金芽抱桿菌(漢thuringiensis、；
其中所述的一株解淀粉芽抱桿菌I姐(Bacillus amy1 Ii quefaci ens Z4Z?)，于2013年3月15日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為武漢市武昌珞珈山，保藏編號CCTCCNO:M 2013086，簡稱為解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2013086 ；
所述的一株棘抱木霉12(7>icAoofe/ma.asperellum 7J?),于2013年5月16日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為武漢市武昌珞珈山，保藏編號CCTCC NO:M 2013213，簡稱為棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213。
[0008]上述解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2013086，其特征在于:用接種環從培養皿中挑取生長24h的該菌接種于裝有100mL絮凝劑合成培養基的250ml三角瓶中，接種量IO4CfuInr1JTtMSOrpm培養60h，菌株合成微生物絮凝劑量21.8 g L'
[0009]上述解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2013086發酵所用培養液配制方法為，以配制 IL 培養液為例:葡萄糖 80g,谷氨酸鈉 50g, (NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4.3H20 2g，MnSO4.7H20 0.25g, MnSO4H2O 0.03 g，蒸餾水 1000ml，pH 值自然，115°C滅菌 30min。
[0010]上述棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213發酵生產方法為:棘孢木霉CCTCC NO:M2013213接種到培養液中培養，其培養條件為培養溫度25°C、搖床轉速120rpm、培養時間72小時，該菌株發酵液纖維素酶活力25.2 U πιm1。
[0011]上述所用培養液配制方法為(以配制IL培養基為例):用100 g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30 min，經過濾后濾液中加5g普通蔗糖和2g水稻秸桿粉，定容至1000 ml，pH 值自然，115°C滅菌 30 min。
[0012]用于生物防治蚊蜆的蘇云金芽孢桿菌(漢菌株購自江蘇生久農化有限公司，也可以向其他商業公司或者中國科學院微生物所、南京農業大學、河海大學等科研單位購買。菌株對蒼蠅和蚊子具有生物防治作用，對于蒼蠅殺滅率高于60%，對于蚊子殺滅率達80%，能夠有效的抑 制污水中蚊蠅的孳生。
[0013]上述蘇云金芽孢桿菌發酵液殺滅蚊蠅的測定方法為:蘇云金芽孢桿菌接種到菌種培養基，進行培養，其條件為:搖床震蕩170rpm，培養溫度37°C，培養24小時，菌落形成單位^ IXlO9Cfu πιm1，菌液噴霧于養殖蒼蠅和蚊子的廣口瓶中，測定相較于噴無菌水處理，菌液噴霧處理蚊蠅的死亡率。
[0014]上述所用的液體培養基的配方為，按照IL培養基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自來水 1000ml, pH 范圍 7.0-7.5，121°C滅菌 20min。
[0015]所述畜禽養殖污水處理的復合生物菌劑的制備，包括:1)將解淀粉芽孢桿菌CCTCCNO:M 2013086菌株接種到液體種子培養基，培養的條件為:搖床震蕩170rpm，培養溫度37°C，培養24小時，菌落形成單位> IXlO9Cfu πιm1 ;所用的液體種子培養基配方為，按照IL培養基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自來水1000ml，pH范圍7.0-7.5，121°C滅菌20min ;將解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2013086種子按照5%體積百分比接種到液體發酵培養基，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為:培養溫度28~35°C，溶氧通氣量范圍為30~100%，15(T220rpm，發酵后期發酵液該菌株的菌落形成單位> I X 109cfu ml—1，發酵低溫液儲存備用；所用的液體發酵培養基的配方為，按照IL培養基配制:葡萄糖80g，谷氨酸鈉 50g, (NH4)2SO4 8g, NaCl 5g, K2HPO4.3H20 2g, MnSO4.7H20 0.25g, MnSO4H2O 0.03g，蒸懼水1000ml, pH值自然，115°C滅菌30min。
