一種熱穩定性提高的淀粉酶突變體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種熱穩定性提高的淀粉酶突變體及其制備方法和應用，屬于酶工程領域。本發明利用分子生物學技術進行多輪定點突變獲得了熱穩定性提高的淀粉酶突變體，所得淀粉酶在60℃的半衰期由對照（突變前）例的3.2min提高到23.9min。利用此策略可以顯著提高淀粉酶的熱穩定性，為其工業化生產提供了基礎。此策略對其它酶的性質改造具有重要的指導意義。
【專利說明】一種熱穩定性提高的淀粉酶突變體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種熱穩定性提高的淀粉酶突變體及其制備方法，屬于酶工程領域。【背景技術】
[0002]α -淀粉酶(EC3.2.1.1)能夠水解淀粉分子內部α -1, 4_葡萄糖苷鍵，水解產物為糊精、麥芽寡糖、麥芽糖和葡萄糖，在食品、紡織、醫藥和飼料等工業領域廣泛應用。堿性淀粉酶在強堿性條件下水解淀粉的潛力，使其可以應用于淀粉加工、紡織退漿以及用于自動洗衣機的洗滌劑添加等工業領域。堿性淀粉酶退漿主要應用α-淀粉酶催化淀粉大分子鏈水解，生成分子質量較小、黏度較低和溶解度較高的低分子化合物，再經水洗即可去除。這種方法可以節省大量時間、降低環境污染，同時將對紡織物本身造成的損壞降至最低程度，因而受到印染工作者的重視。為了滿足印染行業連續化生產的要求，需要淀粉酶能夠在高溫下使用，但是目前大多數淀粉酶在高溫下的穩定性較差。
[0003]定點突變和定向進化是提高工業用酶熱穩定性的兩種主要手段。定向進化雖然不需要準確的酶分子結構信息，但是需要建立一種能夠從大量的突變株中快速簡便的篩選到優勢菌株的方法。而定點突變，與定向進化相比，是一種更迅速、直接且節約成本的提高酶熱穩定性的方法。本發明基于已得到的堿性淀粉酶在大腸中的表達平臺，利用定點突變技術，對堿性淀粉酶進行分子改造，以期得到更適合工業應用的熱穩定性提高的堿性淀粉酶。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的第一個問題是提供一種熱穩定性提高的淀粉酶突變體，其相對親本淀粉酶具有一個或多個氨基酸發生突變。
[0005]所述淀粉酶親本的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]所述發生突變的氨基酸 位于淀粉酶蛋白結構的外表面(溶劑可接觸面積大于100)或內表面(溶劑可接觸面積小于5)，所述突變可以增強蛋白表面的靜電相互作用或增強蛋白內部疏水相互作用。
[0007]所述一個氨基酸發生突變是淀粉酶第66位絲氨酸替換成纈氨酸、第98位賴氨酸替換成精氨酸、第166位天冬酰胺替換成精氨酸、第192位賴氨酸替換成精氨酸、第258位絲氨酸替換成精氨酸、第275位天冬酰胺替換成精氨酸、第317位谷氨酰胺替換成精氨酸、第349位谷氨酰胺替換成纈氨酸或第438位絲氨酸替換為纈氨酸，所得單突變體分別命名為 S66V、K98R、N166R、K192R、S258R、N275R、Q317R、Q349V、S438V。
[0008]所述多個氨基酸發生突變包括:
[0009](I)第98位賴氨酸替換成精氨酸、第166位天冬酰胺替換成精氨酸、第192位賴氨酸替換成精氨酸、第258位絲氨酸替換成精氨酸、第275位天冬酰胺替換成精氨酸及第317位谷氨酰胺替換成精氨酸，所得6重突變體命名為K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R ；
[0010](2)第66位絲氨酸替換成纈氨酸、第349位谷氨酰胺替換成纈氨酸及第438位絲氨酸替換為纈氨酸，所得三重突變體命名為S66V/Q349V/S438V ；
[0011](3)將(I)、(2)中所述的9個位點同時進行突變，所得9重突變體命名為S66V/K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R/Q349V/S438V。
[0012]本發明還提供一種所述淀粉酶突變體的制備方法，具體步驟如下:
[0013]I)根據SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，采用化學全合成的方法全合成基因后克隆到質粒pET-22b (+)中，構建重組質粒pAmyQ ；
[0014]2)利用Swiss-model軟件對源自嗜堿芽孢桿菌淀粉酶(SEQ ID N0.1)進行模擬，獲得淀粉酶空間結構，確定在淀粉酶催化結構域內進行氨基酸替換的位點；
[0015]3)設計突變引物，通過PCR對淀粉酶基因序列進行定點突變，獲得含有突變淀粉酶序列的重組載體；
[0016]4)將突變后重組載體轉化大腸桿菌BL21，誘導表達，離心收集發酵上清，獲得淀粉酶突變體。
[0017]本發明提供的堿性淀粉酶單突變體或多重突變體熱穩定性均顯著提高，其中，9個位點同時突變的突變體在60°C的半衰期由對照(突變前)的3.2min的提高到23.9min。相對于采用篩菌或誘變等手段，縮短了酶學性質改造時間。將該堿性淀粉酶突變體應用于紡織、洗滌劑、制革等領域，可以在耐溫耐堿環境下高效降解淀粉，具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1:pAmyQ的質粒圖譜。
`[0019]圖2:淀粉酶3D空間結構。
【具體實施方式】
[0020]實施例1淀粉酶突變位點的確定及突變體的獲得
