粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法
【專利摘要】本發明涉及一種粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法。所述方法包括：在獲得粗枝云杉的體細胞胚后，對體細胞胚采用“濾紙橋法”、“空培養容器法”或“濾紙法”的方式進行干化處理0～21天，然后再進行萌發。本發明提供了一種粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，包括了基于體細胞胚顏色變化的干化標記策略，能夠極顯著地提高體細胞胚的萌發率；同時，體細胞胚萌發的質量也得到明顯提高；而且不會受到基因型和細胞系的影響，具有普遍的適用性；為實現粗枝云杉體細胞胚的工廠化育苗奠定了理論基礎，并提供了切實可行的技術方案。
【專利說明】粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法【技術領域】[0001]本發明涉及林業中細胞工程種苗繁殖領域，具體地，涉及一種粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法。【背景技術】[0002]植物體細胞胚胎發生技術，是指在離體條件下，已分化的體細胞在特定的環境條件下，發育成與合子胚類似的胚狀體的過程。植物體細胞胚胎發生是利用細胞工程手段實現植株再生的重要途徑之一，作為一種利用人工手段能夠最大限度地實現植物擴繁的措施，尤其對于難以扦插繁殖且繁殖周期較長的針葉樹樹種來說具有巨大的應用價值。同時， 由于體細胞胚和合子胚具有相似的形態結構和發育過程，體細胞胚胎發生過程又具有相對的遺傳穩定性；開展植物體細胞胚胎發生的研究，已經為揭示植物胚胎的發生機理研究和開展遺傳轉化研究提供了一種模式研究系統。[0003]一個完整的植物體細胞胚胎發生技術包括胚性愈傷組織的誘導、胚性愈傷組織的增殖、體細胞胚的分化和成熟體細胞胚的萌發等四個階段；其中，成熟體細胞胚的萌發階段作為整個技術體系的最后一步，體細胞胚萌發率的高低及萌發質量，直接決定著最終體胚苗的收獲量和整個體胚技術體系構建的成敗。目前，在針葉樹樹種體細胞胚萌發階段， 為提高體細胞胚的萌發率和萌發質量，國外常用的方法是將體細胞胚萌發之前進行干化 (Desiccation)預處理。通常，失水現象是體細胞胚由成熟階段向萌發階段轉變的最直接響應，可以促使體細胞胚由形態成熟向萌發所需的生理成熟轉變；因此，對體細胞胚而言，給予適當的干化失水處理，不僅能夠抑制分化培養基中體細胞胚的提早萌發，還能夠提高體細胞胚在萌發階段中的萌發數量和質量。[0004]一般根據體細胞胚失水速率的變化，可以將體細胞胚的干化處理方法分為完全干化(Full Desiccation)和部分干化(Partial Desiccation)兩種；前者主要由滲透壓調節物質實現，而后者主要通過水蒸氣變化調節。盡管干化處理能夠提高萌發頻率，然而影響干化處理效果的因素有很多:干化方法的差異、干化處理持續的時間、樹種的不同、甚至相同樹種不同基因型之間對相同干化處理方法的響應都存在很大差異。如果不考慮影響干化處理效果的因素，采用單一的干化處理條件，肯定不能夠滿足所有基因型或者細胞系體細胞胚的萌發需要。因此，國外有學者甚至提出，每一個細胞系都可能對應一個獨一無二的干化處理方案，若想建立合適的干化處理方案，需要對每個細胞系的體細胞胚干化條件逐一探索。這種逐一探索的方法費時費力，在實際生產中可行性較差。[0005]粗枝云杉(Picea asperata Mast)為松科,云杉屬樹種，國內俗稱云杉,為我國特有種，也是我國分布最廣的云杉屬樹種。常綠喬木，高達45m，胸徑達lm。主要分布于川西高原、甘肅東南部和陜西西南部的亞高山地區，平均海拔分布在2400~3600m的高山丘陵地帶。木材黃白色，較輕軟，紋理直，結構細，有彈性。是重要的造紙、建筑、家具及木纖維工業的原材料。材質優良，生長快，適應性強，是分布區的主要造林樹種。目前，人工造林用苗 主要通過實生繁殖，但粗枝云杉結實晚，種子成熟率低，且伴有嚴重的“大小年”現象，致使粗枝云杉優良種苗供不應求。[0006]在過去幾年，本申請的發明人嘗試首次構建粗枝云杉體細胞胚胎發生技術體系。 在此過程中，胚性愈傷組織的誘導、胚性愈傷組織的增殖、體細胞胚的分化等階段的技術體系已經非常成熟，并符合生產需要。然而，在體細胞胚的萌發過程中，盡管經過大量的探索工作，對影響體細胞胚萌發的因素做了盡可能多的嘗試，篩選出的萌發條件雖能顯著地提高粗枝云杉體細胞胚的萌發率，但是萌發率還是不夠高(平均為20%左右)，仍然不能盡可能高地滿足實際生產的需要。[0007]因此，若能在粗枝云杉體細胞胚萌發之前，確定其合適的干化處理方法，可以極顯著地提高體細胞胚的萌發率和明顯提高體細胞胚萌發的質量；并且該處理方法如果不會受到基因型和細胞系的影響，具有普遍的適用性，將為實現粗枝云杉體細胞胚的工廠化育苗， 提供了巨大的應用前景。