[0016]2)棘孢木霉 CCTCC NO:M 2013213 發酵生產，棘孢木霉 CCTCC NO:M 2013213 接種到PDA培養液中，進行液體種子培養，培養條件為:搖床震蕩120rpm，培養溫度25°C，培養72小時，菌落形成單位> 0.5X IO8Cfu ml-1;所用的液體的種子PDA培養基的配方為，按照IL培養基配制:用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30 min，用紗布過濾后，濾液加20 g普通蔗糖，定容至1000 ml，pH值自然，115°C滅菌30 min ;將棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213菌種子按照10%體積百分比接種到液體發酵培養基，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為:初始PH自然，培養溫I擴22°C，溶氧通氣量范圍為30~100%，9(Tl70rpm,發酵中后期形成菌絲球用轉速250rpm攪拌打碎成菌絲片段,發酵液棘孢木霉CCTCC NO:M 2013 213菌株的菌落形成單位≥0.5 X IO8Cfu ml—1，發酵液低溫存貯備用；所用液體發酵培養液配制方法為 (以配制IL培養基為例):用100 g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30 min,經過濾后濾液中加5g普通鹿糖和2g水稻稻桿粉,定容至1000 ml,pH值自然，115°C滅菌30 min。
[0017]3)蘇云金芽孢桿菌發酵液生產，蘇云金芽孢桿菌接種到液體種子培養基，培養條件為:搖床震蕩170rpm，培養溫度37°C，培養24小時，菌落形成單位≥IXlO8Cfu ml-1 ;所用的液體的種子培養基的配方為，按照IL培養基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自來水1000ml，pH范圍7.0-7.5，121°C滅菌20min ;將蘇云金芽孢桿菌種子按照5%體積百分比接種到液體發酵培養基，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為:初始PH范圍為
7.0~7.5，培養溫度25~33°C，溶氧通氣量范圍為30~100 %，15(T220rpm，發酵后期發酵液該菌株的菌落形成單位> IXlO9Cfu ml—1，發酵液儲存備用。所用的液體發酵培養基的配方為，按照IL培養基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自來水1000ml，pH范圍7.0-7.5，121°C 滅菌 20min。
[0018]4)將微生物發酵液菌種按照解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2013086:棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213:蘇云金芽孢桿菌=10:8:1體積比例復合，用氫氧化鈣調節PH值為
8.0-8.5，用攪拌機攪拌0.5^1小時讓微生物菌體穩定和進入休眠狀態。復合物在常溫靜置2小時，灌裝，即為養殖業污水凈化菌群。
[0019]所述處理養殖業污水菌群可用于養殖業污水存放處直接的噴施、混合或者結合工程措施添加，能夠有效的降解污水中大分子物質、沉淀懸浮的各種微生物和固體顆粒物質、有效的抑制污水中孳生蚊蠅類有害生物，減少處理過程中臭氣、氣溶膠、粉塵的產生，使處理后的污水有機物濃度顯著降低。
[0020]本發明提供一種能夠處理養殖業污水的復合生物菌劑及其生產方法，通過對高產生物絮凝劑、高產纖維素酶以及具有高效生物殺滅蚊蠅的微生物高密度發酵，利用發酵液生產穩定復合菌劑，該菌劑處理養殖業污水快速、低成本、低環境污染，處理后污水有機物濃度顯著降低，有利于在現代集約化畜禽養殖污水處理中的應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1污水處理池剖面圖，其中I為污泥出口 ；2為處理池I ;3為柵格；4為處理池2 ；5為出水口。[0022]四、【具體實施方式】
實施例1 菌株獲得
產生生物絮凝劑菌株的獲得
采集自江蘇沿海灘涂裸露灘涂中、零星生長的植株根際周圍土壤低溫保存，采用谷氨酸培養基分離生物絮凝劑即Y-多聚谷氨酸合成微生物菌株。篩選的標準為菌落在培養基上形成高的隆起，隆起物具有很強的粘性和吸水性的菌株。篩選液體發酵合成Y-多聚谷氨酸的能力最強菌株，獲得菌株經過16s rDNA序列進化分析，鑒定屬于解淀粉芽孢桿菌(Λamy1 H quefaci ens ) ?其合成生物絮凝劑量為21.8g L_\其生物學特征為:菌體呈桿狀,染色均勻，具運動性，兼性厭氧，芽孢呈橢圓形，革蘭氏染色陽性，培養基上菌落呈白色不透明菌落，邊緣不規則，有隆起，表面裙皺。所述的解淀粉芽孢桿菌IAE Ul amy1liquefaciensIAE)于2013年3月15日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為武漢市武昌珞珈山，保藏編號CCTCC NO:M 2013086，簡稱為解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2013086 ；
