一種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法
【專利摘要】本發明一種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法,屬于腫瘤細胞檢測和核酸試劑制備領域。由合成納米銀簇序列和與HIF有相互作用的識別序列組成的雙功能DNA。其次以這種雙功能DNA為模板，于檸檬酸鈉緩沖溶液中，利用NaBH4還原AgNO3的方法，成功合成了具有熒光的核酸納米銀簇。這種核酸納米銀簇在激發波長為510nm下能發射585nm的熒光，DNA-AgNCs的熒光量子產率為34.4%（以羅丹明B為參照），納米銀簇的大小為~2nm。本發明利用HIF與特定核酸序列的特異結合，將這種微觀結合信號放大為宏觀熒光變化，來實現HIF的探測，是一種簡便，直觀的分析方法。
【專利說明】—種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法
[0001]【技術領域】:
本發明屬于腫瘤細胞檢測和核酸試劑制備領域，特指一種納米核酸-銀簇(DNA-AgNCs)的制備方法及其在用熒光光譜法快速檢測細胞中HIF含量的運用。[0002]【背景技術】:
最近幾年，納米銀簇(AgNCs)因具有獨特的物理學、電學和光學性質，在化學傳感、生物傳感、成像及診斷等方面的應用，引起了很多的關注。鑒于納米銀易聚集不穩定的特點，用模板來合成較穩定納米銀簇的方法得到了廣泛研究，以樹枝狀大分子、小分子物質、多肽、蛋白質和DNA等為模板,成功的合成了在水中穩定的納米銀簇(J.Sharma, R.C.Rocha,M.Lj Phipps, H.C.Yehj K.A.Balatskyj Dung M.Vuj A.P.Shrevej J.H.Werner,J.S.Martinez, A DNA-templated uorescent silver nanocluster with enhancedstability, Nanoscale, 2012，4，4107 - 4110)。先后有以聚甲基丙烯酸、植酸鈉、雙功能絡合劑(翁建；崔強；丁家包，一種聚甲基丙烯酸微波合成熒光銀納米粒子的方法，中國發明專利201010540810.8 ;楊海峰；王娜，具表面增強拉曼散射活性的菜花狀納米金-銀合金的制備方法，中國發明專利201010133185.5 ;呂榮文；鄒偉；張淑芬，對含硝基的爆炸化合物高敏感檢測的銀納米簇及其制備，中國發明專利201110194650.0,)等為模板合成不同尺寸和用途銀納米粒子。由于Ag+和Ag與DNA上的胞嘧啶有很高的親和性，以多胞嘧啶核苷酸的DNA為模板可合成穩定、有優異的光譜和光物理性的銀簇。DNA不僅是生命體中重要的遺傳物質，與蛋白質的翻譯和酶的形成有中要關聯，還是許多物質的目標分子，因此，基于DNA的納米銀簇(DNA-AgNCs)為探測各種疾病治療和診斷中重要的分子提供強大平臺(H.C.Yeh, J.Sharma, 1.M.Shih, D.M.Vu, J.S.Martinez, J.H.Werner, Afluorescence light-up Ag nanocluster probe that discriminates single-nucleotidevariants by emission color, J.Am.Chem.Soc., 2012, 134, 11550 11558)。 缺氧誘導因子(HIF)是激活線粒體氧化磷酸化和無氧酵解的開關，通過誘導糖酵解酶和葡萄糖轉運子基因的表達，激活和促進糖酵解過程。腫瘤細胞中HIF高表達因此，HIF成為腫瘤重要標志之一，探測腫瘤細胞HIF的變化對于腫瘤診斷和治療具有重大意義。目前HIF-1的體外檢測一般采用凝膠電泳的方法，此方法有檢測靈敏度較低，操作復雜，周期長等缺點。因此，開發簡單快速，靈敏度高，特異性強，準確檢測細胞內HIF的分析技術仍然是一個挑戰。
[0003]
【發明內容】
:
本發明設計了一種新的脫氧核酸(DNA )序列:5 ’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3 ’，其特點為由合成納米銀簇序列(5 ’ CCTCCTTCCTCC3 ’)和與HIF有相互作用的識別序列(5，CTACGTGCT3)組成的雙功能DNA序列為5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’。其次以這種雙功能DNA為模板，于檸檬酸鈉緩沖溶液中，利用NaBH4還原AgNO3的方法，成功合成了具有熒光的核酸納米銀簇(DNA-AgNCs )。這種核酸納米銀簇(DNA-AgNCs)在激發波長為510 nm下能發射585 nm的熒光，DNA-AgNCs的熒光量子產率為34.4% (以羅丹明B為參照)，納米銀簇的大小為~2 nm。其585 nm的熒光能被DNA的互補序列(AGCACGTAG)及HIF高表達的腫瘤細胞全蛋白淬滅，說明該核酸納米銀簇(DNA-AgNCs)是一種靈敏的熒光探針，可用于定性分析細胞全蛋白中HIF的含量，并可用于區分HIF高表達的腫瘤細胞和正常細胞。此熒光探針4°C環境中可保存大于4個月熒光未見明顯變化。
[0004]一種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法，按照下述步驟進行: 以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列為模板，在檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入由合成納
米銀簇序列5’ CCTCCTTCCTCC3’和與HIF有相互作用的識別序列5’ CTACGTGCT3?組成雙功能DNA，序列為5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’和AgN03混勻后放置到水浴中，20-68°C加熱0.5-2 min,最佳lmin，后緩慢降溫到室溫1-2 h,最佳Ih ;加入NaBH4溶液將DNA-Ag+還原成DNA-Ag，轉移到4°C環境中避光放置1-4天，最佳3天，即可得到穩定的熒光探針。
[0005]其中所述的檸檬酸鈉緩沖溶液的pH 5.0-6.0，濃度為10-20 mM，最佳條件pH5.0,濃度為 10 mM。
[0006]其中所述的雙功能DNA與Ag+的摩爾比為1:10 -1:20，最佳摩爾比為1:15。
[0007]其中所述的NaBH4與Ag+的摩爾比:1:2- 4:1，最佳摩爾比:1:1。
[0008]本發明利用HIF與特定核酸序列的特異結合，將這種微觀結合信號放大為宏觀熒光變化，來實現HIF的探測，是一種簡便，直觀的分析方法。
[0009]【專利附圖】
【附圖說明】:
圖1為DNA-AgNCs的熒光激發和發射光譜圖；
圖2為DNA-AgNCs檸檬酸鈉緩沖液中逐漸增加正常細胞全蛋白㈧，H印G-2細胞全蛋白⑶的熒光圖。
[0010]【具體實施方式】:
核酸納米銀簇(DNA-AgNCs)的合成
實施例1 (核酸納米銀簇(DNA-AgNCs)最佳制備方案):以5’CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列為樽板，在3 mL檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 5.0，10 mM)中，加入 400 umol 的雙功能 DNA (DNA 的序列是“5，CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’ ”)(序列由我們自己設計，用上海生物生工公司DNA合成儀合成，經過HPLC純化，質譜驗證序列為5’CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’ )和 6mmol AgNO3 (其中 DNA 與 Ag+ 的摩爾比為 1:15 )混勻后放置到水浴中，68°C加熱穩定I min后，開始降溫，經過2h后，降為室溫。在穩定于室溫的反應液中加入NaBH4溶液(其中NaBH4與Ag+的摩爾比2:1)，于室溫靜止放置15 min，將DNA-Ag+還原成DNA-Ag，將反應液轉移到4°C環境中避光放置3天，即可得到穩定的熒光探針溶液5mL。以激發510 nm獲得波長585 nm的熒光，熒光量子產率為34.4% (以羅丹明B為參照)。納米粒徑2 nm。
[0011]實施例2:以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列為樽板，在3 mL檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 5.4, 10 mM)中，加入400umol的模板DNA和8 mmol AgNO3 (其中DNA與Ag+的摩爾比為1:20 )混勻后放置到水浴中，68°C加熱穩定0.5 min后，開始降溫，經過Ih后，降為室溫。在穩定于室溫的反應液中加入NaBH4溶液(其中NaBH4與Ag+的摩爾比2:1)，于室溫靜止放置20 min，將DNA-Ag+還原成DNA-Ag，將反應液轉移到4°C環境中避光放置I天，即可得到DNA-AgNCs熒光探針溶液5mL。以激發510 nm獲得波長585 nm的熒光，熒光量子產率為11.4% (以羅丹明B為參照)。
