一種同步化調控針葉樹體細胞胚發生方法及其培養基的制作方法

專利名稱：一種同步化調控針葉樹體細胞胚發生方法及其培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物細胞培養，尤其涉及一種同步化調控針葉樹體細胞胚發生方法及其培養基。

背景技術：
隨著現代生命科學及其生物技術的快速發展，植物體細胞胚胎發生(Somatic Embryogenesis)已經成為針葉樹細胞工程、基因工程等分子與細胞高效育種技術中植株再生的重要途徑，可以用來研究干細胞無性系的細胞起源、調控和發育，利于闡明植物有性胚與無性胚發生機理，還是植物細胞全能性、分化及其形態建成研究的理想實驗體系，也是進行基因轉導、種質保存、微體快繁、人工種子研制的重要手段。迄今，高效穩定的體細胞胚胎發生技術已成為針葉樹新種質實現規模化無性繁殖的主要途徑，是世界林業高新技術必須完成的迫在眉睫的任務，尤其是將其用于針葉樹育種與繁殖工程，理論價值與經濟意義重大。
科學研究表明，裸子植物體細胞胚胎發生的發育進程不同于被子植物，以針葉樹為試材才能更科學地探索與揭示胚性細胞發生、發育與增殖、分化以及生物體形成等生命現象。
目前，培養獲得針葉樹種體細胞胚的方法主要有直接發生、間接發生和混合發生三種。其中，直接發生即體細胞胚直接從原外植體不經愈傷組織階段發育而成，其來源細胞可以是外植體表皮、亞表皮、合子胚等，約20多種外植體可按直接方式產生體細胞胚。但有相當部分植物，尤其是木本植物的體細胞胚發生是間接方式，即體細胞胚是從愈傷組織，或從已形成體細胞胚的一組細胞中發育而成。此外，某些植物既可按直接方式又可按間接方式進行體細胞胚發生，叫混合發生方式，如取自鴨茅葉基的外植體，先形成愈傷組織，再進行體細胞胚發生；若取其葉尖則體細胞胚直接從外植體上產生，所用的培養基為MS、DCR、SH、LP、GD等針葉樹離體培養的培養基。其存在的問題主要有早期原胚形成的狀態不好、胚性愈傷組織質量不高、早期原胚發育不完全與子葉發育不正常、玻璃化問題、下胚軸不伸長、體細胞胚不生根等。
生理生化及分子生物學研究發現，不同基因型、不同細胞系以及不同階段發育形態的原胚繼代培養狀況，直接影響體細胞胚(Somatic Embryo)的質量，如若增殖的早期原胚發育不好，直接影響其正常發育；原胚就不能發育到下一環節，而體細胞胚異常發育就會導致畸形胚發生。
因此現有技術有待改進和提高。


發明內容
本發明的目的在于，針對以上現有技術中存在的問題，提供一種能提高胚性細胞誘導頻率，改善早期原胚質量的同步化調控針葉樹體細胞胚發生方法及其培養基。
本發明提供了一種用于同步化調控針葉樹體細胞胚發生的基本培養基，其中，每升基本培養基溶液中包括以下組分 KNO3 2036～2936mg， NH4NO3233～340mg， KH2PO460～120mg， CaCl2.2H2O380～380mg， MgSO4.7H2O130～230mg， H3BO3 2～13mg， ZnSO4.7H2O3～8mg， MnSO4.H2O 5.5～11.5mg， Na2MoO4.2H2O 0.10～0.23mg， KI0.31～0.71mg， CuSO4.5H2O0.01～0.029mg， CoCl20.01～0.029mg。
一種用于同步化調控針葉樹體細胞胚發生的誘導培養基，其中，包括前面所述的基本培養基的各組分，每升誘導培養基溶液中還包括以下組分 FeSO4.7H2O13～21mg， 乙二胺四乙酸二鈉 15～27mg， 肌醇 50～1500mg， 維生素B1 0.4～0.6mg， 谷氨酰胺 400～700mg， 蔗糖 20,000～55,000mg， 2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg， 酸水解酪蛋白 350～1050mg， 6-芐氨基嘌呤 0.05～3.1mg， 激動素0.05～2.6mg， 瓊脂 2,500～7,000mg。