上述培養基的配方為，按照配制IL量配制:葡萄糖80g，谷氨酸鈉50g，(NH4)2SO4 Sg,NaCl 5g，K2HPO4.3Η20 2g，MnSO4.7Η20 0.25g, MnSO4H2O 0.03 g，蒸餾水 1000ml，pH 值自然，115°C 滅菌 30min。
[0023]產生纖維素酶菌株獲得
采集通氣性較差土壤、灘涂粉砂質土 壤、潛水淤泥、已經有的真菌菌株等樣品，低溫保存，采用剛果紅培養基分離真菌，水解圈較大的菌株保存備用。
[0024]上述剛果紅培養基配制方法為(以配制IL培養基為例):羧甲基纖維素鈉15g，蛋白胨5g，KH2P04 1.0g，MgS047H20 0.2g,NaCl 5g，剛果紅0.2g，pH7.0，瓊脂20g，自來水 1000ml。
[0025]產生纖維素酶菌株屬于棘孢木霉(7:主要生物學特性為:在PDA培養基上28°C培養3天，菌絲可以布滿整個培養皿，菌絲生長初期白色，氈狀，由中心至邊緣逐漸形成環狀，靠近邊緣環狀菌絲顏色較淺，在靠近中心同心圓上產生稠密的暗綠色分生孢子，生長菌絲的培養皿散發出很重的椰汁芳香氣味，背面深黃色；分生孢子梗對生生長，呈樹狀分枝，暗綠色，瓶梗短，基部變細，中間膨大；分生孢子呈球形，表面粗糙，大小為
3.5~5.0 μmΧ2.0~5.0 μM;該菌株發酵液纖維素酶活為25.2 U m-1 ；ITS序列進化分析顯示該菌株為棘孢木霉(T1.asperellum)。該菌株于2013年5月16日保藏與中國典型培養物保藏中心，保藏地址為武漢市武昌珞珈山，保藏編號CCTCCM2013213，簡稱為棘孢木霉 CCTCC NO:M 2013213。
[0026]殺滅蚊蠅的蘇云金芽孢桿菌菌株獲得
具有殺滅蚊蠅效果的蘇云金芽孢桿菌市場上已經有十分成熟的商業產品，菌株購自江蘇生久農化有限公司，殺滅蚊蠅效果通過驗證，對于蒼蠅殺滅率高于60%，對于蚊子殺滅率達80%，能夠有效的抑制污水中蚊蠅的孳生。
[0027]上述蘇云金芽孢桿菌發酵液殺滅蚊蠅的測定方法為:蘇云金芽孢桿菌接種到菌種培養基，進行培養，其條件為:搖床震蕩170rpm，培養溫度37°C，培養24小時，菌落形成單位^ IXlO9Cfu m-1，菌液噴霧于養殖蒼蠅和蚊子的廣口瓶中，測定相較于噴無菌水處理，菌液噴霧處理蚊蠅的死亡率。
[0028]上述所用的液體培養基的配方為，按照IL培養基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自來水 1000ml, pH 范圍 7.0-7.5，121°C滅菌 20min。
[0029]菌劑生產
解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2013086發酵生產，將解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M2013086菌株接種到液體種子培養基，培養的條件為:搖床震蕩170rpm，培養溫度37°C，培養24小時，菌落形成單位> IXlO9Cfu πι1 ;所用的液體種子培養基配方為，按照IL培養基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g, NaCl IOg,自來水1000ml, pH范圍7.0-7.5，121°C滅菌20min ;將解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2013086種子按照5%體積百分比接種到液體發酵培養基，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為:培養溫度28~35°C，溶氧通氣量范圍為30~100%，15(T220rpm，發酵后期發酵液該菌株的菌落形成單位> I X 109cfu ml—1，發酵液儲存備用；所用的液體發酵培養基的配方為，按照IL培養基配制:葡萄糖80g，谷氨酸鈉50g, (NH4)2SO4 8g, NaCl 5g，K2HPO4.3H20 2g，MnSO4.7H20 0.25g, MnSO4H2O 0.03 g，蒸餾水1000ml, pH 值自然，115°C滅菌 30min。
