一株高產克拉維酸的棒狀鏈霉菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株高產克拉維酸的棒狀鏈霉菌及其應用。本發明所提供的高產克拉維酸的棒狀鏈霉菌具體為棒狀鏈霉菌（Streptomyces?clavuligerus）16CF10，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?No.7915。本發明以棒狀鏈霉菌（Streptomyces?clavuligerus）70116為出發菌株，對其進行代謝工程改造，誘變后得到棒狀鏈霉菌（Streptomyces?clavuligerus）16CF10?CGMCC?No.7915。實驗證明，發酵培養該菌株，其產克拉維酸的量達到2.25g/L發酵液，較出發菌株棒狀鏈霉菌（Streptomyces?clavuligerus）70116提高了約51%，可見棒狀鏈霉菌（Streptomyces?clavuligerus）16CF10?CGMCC?No.7915具有廣闊工業應用的前景。
【專利說明】一株高產克拉維酸的棒狀鏈霉菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物領域，涉及一株高產克拉維酸的棒狀鏈霉菌及其應用。【背景技術】
[0002]隨著抗生素的大量使用，病原菌耐藥性問題日益嚴重。青霉素、頭孢菌素等β -內酰胺類抗生素的濫用導致部分病原菌產生β_內酰胺酶，從而降解該類抗生素產生耐藥性。克拉維酸(clavulanic acid),又稱棒酸，是棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)產生的次級代謝產物。克拉維酸單獨作用時抗菌活性很弱，但它具有獨特的3R，5R立體構像，使其具有光譜的、不可逆的β_內酰酶抑制活性，也是第一個被發現并成功應用于臨床的β_內酰胺酶抑制劑。臨床應用中，克拉維酸常與β_內酰胺類抗生素如阿莫西林(311101；[(^11；[11)、替卡西林(1:；^31^；[11；[11)聯合用藥,制成酶抑制劑-抗生素的聯合制劑,可在不同程度上保護β-內酰胺類抗生素不被β-內酰胺酶分解失活，從而提高該抗生素對產酶耐藥菌的抗菌活性，提高臨床療效。由于其重要的臨床應用價值，克拉維酸的市場需求廣大。目前克拉維酸的工業生產主要依靠微生物發酵。因此，改造克拉維酸產生菌獲得高產工程菌具有重要的工業應用價值。
[0003]野生型棒狀鏈霉菌的克拉維酸產量很低，遠遠不能滿足工業發酵的需要，所以目前工業應用的菌株往往都是通過多輪物理、化學等誘變篩選得到的誘變株。隨著對克拉維酸生物合成基礎研究的深入，多種理性代謝工程改造手段成功的提高了野生菌株的克拉維酸產量，但還是無法超越工業上廣泛應用的誘變菌株。因此，以工業應用的誘變菌株作為出發菌株，通過代謝工程改造的手段提高其克拉維酸產量具有重要的實際應用價值。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一株高產克拉維酸的棒狀鏈霉菌及其應用。
[0005]本發明所提供的棒狀鏈霉菌具體為棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)16CF10。該菌株是以棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)70116為出發菌株,對其進行代謝工程改造，誘變后得到的新菌株。該菌株已于2013年07月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC N0.7915。
[0006]本發明的再一個目的是提供一種菌劑。
[0007]本發明所提供的菌劑的活性成分為所述棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915。
[0008]所述棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus)16CF10 CGMCC N0.7915或所述菌劑在制備克拉維酸中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0009]本發明的還一個目的是提供一種制備克拉維酸的方法。
[0010]本發明所提供的制備克拉維酸的方法，可包括如下步驟:發酵培養所述棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915,收集發酵產物，獲得克拉維酸。[0011]在上述方法中，所述發酵培養的培養基(發酵培養基)的組成如下:黃豆粉20±2g/L，糊精 10±lg/L，甘油 15±lmL/L，KH2PO40.6 ± 0.lg/L，3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(MOPS) 8±lg/L，微量元素溶液1±0.2mL/L，余量為水；pH為7.0±0.2 ;所述微量元素中，溶劑為水，溶質及其濃度如下=FeSO4.7H201.0±0.2g/L，MnCl2.4H201.0±0.2g/L，ZnSO4.7Η201.0±0.2g/L, CaCl2.3Η201.3±0.2g/L。