[0021 ] 通過Swiss-model軟件對源自嗜堿芽孢桿菌的淀粉酶(SEQ ID N0.1)進行模擬，以獲得的淀粉酶空間結構模型為基礎，利用Macrodox軟件計算出酶蛋白分子內所有氨基酸的溶劑可接觸面積。一方面，選取位于蛋白表面的(溶劑可接觸面積大于100)賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸，將它們替換成精氨酸，增強蛋白表面的靜電相互作用，同時分析相應位點的氨基酸突變對酶分子內部形成氫鍵、鹽橋的影響，確定進行以下位置處的氨基酸替換:Lys98Arg、Asnl66Arg> Lysl92Arg> Ser258Arg> Asn275Arg 和 Gln317Arg。另一方面，選取位于蛋白內部的(溶劑可接觸面積小于5)天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸，將它們替換成纈氨酸，增強蛋白內部疏水相互作用；同時分析相應位點的氨基酸突變對酶分子內部疏水相互作用的影響，確定進行以下位置處的氨基酸替換:Ser66Val、Gln349Val和Ser438Val。基于以上分析，最終確定在如下位置處進行氨基酸替換:Ser66Val、Lys98Arg、Asnl66Arg、Lysl92Arg、Ser258Arg、Asn275Arg、Gln317Arg、Gln349Val 和 Ser438Val。
[0022]根據SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，采用化學全合成的方法全合成相應基因后，克隆到質粒pET-22b (+)中，構建重組質粒pAmyQ。
[0023]針對不同位點的定點突變，設計相對應的定點突變引物(表1)。以重組質粒pAmyQ為模版，利用定點突變引物對淀粉酶進行定點突變。采用PCR酶，利用突變引物對重組質粒PAmyQ進行擴增。將擴增后片段利用膠回收試劑盒進行回收純化。將獲得的純化后片段，采用磷酸化試劑盒對片段兩端進行磷酸化。將磷酸化后的片段，利用連接酶進行連接，獲得單點突變后的重組質粒。將重組質粒轉化大腸桿菌宿主BL21，進行誘導表達，獲得單點突變后的重組淀粉酶。以單點突變后獲得的重組質粒為模板進行下一輪的突變，最終獲得多個位點突變后的重組淀粉酶。
[0024]表1淀粉酶突變引物序列
[0025]
【權利要求】
1.一種熱穩定性提高的淀粉酶突變體，其特征在于，相對于具有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的淀粉酶，在一個或多個氨基酸位點發生突變。
2.根據權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述發生突變的氨基酸位于淀粉酶蛋白結構的外表面或內表面。
3.根據權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述發生突變的氨基酸是第66位絲氨酸、第98位賴氨酸、第166位天冬酰胺、第192位賴氨酸、第258位絲氨酸、第275位天冬酰胺、第317位谷氨酰胺、第349位谷氨酰胺或第438位絲氨酸。
4.根據權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述I個氨基酸發生突變是淀粉酶第66位絲氨酸替換成纈氨酸、第98位賴氨酸替換成精氨酸、第166位天冬酰胺替換成精氨酸、第192位賴氨酸替換成精氨酸、第258位絲氨酸替換成精氨酸、第275位天冬酰胺替換成精氨酸、第317位谷氨酰胺替換成精氨酸、第349位谷氨酰胺替換成纈氨酸或第438位絲氨酸替換為纈氨酸，所得單突變體分別命名為S66V、K98R、N166R、K192R、S258R、N275R、Q317R、Q349V、S438V。
5.根據權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述多個氨基酸位點發生突變是第98位賴氨酸替換成精氨酸、第166位天冬酰胺替換成精氨酸、第192位賴氨酸替換成精氨酸、第258位絲氨酸替換成精氨酸、第275位天冬酰胺替換成精氨酸及第317位谷氨酰胺替換成精氨酸，所得6重突變體命名為K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R。
6.根據權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述多個氨基酸位點發生突變是第66位絲氨酸替換成纈氨酸、第349位谷氨酰胺替換成纈氨酸及第438位絲氨酸替換為纈氨酸，所得三重突變體命名為S66V/Q349V/S438V。
7.根據權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述多個氨基酸位點發生突變是將權利要求3中所述的9個位點同時進行突變，所得9重突變體命名為S66V/K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R/Q349V/S438V。
8.—種權利要求1-7所述任一淀粉酶突變體的制備方法，其特征在于，具體步驟如下: 1)根據SEQ ID N0.1所示氨基酸序列，采用化學全合成的方法全合成基因后克隆到質粒pET-22b (+)中，構建重組質粒pAmyQ ； 2)利用Swiss-model軟件對氨基酸序列如SEQID N0.1所示的酶的結構進行模擬，獲得淀粉酶空間結構，確定在淀粉酶催化結構域內進行氨基酸替換的位點； 3)設計突變引物，通過PCR對淀粉酶基因序列進行定點突變，獲得含有突變淀粉酶序列的重組載體； 4)將突變后重組載體轉化大腸桿菌BL21，誘導表達，離心收集發酵上清，獲得淀粉酶突變體。
9.權利要求1-7所述任一淀粉酶突變體在紡織、洗滌劑、制革、造紙、醫藥、食品領域的應用。
【文檔編號】C12N9/28GK103484441SQ201310422992
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月17日 優先權日:2013年9月17日
【發明者】陳堅, 劉龍, 鄧壯梅, 堵國成, 楊海泉 申請人:江南大學