【發明內容】
[0008]為了解決現有技術中的問題，本發明的目的是提供一種粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法。[0009]為了實現上述目的，本發明提供的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，包括:在獲得粗枝云杉的體細胞胚后，對體細胞胚采用“濾紙橋法”、“空培養容器法”或“濾紙法”的方式進行干化處理O~21天，然后再進行萌發。[0010]本發明所述的方法，優選對體細胞胚采用“空培養容器法”或“濾紙法”的方式進行干化處理。[0011]本發明所述的方法，更優選對體細胞胚采用“濾紙法”的方式進行干化處理。[0012]其中，所述的“濾紙橋法”為:將粗枝云杉體細胞胚放置在一個培養容器內，然后將該培養容器(放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器)放置在另一個更大的培養容器內，在更大的培養容器內放置水，用濾紙覆蓋在放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器上做成“濾紙橋”，最后將更大的培養容器封口。[0013]其中，所述的“空培養容器法”為:將粗枝云杉體細胞胚放置在一個培養容器內，然后將該培養容器(放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器)放置在另一個更大的培養容器內， 在更大的培養容器內放置水，最后將更大的培養容器封口。[0014]其中，所述的“濾紙法”為:將粗枝云杉體細胞胚放置在一個墊有一層以上濾紙的培養容器內，然后將該培養容器(放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器)放置在另一個更大的培養容器內，在更大的培養容器內放置水，最后將更大的培養容器封口。[0015]其中，所述的“濾紙法”中，放置粗枝云杉體細胞胚的培養容器內墊有濾紙的層數優選I~4層，更優選3層。[0016]本發明中，在培養容器內放置的濾紙可以大小相同，也可以不同，但最好相同。[0017]本發明中，所用的培養容器可以為塑料培養皿或玻璃培養皿，優選玻璃培養皿。[0018]本發明所述的方法，優選干化處理I~14天，更優選7~14天，最優選14天。[0019]其中，對體細胞胚進行干化處理的條件還包括:溫度為23~25°C ;光照強度為 15 ~18 μ mo I.m 2.s S 優選 15 μ mo I ^m2-S10[0020]其中，采用液體懸浮`增殖或半固體增殖的胚性愈傷組織分別進行體細胞胚的分化培養，獲得粗枝云杉的體細胞胚。[0021]本發明所述的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，還包括:在對粗枝云杉的體細胞胚進行干化處理后，對體細胞胚進行干化標記，然后再進行萌發。[0022]其中，對體細胞胚進行干化標記的方式為:根據干化處理后體細胞胚顏色的變化， 將其標記成三種類型:“無變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。[0023]進一步地，對標記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。[0024]更進一步地，對標記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。[0025]本發明提供的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，包括:在獲得粗枝云杉的體細胞胚后，對體細胞胚采用“濾紙橋法”、“空培養容器法”或“濾紙法”的方式進行干化處理O~21天，對體細胞胚進行干化標記，然后再進行萌發。[0026]其中，對體細胞胚進行干化標記的方式為:根據干化處理后體細胞胚顏色的變化， 將其標記成三種類型:“無變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。