本發明所述的誘導培養基，其中的基本培養基中各組分含量為 KNO3 2273mg， NH4NO3267mg， KH2PO482mg， CaCl2.2H2O326mg， MgSO4.7H2O160mg， H3BO3 3.1mg， ZnSO4.7H2O4.3mg， MnSO4.H2O 8.4mg， Na2MoO4.2H2O 0.12mg， KI0.42mg， CuSO4.5H2O0.0125mg， CoCl2 0.0125mg。
一種用于同步化調控針葉樹體細胞胚發生的繼代培養基，其中，包括前面所述的基本培養基的各組分，每升繼代培養基溶液中還包括以下組分 FeSO4.7H2O13～21mg， 乙二胺四乙酸二鈉 15～27mg， 肌醇 50～1500mg， 維生素B1 0.4～0.6mg， 谷氨酰胺 400～700mg， 甘露醇1000～4000mg， 蔗糖 20,000～55,000mg， 2，4-二氯苯氧乙酸0.3～2.7mg， 酸水解酪蛋白 350～1050mg， 6-芐氨基嘌呤 0.05～3.1mg。
本發明所述的繼代培養基，其中的基本培養基中各組分含量為 KNO32718mg， NH4NO3 328mg， KH2PO4 112mg， CaCl2.2H2O 326mg， MgSO4.7H2O 201mg， H3BO3 8.9mg， ZnSO4.7H2O 4.8mg， MnSO4.H2O 10.5mg， 乙二胺四乙酸二鈉0.14mg， KI 0.48mg， CuSO4.5H2O 0.0125mg， CoCl2 0.0125mg。
一種用于同步化調控針葉樹體細胞胚發生的增殖培養基，其中，包括前面所述的基本培養基的各組分，每升增殖培養基溶液中還包括以下組分 FeSO4.7H2O 12～22mg， 乙二胺四乙酸二鈉 13～28mg， 肌醇 50～1750mg， 維生素B1 0.3～0.9mg， 谷氨酰胺 400～800mg， 甘露醇 700～4200mg， 蔗糖 15,000～75,000mg， 2，4-二氯苯氧乙酸 0.2～3.7mg， 酸水解酪蛋白 350～850mg， 6-芐氨基嘌呤 0.05～2.7mg。
本發明所述的增殖培養基，其中的基本培養基中各組分含量為 KNO3 2336mg， NH4NO3 276mg， KH2PO4 86mg， CaCl2.2H2O 326mg， MgSO4.7H2O 172mg， H3BO3 3.1mg， ZnSO4.7H2O 4.3mg， MnSO4.H2O 8.45mg， Na2MoO4.2H2O 0.125mg， KI 0.42mg， CuSO4.5H2O 0.0125mg， CoCl20.0125mg。
一種用于同步化調控針葉樹體細胞胚發生的成熟培養基，其中，包括前面所述的基本培養基的各組分，每升成熟培養基溶液中還包括以下組分 FeSO4.7H2O9～17mg， 乙二胺四乙酸二鈉 12～32mg， 肌醇 50～1750mg， 維生素B1 0.3～0.9mg， 谷氨酰胺 400～800mg， 甘露醇700～4200mg， 蔗糖 15,000～75,000mg， 聚乙二醇 10000～220000mg， 酸水解酪蛋白 350～850mg， 脫落酸3～200mg， 瓊脂 2,000～7,000mg。
本發明所述的成熟培養基，其中的基本培養基中各組分含量為 KNO3 2542mg， NH4NO3285mg， KH2PO488mg， CaCl2.2H2O326mg， MgSO4.7H2O188mg， H3BO3 8.9mg， ZnSO4.7H2O4.52mg， MnSO4.H2O 8.89mg， Na2MoO4.2H2O 0.131mg， KI0.46mg， CuSO4.5H2O0.0125mg， CoCl2 0.0125mg。
一種同步化調控針葉樹體細胞胚發生方法，包括以下步驟 A、將針葉樹種未成熟胚消毒后接種于誘導培養基中，在23±5℃溫度，及暗培養條件下進行培養，得到胚性細胞系； B、將胚性細胞在誘導培養基中繼代培養兩次后，選取新分化的胚性細胞，轉接于繼代培養基中，控制搖床轉速為110±30轉/分鐘，在23±5℃溫度，及暗培養條件下進行胚性保持繼代培養； C、將繼代后的胚性細胞系接種于增殖培養基中，控制搖床轉速為110±30轉/分鐘，在23±5℃溫度，及暗培養條件下，進行同步化調控培養，增殖獲得同步化的胚性細胞系； D、將步驟C中得到的胚性細胞系培養物接種于增殖培養基中，在23±5℃溫度，及暗培養條件下，進行胚性細胞系原胚的規模化增殖培養； E、胚性細胞在增殖培養基中增殖培養到預定數量后，轉接于成熟培養基中進行成熟培養，在23±5℃溫度，及暗培養條件下進行培養，得到體細胞胚。