[0012]在本發明中，所述發酵培養的培養基(發酵培養基)的組成具體如下:黃豆粉20g/L,糊精 10g/L,甘油 15mL/L, KH2PO40.6g/L，3_(N_ 嗎啡啉)丙磺酸(MOPS) 8g/L，微量元素溶液lmL/L,余量為水；pH為7.0±0.2 ;所述微量元素中，溶劑為水，溶質及其濃度如下:FeSO4.7Η201.0g/L, MnCl2.4Η201.0g/L, ZnSO4.7Η201.0g/L, CaCl2.3Η201.3g/L。
[0013]在上述方法中，在發酵培養前，還包括利用種子培養基培養所述棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915 獲得種子液的步驟,再將所述種子液接種到上述發酵培養基中進行發酵培養。
[0014]所述種子培養基與所述發酵培養基的組成完全相同。
[0015]所述“利用種子培養基培養所述棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)16CF10 CGMCC N0.7915”，培養溫度為28°C，培養時間為48h，培養方式為旋轉震蕩培養(轉速為250rpm，旋轉半徑與NBS Excella E25型號搖床的旋轉半徑相同)。
[0016]在上述方法中，所述發酵培養可為搖瓶發酵培養；所述搖瓶發酵培養的培養時間為48-96h (如72h);所述搖瓶發酵培養的培養溫度為28°C ;所述搖瓶發酵培養的震蕩轉速為200-300rpm，如250rpm，(旋轉半徑與NBS Excella E25型號搖床的旋轉半徑相同)。
[0017]在本發明的一個實施例中，進行所述搖瓶發酵培養時，所用搖床的型號為NBSExcella E25。
[0018]在上述方法中，所述發酵培養也可為發酵罐發酵培養；所述發酵罐發酵培養的培養時間為6-7天(如6天)；所述發酵罐發酵培養的培養溫度為28°C ;所述發酵培養過程中的通氣量為0.5-1.0V / V.min，如0.5V / V.min (所述通氣量以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比來表示)；所述發酵培養過程中的攪拌轉速為300-500rpm，如400rpm。
[0019]在本發明的一個實施例中，進行所述發酵罐發酵培養時，所用發酵罐的型號為NBSBioFlo/CelliGen 115。
[0020]本發明的又一個目的是提供所述菌劑的制備方法。
[0021]所述菌劑的制備方法,具體可包括如下步驟:將所述棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915作為活性成分，得到所述菌劑。
[0022]本發明以棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116為出發菌株,對其進行代謝工程改造，誘變后得到棒狀鏈霉菌(Sti^ptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCCN0.7915。發酵罐發酵培養該菌株144h (6天)，發現其產克拉維酸的量達到2.25g/L發酵液，較出發菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116提高了約51%,該菌株具有廣闊工業應用的前景。
[0023]保藏說明
[0024]菌種名稱:棒狀鏈霉菌
[0025]拉丁名:(Streptomycesclavuligerus)
[0026]菌株編號:16CF10[0027]保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0028]保藏機構簡稱:CGMCC
[0029]地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號
[0030]保藏日期:2013年07月12日
[0031]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.7915
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1 為搖瓶發酵培養棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCCN0.7915發酵72h后發酵液中克拉維酸產量的測定結果。以發酵液中克拉維酸色譜峰的峰面積表示。
[0033]圖2 為棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915 菌株發酵液和克拉維酸標準品溶液的高效液相色譜圖。其中，I表示棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915菌株發酵液；2表示克拉維酸標準品溶液。
[0034]圖3為發酵罐發酵培養過程中不同時間點取樣的發酵液中克拉維酸產量及棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915 的生長情況測定結果。其中，A表示出發菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116發酵液中克拉維酸色譜峰的峰面積；B表不棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCCN0.7915發酵液中克拉維酸色譜峰的峰面積；C表示出發菌株棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus) 70116利用二苯胺法測定生物量的光吸收值(A595)山表示棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)16CF10 CGMCC N0.7915 利用二苯胺法測定生物量的光吸收值(A595)。