[0027]進一步地，對標記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。[0028]更進一步地，對標記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。[0029]本發明提供的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，包括:在獲得粗枝云杉的體細胞胚后，對體細胞胚采用“空培養容器法”或“濾紙法”的方式進行干化處理O~21 天，對體細胞胚進行干化標記，然后再進行萌發。[0030]其中，對體細胞胚進行干化標記的方式為:根據干化處理后體細胞胚顏色的變化， 將其標記成三種類型:“無變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。[0031]進一步地，對標記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。[0032]更進一步地，對標記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。[0033]其中，所述的“濾紙橋法”為:將粗枝云杉體細胞胚放置在一個培養容器內，然后將該培養容器(放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器)放置在另一個更大的培養容器內，在更大的培養容器內放置水，用濾紙覆蓋在放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器上做成“濾紙橋”，最后將更大的培養容器封口。[0034]其中，所述的“空培養容器法”為:將粗枝云杉體細胞胚放置在一個培養容器內，然后將該培養容器(放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器)放置在另一個更大的培養容器內， 在更大的培養容器內放置水，最后將更大的培養容器封口。[0035]其中，所述的“濾紙法”為:將粗枝云杉體細胞胚放置在一個墊有一層以上濾紙的培養容器內，然后將該培養容器(放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器)放置在另一個更大的培養容器內，在更大的培養容器內放置水，最后將更大的培養容器封口。[0036]本發明提供的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，包括:對粗枝云杉的體細胞胚進行干化處理后，再進行干化標記，然后進行萌發。`[0037]其中，所述干化標記的方式為:根據體細胞胚顏色的變化情況，將其標記成三種類型:“無變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。[0038]其中，標記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚，其所需的干化時間為O~21天,優選I~14天,更優選7~14天,最優選14天。[0039]進一步地，對標記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。[0040]更進一步地，對標記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。[0041]本發明所述方法中，對體細胞胚進行萌發，所用的培養基為:1/4LM培養基，加入鹿糖20g.L_\凝膠6g.L—1和活性炭2g.L_\再附加谷氨酰胺500mg.L—1和水解酪蛋白 Ig.L'[0042]截至目前為止，國內關于針葉樹樹種體細胞胚的干化處理尚未見報道。本申請的發明人首次對國內針葉樹樹種粗枝云杉的體細胞胚進行干化處理，研究表明干化處理能夠普遍促進粗枝云杉體細胞胚的萌發。基于干化處理后體細胞胚顏色的變化，將“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚作為最適合萌發的干化標記，這種標記極大地提高了體細胞的干化處理效率，避免了干化處理的盲目性。同時，這種標記不依賴于基因型和細胞系， 避免了相同干化方法處理下不同來源的體細胞胚萌發率提高不一致的問題。這種標記研究思路，不僅在國內屬于首創，國外很多學者進行嘗試也未見成功報道。[0043]本發明提供的方法，是專門針對粗枝云杉體細胞胚萌發率低和萌發質量不高的問題，體細胞胚的萌發狀況無法滿足利用體細胞胚胎發生技術實現植株的規模化生產的需要。