[0012]實施例3:以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列為模板，在6 mL檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 6.0, 20 mM)中，加入 400 umol 的模板 DNA 和 8 mmol AgNO3 (其中 DNA 與 Ag+的摩爾比為1:20 )混勻后放置到水浴中，30°C加熱穩定2 min后，開始降溫，經過1.5 h后，降為室溫。在穩定于室溫的反應液中加入NaBH4溶液(其中NaBH4與Ag+的摩爾比4:1)，于室溫靜止放置10 min，將DNA-Ag+還原成DNA-Ag，將反應液轉移到4°C環境中避光放置I天，即可得到DNA-AgNCs熒光探針溶液6 mL。以激發510 nm獲得波長585 nm的熒光，熒光量子產率為3.4% (以羅丹明B為參照)。
[0013]實施例4:以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列為模板，在3 mL檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 5.0, 10 mM)中，加入 400 umol 的模板 DNA 和 6 mmol AgNO3 (其中 DNA 與 Ag+的摩爾比為1:15 )混勻后放置到水浴中，40°C加熱穩定I min后，開始降溫，經過1.5 h后，降為室溫。在穩定于室溫的反應液中加入NaBH4溶液(其中NaBH4與Ag+的摩爾比2:1)，于室溫靜止放置20 min,將DNA-Ag+還原成DNA-Ag，將反應液轉移到4°C環境中避光放置3天，即可得到DNA-AgNCs熒光探針溶液5 mL。以激發510 nm獲得波長585 nm的熒光，熒光量子產率為16.7% (以羅丹明B為參照)。
[0014]
核酸納米銀簇(DNA-AgNCs)與DNA互補序列及細胞全蛋白的作用 實施例5 DNA-AgNCs熒光探針溶液與互補序列的作用
步驟一.取合成好的DNA-AgNCs，配成4uM的DNA-AgNCs檸檬酸鈉緩沖液(pH 7.0，10mM)，放于4°C避光環境中。
[0015]步驟二.配置濃度為IOuM的DNA互補序列。
[0016]步驟三.在4uMDNA _AgNCs中加入DNA互補序列。使互補序列的最終濃度分別為
O,0.7，1.4，2.1，2.8，3.5，4.2 uM)，并分別測熒光光譜。整個過程樣品應保持在4°C環境下。
[0017]測量結果顯示互補序列使DNA-AgNCs的熒光淬滅，表明DNA-AgNCs與互補序列結合導致納米其熒光淬滅。
[0018]實施例6 DNA-AgNCs熒光探針與腫瘤細胞H印G_2全蛋白的作用
步驟一.取合成好的DNA-AgNCs，配成4uM的DNS-AgNCs檸檬酸鈉緩沖液(pH 7.0，10mM)，放于4°C避光環境中。
[0019]步驟二.用細胞裂解法提取H印G-2細胞全蛋白，濃度為2 mg/mL。
[0020]步驟三.在4uM DNA-AgNCs中加入H印G-2全蛋白，使全蛋白的最終濃度分別為
O,0.7，1.3，2.0，2.7，3.3，4.7，6.0，ug/mL.，并分別測熒光光譜。整個過程樣品應保持在4°C環境下。
[0021]測量結果見附圖2，圖2顯示腫瘤細胞全蛋白顯著淬滅DNA-AgNCs的熒光。
[0022]實施例7 DNA-AgNCs熒光探針與正常肝細胞全蛋白的作用
步驟一.取合成好的DNA-AgNCs，配成4uM的DNS-AgNCs檸檬酸鈉緩沖液(pH 7.0，10mM)，放于4°C避光環境中。
[0023]步驟二.用細胞裂解法提取正常肝細胞wrl-68細胞全蛋白，濃度為2 mg/mL。
[0024]步驟三.在4uMDNA_AgNCs中加入wrl_68全蛋白，使全蛋白的最終濃度分別為0，
0.7，1.3，2.0，2.7，3.3，4.7，6.0，ug/mL.，并分別測熒光光譜。整個過程樣品應保持在4°C環境下。[0025]測量結果見附圖2.圖2顯示正常肝細胞wrl-68全蛋白使DNA-AgNCs的熒光增強。