[0030]棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213發酵生產，棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213接種到PDA培養液中，進行液體種子培養，培養條件為:搖床震蕩120rpm，培養溫度25°C，培養72小時，菌落形成單位> 0.5 X IO8Cfu πι1 ;所用的液體的種子PDA培養基的配方為，按照IL培養基配制:用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30 min，用紗布過濾后，濾液加20 g普通蔗糖，定容至1000 ml，pH值自然，115°C滅菌30 min ;將棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213菌種子按照10%體積百分比接種到液體發酵培養基，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為:初始PH自然，培養溫19~22°C，溶氧 通氣量范圍為30~100%，9(Tl70rpm，發酵中后期形成菌絲球用轉速250rpm攪拌打碎成菌絲片段，發酵液棘孢木霉CCTCC NO:M2013213菌株的菌落形成單位> 0.5X IO8Cfu πι1，發酵液低溫存貯備用；所用液體發酵培養液配制方法為(以配制IL培養基為例):用100 g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30 min,經過濾后濾液中加5g普通鹿糖和2g水稻稻桿粉,定容至1000 ml,pH值自然，115°C滅菌 30 min。
[0031]蘇云金芽孢桿菌發酵液生產，蘇云金芽孢桿菌接種到液體種子培養基，培養條件為:搖床震蕩170印111，培養溫度371:，培養24小時，菌落形成單位≥1\109(^11 ml—1 ;所用的液體的種子培養基的配方為，按照IL培養基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自來水1000ml, pH范圍7.0-7.5，121°C滅菌20min ;將蘇云金芽孢桿菌種子按照5%體積百分比接種到液體發酵培養基，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為:初始PH范圍為7.0-7.5，培養溫度25~33°C，溶氧通氣量范圍為30~100%，150-220rpm，發酵后期發酵液該菌株的菌落形成單位> IXlO9Cfu πι1，發酵液儲存備用。所用的液體發酵培養基的配方為，按照IL培養基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g, NaCl IOg,自來水1000ml, pH范圍7.0-7.5，121°C滅菌20min。
[0032]處理養殖污水復合菌群生產
將解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2013086、棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213和蘇云金芽孢桿菌發酵液按照10:8:1的體積比復合，采用氫氧化鈣調節PH值至8.0-8.5之間，用攪拌機攪拌0.5^1小時讓微生物菌體穩定和進入休眠狀態。復合物在常溫靜置2小時，灌裝密封，產品即為養殖污水處理菌群。
[0033]處理養殖污水菌群應用及其效果驗證供試養殖污水:2000頭養殖規模養豬場污水，日排污水量50~60m3,外界環境:氣溫22 ~35。。。
[0034]污水處理采用兩個串聯的水泥結構污水處理池，中間有柵格隔開；前一個污水處理池長X寬為500cmX 100cm,底部傾斜，進水口處水深200cm，出水口水深30cm，敞口，柵格厚度15cm，中間填充稻殼，第二個污水處理池長X寬X深為500cmX150cmX 200cm，兩個串聯處理池剖面如圖1示意。
[0035]在第一個污水處理池的污水中噴施或者撒施復合生物菌劑，投加量為每天早晚各噴施3L菌劑，對照處理不使用復合生物菌劑，12小時后在測定柵格前IOcm深水體以及第二個污水處理池出水口水體C0D、蛔蟲卵數量和大腸桿菌數量，采用蚊蠅黏貼紙測定第一個污水處理池單位面積產生的蚊蠅數量。
[0036]第一個污水處理池柵格處污水COD濃度、蛔蟲卵數量、大腸桿菌數量測定結果顯示如表1，應用復合生物菌劑處理水體COD濃度、蛔蟲卵數量、大腸桿菌數量分別比對照低68%,81%和67%。復合生物菌劑的處理出水口污水水體COD濃度、大腸桿菌數量分別比對照低72%和82%，施用復合生物菌劑處理沒有檢測到大腸桿菌(表2)。施用復合生物菌劑處理，柵格出水較快，不容易堵塞。相較于對照處理，施用復合生物菌劑處理，單位面積蚊子和蒼蠅數量分別下降50%和62% ；
表1處理池I污水指標
【權利要求】
1.一種畜禽養殖污水處理復合生物菌劑，其特征為復合生物菌劑含有解淀粉芽孢桿菌IAE (Bacillus amy1liquefaciens IAE)、棘抱木霉 12 (Trichoderma asperellum 12)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)； 其中所述的一株解淀粉芽抱桿菌IAE(Bacillus amy1liquefaciens IAE),于2013年3月15日保藏于中國典型微生物菌種保藏中心，保藏地址為武漢市武昌珞珈山，保藏編號CCTCC NO:M 2013086，簡稱為解淀粉芽孢桿菌 CCTCC NO:M 2013086 ； 所述的一株棘抱木霉12 (Trichoderma asperellum 12),于2013年5月16日保藏于中國典型微生物囷種保減中心，保減地址為武漢市武昌洛咖山，保減編號CCTCC NO:M2013213，簡稱為棘孢木霉 CCTCC NO:M 2013213。