和現有國際上同屬或同類樹種研究的報道相比，本發明提供的粗枝云杉體細胞胚的干化方式，操作更為簡單，成本更加低廉；同時干化標記的方法更加高效和新穎，目前尚未見干化標記的應用報道，研究處于領先水平。目前，針葉樹樹種的體細胞胚萌發率一直很低， 萌發質量也不高，極大制約了體細胞胚胎發生技術的實際生產應用。干化處理后基于體細胞胚顏色變化而進行的體細胞胚的干化標記，這種研究思路極大地提高了粗枝云杉體細胞胚的萌發率和萌發質量，滿足了實際生產的需要。[0044]總之，本發明提供了一種粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，包括了基于體細胞胚顏色變化的干化標記策略；本發明的方法能夠極顯著地提高體細胞胚的萌發率 (達到30%以上，最高可達80%以上);同時，體細胞胚萌發的質量也得到明顯提高；而且不會受到基因型和細胞系的影響，具有普遍的適用性；為實現粗枝云杉體細胞胚的工廠化育苗奠定了理論基礎，并提供了切實可行的技術方案。【專利附圖】
【附圖說明】[0045]圖1為液體懸浮增殖所分化產生的大量且同步化程度較高的體細胞胚。[0046]圖2為半固體增殖所分化產生的大量且同步化程度較高的體細胞胚。[0047]圖3為實施例2中，用“濾紙法”干化處理中的體細胞胚。[0048]圖4為實施例5中，干化處理14天后，“無變化型”的體細胞胚。[0049]圖5為實施例5中，干化處理14天后，“胚根淡紅色型”的體細胞胚；其中a為淡黃色的子葉和胚軸部分，b為淡紅色的胚根部分。[0050]圖6為實施例5中，干化處理14天后，“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚；其中a為綠色的子葉和胚軸部分，b為紅色的胚根部分。[0051]圖7為實施例6中，`“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚萌發3周后產生的高同步化和生長健壯的幼苗。【具體實施方式】[0052]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。[0053]本發明提供的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，研究過程包括:[0054](I)高同步化粗枝云杉體細胞胚的獲得；[0055](2)篩選出適合粗枝云杉體細胞胚的干化方式；[0056](3)篩選合適的干化時間；[0057](4)干化處理方式的普遍適用性論證；[0058]( 5)干化標記的對比篩選；[0059](6)干化方式的進一步優化篩選。[0060]上述高同步化粗枝云杉體細胞胚的獲得中:胚性愈傷組織采用液體懸浮增殖或半固體增殖的方式進行，將這兩種方式增殖的胚性愈傷組織分別進行體細胞胚的分化培養， 由于分化培養基前期經過優化(即粗枝云杉體細胞胚胎發生體系中的條件篩選)，因此均可以獲得量大且高同步化的體細胞胚，為后續體細胞胚的干化處理提供均一化的材料奠定了基礎。[0061]上述適合粗枝云杉體細胞胚干化方式的篩選中:采用“濾紙橋法”、“空培養容器法”和“濾紙法”三種干化方式進行對比，優選“空培養容器法”或“濾紙法”，進一步地優選 “濾紙法”。采用“濾紙法”的干化方式，不僅能夠使體細胞胚處于相對干燥的環境，促進體細胞胚經歷一個充分的干化過程；同時，采用“濾紙法”的干化方式，體細胞胚能夠發生顏色變化，為基于顏色變化情況而進行的干化標記提供了可能。[0062]上述合適的干化時間的篩選中:干化時間為O~21天，優選I~14天，更優選7~ 14天，最優選14天。干化14天后，能夠最大限度地提高體細胞胚的萌發率。[0063]上述干化處理方式的普遍適用性論中:采用液體懸浮增殖和半固體增殖兩種方式增殖的細胞系所分化得到的體細胞胚為材料，按照本發明的方法進行干化處理，然后進行萌發，均得到了較高的萌發率，說明本發明的干化處理對粗枝云杉不同細胞系的體細胞胚的萌發促進作用具有普遍的適用性。 [0064]上述干化標記的對比篩選中:根據對粗枝云杉的體細胞胚進行干化處理后，體細胞胚顏色的變化情況，將體細胞胚分成三種類型(即進行干化標記):“無變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。將干化處理并標記后的這三種類型的體細胞胚分別進行萌發，經統計“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的萌發率較高，“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的萌發率最高。