【具體實施方式】
[0035]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0036]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0037]棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116:為“李佳.1.報告基因法篩選克拉維酸高產菌2.報告基因法比較兩種放線菌啟動子的活性.首都師范大學，碩士論文，2009”一文中記載的“棒狀鏈霉菌(Sti^ptomyces clavuligerus)工業菌株70116”，為海正藥業贈送。
[0038]克拉維酸標準品=Sigma-Aldrich公司產品，其產品目錄號為33454。
[0039]實施例1、棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10的獲得及鑒定
[0040]一、棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 的獲得
[0041]利用組成型表達的紅霉素啟動子(ermE*p)通過整合型載體對靶基因glpFl和ceas2在工業菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)70116中分別進行過表達，研究其對克拉維酸產量的影響。結果表明這些靶基因的單獨過表達都有利于工業菌株中克拉維酸產量的提高。
[0042]接著，本發明的發明人構建同時監測雙靶點表達的報告質粒，將靶基因glpFl與ceas2兩兩組合后構建載體導入工業菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)70116。接著通過NTG誘變后篩選報告基因同時高表達的誘變株，得到其中一株重組菌，將其命名為菌株16CF10。
[0043]二、棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 的鑒定
[0044]從以下幾個方面鑒定步驟一得到的菌株16CF10:
[0045]1、形態學特征鑒定[0046]接種YD固體培養基，培養過程中觀察形態變化。3天左右長出基內菌絲，5-7天產生白色氣生菌絲，10-14天產生灰綠色孢子。
[0047]2、生理生化特性分析
[0048]革蘭氏陽性細菌。
[0049]3、RpoD基因和gap I基因序列同源性分析
[0050]對菌株16CF10的rpoD基因和gapl基因進行序列測定，其RpoD基因的測序結果為序列表中序列1，其gapl基因的測序結果為序列表中序列2。同時對出發菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116 的 rpoD 基因和 gapl 基因序列進行測序。
[0051]在線BLAST比對的結果表明，菌株16CF10的rpoD基因和gapl基因的序列與出發菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116的rpoD基因和gapl基因序列同源性為100%,同時與NCBI上公開的野生型棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) ATCC27064 菌株的 rpoD 基因(GenBank:ADWJ01000053.1)和 gapl 基因(GenBank:DQ178995.1)序列同源性也為100%。
[0052]鑒于上述形態、生理生化特征分析和rpoD和gapl基因序列同源性分析結果，將步驟一得到的菌株16CF10鑒定為棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)。該菌株已于2013年07月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJi址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC N0.7915。
[0053]實施例2、發酵棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus)16CF10 CGMCC N0.7915生產克拉維酸
[0054]固體YD培養基:溶劑為水，溶質及其濃度如下:酵母提取物(Difco公司產品)
4.0g/L ;麥芽糖提取物(0XID 公司產品)10g/L ;葡萄糖 4.0g/L ；MgCl2 2.0g/L ；CaCl2 1.5g/L;瓊脂 2.0g/L ；pH7.50
[0055]種子培養基(與發酵培養基相同):黃豆粉20g/L ;糊精(國藥集團化學試劑有限公司產品，其產品目錄號為69009992)10g/L ;甘油15mL/L ；KH2PO4 0.6g/L ；3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(MOPS)8.0g/L ;微量元素lmL/L ；pH7.0±0.2。各濃度為相應組分在培養基中的終濃度。其中，微量元素配方如下(100ml) =FeSO4.7H20 IOOmg ；MnCl2.4H20 IOOmg ；ZnSO4.7H20IOOmg ；CaCl2.3H20 130mg ;余量為水。