2.權利要求1所述一種畜禽養殖污水處理復合生物菌劑的制備方法，其特征在于按如下步驟實現: 1)將解淀粉芽孢桿菌CCTCCNO:M 2013086菌株接種到液體種子培養基，培養的條件為:搖床震蕩170rpm，培養溫度37°C，培養24小時，菌落形成單位≥IXlO9 cfu ml-1 ;所用的液體種子培養基配方為，按照IL培養基配制:牛肉膏3g,蛋白胨10g, NaCl IOg,自來水 1000ml,pH 范圍 7.0-7.5，121°C滅菌 20min ;將解淀粉芽孢桿菌 CCTCC NO:M 2013086 種子按照5%體積百分比接種到液體發酵培養基，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為:培養溫度28~35°C，溶氧通氣量范圍為30~100%，15(T220rpm，發酵后期發酵液該菌株的菌落形成單位> IXlO9 cfu ml—1，發酵液低溫儲存備用；所用的液體發酵培養基的配方為，按照 IL 培養基配制:葡萄糖 80g，谷氨酸鈉 50g, (NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4.3H20 2g，MnSO4.7H20 0.25g, MnSO4-H2O 0.03 g，蒸餾水 1000ml，pH 值自然，115°C滅菌 30min ; 2)棘孢木霉CCTCCNO:M 2013213接種到PDA培養液中，進行液體種子培養，培養條件為:搖床震蕩120rpm，培養溫度25°C，培養72小時，菌落形成單位≥0.5X108 cfu ml—1 ;所用的液體的種子PDA培養基的配方為，按照IL培養基配制:用200 g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30 min,用紗布過濾后,濾液加20 g普通鹿糖,定容至1000 ml,pH值自然，115°C滅菌30 min ;將棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213種子按照10%體積百分比接種到液體發酵培養基，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為:初始PH自然，培養溫19~22°C，溶氧通氣量范圍為30~100%，9(Tl70rpm，發酵中后期形成菌絲球用轉速250rpm攪拌打碎成菌絲片段，發酵棘孢木霉CCTCC NO:M 2013213菌株的菌落形成單位≥0.5X IO8 cfuml—1，發酵液低溫存貯備用；所用液體發酵培養液配制方法為(以配制IL培養基為例):用100 g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30 min，經過濾后濾液中加5g普通蔗糖和2g水稻稻桿粉,定容至1000 ml, pH值自然，115°C滅菌30 min ； 3)蘇云金芽孢桿菌接種到液體種子培養基，培養條件為:搖床震蕩170rpm，培養溫度37°C，培養24小時，菌落形成單位≥IXlO9 cfu ml-1 ;所用的液體的種子培養基的配方為，按照IL培養基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g, NaCl IOg,自來水1000ml, pH范圍7.0-7.5，121°C滅菌20min ;將蘇云金芽孢桿菌種子按照5%體積百分比接種到液體發酵培養基，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為:初始PH范圍為7.0-7.5，培養溫度25~331:，溶氧通氣量范圍為30~100%，150-220rpm，發酵后期發酵液該菌株的菌落形成單位> IXlO9 cfuml—1，發酵液儲存備用；所用的液體發酵培養基的配方為，按照IL培養基配制:牛肉膏3g，蛋白胨 10g, NaCl IOg,自來水 1000ml, pH 范圍 7.0-7.5，121°C滅菌 20min ；. 4)將微生物發酵液菌種按照解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2013086:棘孢木霉CCTCCNO:M 2013213:蘇云金芽孢桿菌=10:8:1體積比復合，用氫氧化鈣調節PH值為8.0~8.5，后繼續攪拌機攪拌0.5^1小時讓微生物菌體穩定和進入休眠狀態，復合物在常溫靜置2小時，灌裝，即為一種畜禽養殖污水處理復合生物菌劑。
【文檔編號】C12N1/20GK103937695SQ201310307851
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年7月22日 優先權日:2013年7月22日
【發明者】陳立華, 邵孝侯, 王為木, 陳丹, 李圓圓 申請人:河海大學