這種對體細胞胚進行的干化標記研究， 屬于首次報道。[0065]上述干化方式的進一步優化篩選中:在采用“濾紙法”的干化方式中，在放置粗枝云杉體細胞胚的培養容器內墊有I層以上的干燥無菌濾紙，優選I~4層，更優選3層。此種干化方式不僅使得干化處理效率進一步提高，同時極大地降低了干化處理成本。[0066]也就是說，本發明提供的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，包括:在獲得粗枝云杉的體細胞胚后，對體細胞胚采用“濾紙橋法”、“空培養容器法”或“濾紙法”的方式進行干化處理O~21天，然后再進行萌發。[0067]作為優選的實施方式，采用液體懸浮增殖或半固體增殖的胚性愈傷組織分別進行體細胞胚的分化培養，獲得粗枝云杉的體細胞胚。[0068]所述體細胞胚的分化培養，所用培養基為:1/2LM培養基+脫落酸16mg.L^+PEG (聚乙二醇)400050g.L-1+蔗糖30g.L-1+活性炭Ig.L-1+凝膠4g.L-1，附加谷氨酰胺 500mg.L-1和水解酪蛋白Ig.L'使用此種培養基，并添加上述相關成分可以獲得大量且同步化程度較高的體細胞胚。也可以采用其他培養基，但本發明的效果較優。[0069]在液體懸浮增殖的胚性愈傷組織進行體細胞胚的分化培養中，胚性愈傷組織的細胞體積和分化培養基的體積比為1:3。[0070]作為優選的實施方式，對體細胞胚采用“空培養容器法”或“濾紙法”的方式進行干化處理。[0071]作為進一步優選的實施方式，對體細胞胚采用“濾紙法”的方式進行干化處理。[0072]本發明所述的“濾紙橋法”為:將粗枝云杉體細胞胚放置在一個培養容器內，然后將該培養容器(放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器)放置在另一個更大的培養容器內，在更大的培養容器內放置無菌水，用兩層潤濕濾紙覆蓋在放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器上做成“濾紙橋”，最后將更大的培養容器封口。[0073]本發明所述的“空培養容器法”為:將粗枝云杉體細胞胚放置在一個培養容器內， 然后將該培養容器(放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器)放置在另一個更大的培養容器內，在更大的培養容器內放置無菌水，最后將更大的培養容器封口。[0074]本發明所述的“濾紙法”為:將粗枝云杉體細胞胚放置在一個墊有一層以上無菌濾紙的培養容器內，然后將該培養容器(放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器)放置在另一個更大的培養容器內，在更大的培養容器內放置水，最后將更大的培養容器封口。[0075]作為優選的實施方式，在所述“濾紙法”中，放置粗枝云杉體細胞胚的培養容器內墊有濾紙的層數為I~4層，更優選3層。[0076]本發明中，在培養容器內放置的濾紙可以大小相同，也可以不同，但最好相同。所用的培養容器可以為塑料培養皿或玻璃培養皿，優選玻璃培養皿。[0077]作為進一步優選的實施方式，干化處理I~14天，更優選7~14天，最優選14天。[0078]而對體細胞胚進行干化處理的條件還包括:培養室溫度(24±1) °C, Ιδμ,ο?.,2.s-1光照下進行干化處理。所有操作在無菌條件下進行，所采用的培養皿、濾紙和提供無菌環境的去離子水，全部需要高壓滅菌后使用。[0079]本發明所述的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，還包括:在對粗枝云杉的體細胞胚進行干化處理后，對體細胞胚進行干化標記，然后再進行萌發。[0080]所述對體細胞胚進行干化標記的方式為:根據干化處理后體細胞胚顏色的變化情況，將其標記成三種類型:“無變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。