[0056]一、搖瓶培養棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915生產克拉維酸
[0057]1、種子液培養
[0058]將實施例1 得到的棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCCN0.7915接種到固體YD培養基上，于28°C培養7天后收集孢子接種到種子培養基中，250rpm (搖床型號NBS Excella E25)，28°C培養48h后得到種子液。同時設置出發菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116 作為對照。
[0059]2、搖瓶培養[0060]將步驟I得到的種子液接種到搖瓶(250mL搖瓶中含50mL發酵培養基)中進行發酵培養，接種量為5% (體積分數)。
[0061]發酵條件:溫度28°C，旋轉震蕩培養，轉速250rpm (搖床型號NBS Excella E25)，發酵72h。
[0062]發酵結束后測定發酵液中克拉維酸產量。實驗重復三次，結果取平均值。
[0063]3、測定方法
[0064]采用高效液相色譜法測定發酵液中克拉維酸的產量，具體如下:
[0065]A.色譜條件
[0066]色譜條件:色譜柱為反相C18柱；流動相為6% (體積百分含量)甲醇+94% (體積百分含量)0.1M磷酸二氫鈉水溶液(冰醋酸調節pH3.68);洗脫程序為等度洗脫；流速為Iml/min ;進樣體積為50 μ L ;檢測波長為312nm。
[0067]B.待測發酵液中克拉維酸含量的測定
[0068]發酵樣品衍生處理:配置咪唑試劑(咪唑試劑:溶解8.25g咪唑到65ml水中，用5M鹽酸調PH到6.8±0.05后，用水增容至100ml )，待測發酵液與等體積咪唑試劑混合后，37°C反應30min后HPLC分析克拉維酸產量。
[0069]將經過如上處理的待測發酵液按照步驟A所述的色譜條件進行高效液相色譜分析，以濃度確定的克拉維
【權利要求】
1.棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus) 16CF10,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.7915。
2.一種菌劑，其特征在于:所述菌劑的活性成分為權利要求1所述的棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915。
3.權利要求1 所述的棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCCN0.7915或權利要求2所述的菌劑在制備克拉維酸中的應用。
4.一種制備克拉維酸的方法，包括如下步驟:發酵培養權利要求1所述的棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915，收集發酵產物，獲得克拉維酸。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述發酵培養的培養基的組成如下:黃豆粉 20±2g/L，糊精 10±lg/L，甘油 15±lmL/L，KH2PO40.6±0.lg/L，3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(MOPS) 8±lg/L，微量元素溶液 1±0.2mL/L，余量為水；pH 為 7.0±0.2 ; 所述微量元素溶液，溶劑為水，溶質及其濃度如下=FeSO4.7H201.0±0.2g/L，MnCl2.4Η201.0±0.2g/L, ZnSO4.7Η201.0±0.2g/L, CaCl2.3Η201.3±0.2g/L。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述發酵培養為搖瓶發酵培養；所述搖瓶發酵培養的培養時間為48-96h ;所述搖瓶發酵培養的培養溫度為28°C ;所述搖瓶發酵培養的震蕩轉速為200-300rpm。
7.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述發酵培養為發酵罐發酵培養；所述發酵罐發酵培養的培養時間為6-7天；所述發酵罐發酵培養的培養溫度為28°C ;所述發酵培養過程中的通氣量為0.5-1.0V / V.π?η;所述發酵罐發酵培養的攪拌轉速為300_500rpm。
8.權利要求2所述菌劑的制備方法，包括如下步驟:將權利要求1所述的棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915 作為活性成分，得到所述菌劑。
【文檔編號】C12P17/18GK103468607SQ201310363352
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月20日 優先權日:2013年8月20日
【發明者】楊克遷, 趙友寶, 向四海 申請人:中國科學院微生物研究所