[0026]核酸納米銀簇(DNA-AgNCs)與腫瘤細胞全蛋白和正常細胞全蛋白的作用參見實施例6和實施例7，具體特征為:將HIF高表達的腫瘤細胞H印G-2的細胞全蛋白，逐量加到DNA-AgNCs檸檬酸鈉緩(pH 7.0)沖溶液中，分別測量其熒光光譜的變化(圖2)，可發現隨著細胞全蛋白量的增加，熒光逐漸減弱。由于ctDNA和BSA均使核酸納米銀簇(DNA-AgNCs)探針的熒光強度增強，可排除細胞中核酸和蛋白物質的影響，對比試驗也顯示正常細胞的全蛋白使核酸納米銀簇(DNA-AgNCs)熒光增強，由于H印G-2中HIF高表達(HIF的含量通過電泳分析得到證實)，HIF與核酸納米銀簇(DNA-AgNCs)特異性結合作用使其熒光淬滅，熒光的降低歸于HIF與DNA-AgNCs的作用。結果顯示核酸納米銀簇(DNA-AgNCs)可作為細胞中HIF變化的定性分析核酸納米銀簇(DNA-AgNCs)熒光探測試劑，也可用去區別腫瘤細胞與正常細胞。`
【權利要求】
1.一種核酸序列5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’,其特征為:由合成納米銀簇序列(5’ CCTCCTTCCTCC3’ )和與HIF有相互作用的識別序列(5’ CTACGTGCT3)組成雙功能核酸(DNA),質譜驗證序列為 5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’。
2.一種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法，其特征在于按照下述步驟進行: 以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列為模板，在檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入由合成納米銀簇序列5’ CCTCCTTCCTCC3’和與HIF有相互作用的識別序列5’ CTACGTGCT3組成雙功能DNA，序列為5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’和AgN03混勻后放置到水浴中，20-68°C加熱0.5-2 min,最佳lmin，后緩慢降溫到室溫1-2 h,最佳Ih ;加入NaBH4溶液將DNA-Ag+還原成DNA-Ag，轉移到4°C環境中避光放置1-4天，最佳3天，即可得到穩定的熒光探針。
3.根據權利要求2所述的一種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法，其特征在于其中所述的檸檬酸鈉緩沖溶液的pH 5.0-6.0，濃度為10-20 mM。
4.根據權利要求2所述的一種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法，其特征在于其中所述的雙功能DNA與Ag+的摩爾比為1:10 -1:20。
5.根據權利要求2所述的一種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法，其特征在于其中所述的NaBH4與Ag+的摩爾比:1:2- 4:1。
6.根據權利要求 2所述的一種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法，其特征在于其中所述的檸檬酸鈉緩沖溶液的PH5.0，濃度為10 mM。
7.根據權利要求2所述的一種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法，其特征在于其中所述的雙功能DNA與Ag+的摩爾比1:15。
8.根據權利要求2所述的一種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法，其特征在于其中所述的NaBH4與Ag+的摩爾比為1:1。
9.權利要求2制備的熒光納米核酸銀在HIF檢測中的運用，可用于定性分析細胞全蛋白中HIF的含量，并可用于區分HIF高表達的腫瘤細胞和正常細胞。
【文檔編號】C12N15/11GK103602670SQ201310338051
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年8月6日 優先權日:2013年8月6日
【發明者】陳秋云, 趙婷婷, 楊歡 申請人:江蘇大學