[0081]作為優選的實施方式，對標記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。[0082]作為進一步優選的實施方式，對標記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。[0083]本發明提供的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，包括:對粗枝云杉的體細胞胚進行干化處理后，再進行干化標記，然后進行萌發；對體細胞胚進行干化標記的方式為:根據干化處理后體細胞胚顏色的變化，將其標記成三種類型:“無變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。[0084]作為優選的實施方式，對標記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。[0085]作為進一步優選的實施方式，對標記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。[0086]并且，在本發明提供的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法中，標記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚，其所需的干化時間為O~21天，優選I~14天，更優選7~14天,最優選14天。[0087]本發明所述方法中，對體細胞胚進行萌發，所用的培養基為:1/4LM培養基+蔗糖 20g.I71+凝膠6g.I71+活性炭2g.I71,附加谷氨酰胺500mg.L-1和水解酪蛋白Ig.L' 也可以采用其他培養基，但本發明的效果較優。[0088]本發明所述方法中，分化或萌發所用培養基中:由于使用的脫落酸和谷氨酰胺不耐高溫，可以采用過濾的方式滅菌，其他所有成分均采用高溫高壓方式滅菌。[0089]本發明所述方法中，體細胞胚的分化階段和萌發階段的培養基:加凝膠前將pH調至5.8，隨后在1211:、壓力IOlkp高溫、高壓條件下滅菌20分鐘后使用。也可以采用其他方式，但本發明的效果較優。[0090]本發明所述方法中，對體細胞胚進行萌發的條件包括:培養溫度為(24±1) V;第一周(以7天為周期)黑暗培養；第二周(以7天為周期),在20μηιο1.m_2.s—1光照下,每天的光周期為16小時光照培養和8小時黑暗培養；隨后在50 μ mo I.m_2.s—1光照下,每天的光周期為16小時光照培養和8小時黑暗培養。也可以采用其他方式，但本發明的效果較優。[0091]本發明所述方法中，對體細胞胚進行萌發，在萌發過程中，將體細胞胚水平放置于半固體培養基表面，培養皿傾斜45°角放置，有利于子葉伸展、胚軸和胚根伸長；同時，生長的胚根附著在培養基表面，避免了移栽時幼嫩苗根受損，有利于移栽成活。[0092]本發明所用凝膠,為植物凝膠gellan gum,采用Sigma品牌；它是一種冷凝膠,跟瓊脂的作用相同，但效果要好很多，具體表現為培養基的凝結速度和透明程度均明顯提高。 本發明所使用的活性炭activated carbon,同樣采用Sigma品牌,和一般市場上所售的活性炭相比，其活性吸附能力更強，能夠有效地清除培養基中的酚類等有毒物質。本發明所使用的水為去離子水，純度為18.2兆歐。[0093]本發明所用其他原料和試劑均為從市場上購得的常規試劑，未提及的操作方式和檢測方式也均為本領域常規的操作方式。[0094]LM培養基的成分為:[0095]大量元素:1.65g.IZ1NH4NO3, 1.9g.IZ1KNO3, 1.85g.IZ1MgSO4.7H20， 0.34g.L^1KH2PO4j0.022g.L-1CaCl2.2H20 ；[0096]微量元素:0.0304g.L^1H3BO3j0.043g.L-1ZnSO4.7H20，0.021g.L-1MnSO4.H2O, 0.00 126g.L^1Na2MoO4.2H20, 0.00415g.L-1KI, 0.0005g.L-1CuSO4.5H20, 0.000125g.T1CoCl2GH2O ；[0097]鐵鹽:0.0278g.L-1FeSO4.7H20，0.0373g.L-1EDTA.2H20 (乙二胺四乙酸)；[0098]肌醇:0.1g.L-1Myo-1`nositol ；[0099]有機鹽:0.0OOlg.L-1Thiamine-HCl (Vitamin B1), 0.0005g.T1Niacin acid(Vitamin B3), 0.0OOlg.L-1Pyroxidone-HCl (Vitamin B6)。
[0100]本發明出現的1/2LM培養基，就是對上述LM培養基的成分，將大量元素、微量元素和鐵鹽減半，其他不變。本發明出現的1/4LM培養基，就是對上述LM培養基，將大量元素、微量元素和鐵鹽減到1/4，其他不變。本發明出現的半固體培養基，就是在上述1/2LM培養基中添加凝膠。本發明出現的1/2LM液體培養基，就是對上述LM基本培養基，將大量元素、微量元素和鐵鹽減半，其他不變，同時培養基中不添加凝膠。
[0101]培養基中的各營養成分實際使用時先配制母液，然后稀釋使用。將大量元素和鐵鹽的母液配制成100倍，微量元素配制成1000倍，肌醇和有機鹽配制成500倍。其中，為了避免大量元素中的CaCl2.2H20和其他成分結合而形成沉淀，將其單獨配制。
[0102]本發明的內容是在2011~2013年間對粗枝云杉體細胞胚胎發生體系構建的基礎上進行的。在粗枝云杉體細胞胚胎發生體系構建過程中，通過大量對比試驗，已經獲得了體細胞胚最適合的分化培養基和萌發培養基。所采用的實驗材料，在實驗室保存有一年時間，不同細胞系能夠代表粗枝云杉體細胞胚胎發生體系過程的普遍性，也能代表干化處理方式的普遍適用性。
[0103]本發明的萌發率均指所統計的平均萌發率。
[0104]實施例1
[0105]高同步化粗枝云 杉體細胞胚的獲得:根據胚性愈傷組織增殖的方式分為兩種分化方式獲得:一種是對建立起液體懸浮增殖(用的是1/2LM液體培養基)體系的細胞系1921和1931而言，將懸浮增殖的胚性愈傷組織按照靜置時細胞體積和無激素添加的液體增殖培養基(B卩1/2LM液體培養基)兩者的體積比為1:3的比例混合，取搖勻的添加胚性愈傷組織的培養基5mL放置在一張濾紙(Whatman?2 )上,用布氏漏斗抽濾掉液體培養基后，將附有胚性愈傷組織的濾紙轉接到分化培養基上培養；另一種是對于半固體增殖的細胞系1113、1911、1921、2322、2614和2711而言，將轉接增殖2周后的胚性愈傷組織直接平鋪到濾紙(Whatman?2)上，隨后在分化培養基上培養。兩種方式米用相同的分化培養基和培養條件:1/2LM 培養基 + 脫落酸 16mg.r1+PEG400050g.L-1+ 蔗糖 30g.L-1+ 活性炭 Ig.L-1+ 凝膠4g.L-1，附加谷氨酰胺500mg.L-1和水解酪蛋白Ig.L-1 ;加凝膠前將培養基pH調至5.8，隨后在121°C、壓力IOlkp高溫、高壓條件下滅菌20分鐘后使用；(24±1)°C黑暗培養，7周(以7天為周期)后分化產生的成熟體細胞胚作為實驗材料。
[0106]需要說明的是:本實驗的細胞系1921同時采用兩種增殖方式進行研究，能夠使得結果更加可靠。
[0107]這兩種增殖方式是目前胚性愈傷組織增殖過程中最常用的方式。采用液體懸浮增殖或半固體增殖的胚性愈傷組織，分別進行體細胞胚的分化，并對體細胞胚進行干化處理，更能說明干化處理作用的廣泛適用性。同時，由于分化培養基中有相同的最適合體細胞胚分化的培養基成分，因此黑暗分化7周后，兩種增殖方式下保持的胚性愈傷組織均能夠獲得數量較大和同步化程度非常高的體細胞胚(如圖1和圖2所示，其中圖1為液體懸浮增殖所分化產生的大量且同步化程度較高的體細胞胚，圖2為半固體增殖所分化產生的大量且同步化程度較高的體細胞胚)；保證了干化處理過程中體細胞胚的均一性，使得干化處理結果更加可靠。[0108]實施例2
[0109]粗枝云杉體細胞胚干化方式的篩選:以實施例1中1921液體懸浮增殖系分化的體細胞胚為材料，采用目前國外常用的“濾紙橋法”，“空培養容器法”和本實驗室建立的“濾紙法”進行三種干化方法的比較。具體地:“濾紙橋法”即將體細胞胚放置在塑料培養皿(35X12mm)中，隨后將塑料培養皿放置在更大的玻璃培養皿(87X 15mm)內，在玻璃皿中放置IOmL無菌水，用兩層濕潤濾紙覆蓋在塑料皿上做成“濾紙橋”，最后將玻璃皿用封口膜封口。“空培養容器法”操作同“濾紙橋法”，只是不做“濾紙橋”。“濾紙法”(如圖3所示，其反映干化處理過程中的整體狀態)即將發育完全的體細胞胚放置在墊有兩層無菌干燥濾紙(相同大小)的塑料培養皿(35 X 12mm)中，隨后將塑料皿放置在更大的無菌玻璃培養皿(87X15mm)內，玻璃皿中放置IOmL無菌水，這樣使得體細胞胚處于一個相對干燥的環境中，玻璃皿用封口膜封口。隨后，將這三種方法干化處理的體細胞胚放置在15 μ mol.π2 *s_1的弱光、并于(24±1) °C的溫度下干化培養2周(以7天為周期)。
[0110]觀察塑料培養皿內體細胞胚的形態及顏色變化，干化結果如下表所示:
[0111]
【權利要求】
1.一種粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，包括:在獲得粗枝云杉的體細胞胚后，對體細胞胚采用“濾紙橋法”、“空培養容器法”或“濾紙法”的方式進行干化處理O~21 天，然后再進行萌發。
2.根據權利要求1所述的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，其特征在于，對體細胞胚采用“空培養容器法”或“濾紙法”的方式進行干化處理；優選對體細胞胚采用“濾紙法”的方式進行干化處理。
3.根據權利要求1或2所述的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，其特征在于， 所述的“濾紙橋法”為:將粗枝云杉體細胞胚放置在一個培養容器內，然后將該培養容器放置在另一個更大的培養容器內，在更大的培養容器內放置水，用濾紙覆蓋在放置有粗枝云杉體細胞胚的培養容器上做成“濾紙橋”，最后將更大的培養容器封口 ；所述的“空培養容器法”為:將粗枝云杉體細胞胚放置在一個培養容器內，然后將該培養容器放置在另一個更大的培養容器內，在更大的培養容器內放置水，最后將更大的培養容器封口 ；所述的“濾紙法”為:將粗枝云杉體細胞胚放置在一個墊有一層以上濾紙的培養容器內，然后將該培養容器放置在另一個更大的培養容器內，在更大的培養容器內放置水，最后將更大的培養容器封口。
4.根據權利要求3所述的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，其特征在于，所述的“濾紙法”中，放置粗枝云杉體細胞胚的培養容器內墊有濾紙的層數為I~4層，優選 3層。
5.根據權利要求1~4任意一項所述的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，其特征在于，干化處理I~14天，優選7~14天，更優選14天。
6.根據權利要求5所述的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，其特征在于，對體細胞胚進行干化處理的條件還包括:溫度為23~25 °C ;光照強度為15~ 18 μ mo I.π-2.s-1。
7.根據權利要求1~6任意一項所述的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法， 其特征在于，采用液體懸浮增殖或半固體增殖的胚性愈傷組織分別進行體細胞胚的分化培養，獲得粗枝云杉的體細胞胚。
8.根據權利要求1~7任意一項所述的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，其特征在于，該方法還包括:在對粗枝云杉的體細胞胚進行干化處理后，對體細胞胚進行干化標記，然后再進行萌發；對體細胞胚進行干化標記的方式為:根據干化處理后體細胞胚顏色的變化，將其標記成三種類型:“無變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。
9.一種粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，包括:對粗枝云杉的體細胞胚進行干化處理后，再進行干化標記，然后進行萌發；所述干化標記的方式為:根據體細胞胚顏色的變化情況，將其標記成三種類型:“無變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。
10.根據權利要求9所述的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，其特征在于，標記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚，其干化時間為O~21天，優選1~14 天，更優選7~14天，最優選14天。
11.根據權利要求8~10任意一項所述的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法， 其特征在于，對標記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發；優選對標記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細胞胚進行萌發。
12.根據權利要求1~11任意一項所述的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法， 其特征在于，對體細胞胚進行萌發，所用的培養基為:1/4LM培養基，加入蔗糖 凝膠 6g.L—1和活性炭2g.L_S再附加谷氨酰胺500mg.L—1和水解酪蛋白Ig.L'
【文檔編號】C12N5/04GK103497928SQ201310462072
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】王軍輝, 張建偉, 張守攻 申請人:中國林業科學研究院林業研究所