本發明所述的體細胞胚發生方法，其中，所述步驟A中采用的誘導培養基中，每升溶液包括以下組分 KNO3 2036～2936mg， NH4NO3233～340mg， KH2PO460～120mg， CaCl2.2H2O380～380mg， MgSO4.7H2O130～230mg， H3BO3 2～13mg， ZnSO4.7H2O3～8mg， MnSO4.H2O 5.5～11.5mg， Na2MoO4.2H2O 0.10～0.23mg， KI0.31～0.71mg， CuSO4.5H2O0.01～0.029mg， CoCl2 0.01～0.029mg， FeSO4.7H2O13～21mg， 乙二胺四乙酸二鈉 15～27mg， 肌醇 50～1500mg， 維生素B1 0.4～0.6mg， 谷氨酰胺 400～700mg， 蔗糖 20,000～55,000mg， 2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg， 酸水解酪蛋白 350～1050mg， 6-芐氨基嘌呤 0.05～3.1mg， 激動素0.05～2.6mg， 瓊脂2,500～7,000mg。
本發明所述的體細胞胚發生方法，其中，所述步驟B中采用的繼代培養基中，每升溶液包括以下組分 KNO32036～2936mg， NH4NO3 233～340mg， KH2PO4 60～120mg， CaCl2.2H2O 380～380mg， MgSO4.7H2O 130～230mg， H3BO3 2～13mg， ZnSO4.7H2O 3～8mg， MnSO4.H2O 5.5～11.5mg， Na2MoO4.2H2O0.10～0.23mg， KI 0.31～0.71mg， CuSO4.5H2O 0.01～0.029mg， CoCl2 0.01～0.029mg， FeSO4.7H2O 13～21mg， 乙二胺四乙酸二鈉15～27mg， 肌醇50～1500mg， 維生素B10.4～0.6mg， 谷氨酰胺400～700mg， 甘露醇 1000～4000mg， 蔗糖20,000～55,000mg， 2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg， 酸水解酪蛋白350～1050mg， 6-芐氨基嘌呤0.05～3.1mg。
本發明所述的體細胞胚發生方法，其中，所述步驟C或D中采用的增殖培養基中，每升溶液包括以下組分 KNO32036～2936mg， NH4NO3 3233～340mg， KH2PO4 60～120mg， CaCl2.2H2O 380～380mg， MgSO4.7H2O 130～230mg， H3BO3 2～13mg， ZnSO4.7H2O 3～8mg， MnSO4.H2O 5.5～11.5mg， Na2MoO4.2H2O0.10～0.23mg， KI 0.31～0.71mg， CuSO4.5H2O 0.01～0.029mg， CoCl2 0.01～0.029mg， FeSO4.7H2O 12～22mg， 乙二胺四乙酸二鈉 13～28mg， 肌醇 50～1750mg， 維生素B1 0.3～0.9mg， 谷氨酰胺 400～800mg， 甘露醇 700～4200mg， 蔗糖 15,000～75,000mg， 2，4-二氯苯氧乙酸 0.2～3.7mg， 酸水解酪蛋白 350～850mg， 6-芐氨基嘌呤 0.05～2.7mg。
本發明所述的體細胞胚發生方法，其中，所述步驟E中采用的成熟培養基中，每升溶液包括以下組分 KNO3 2036～2936mg， NH4NO3233～340mg， KH2PO460～120mg， CaCl2.2H2O380～380mg， MgSO4.7H2O130～230mg， H3BO3 2～13mg， ZnSO4.7H2O3～8mg， MnSO4.H2O 5.5～11.5mg， Na2MoO4.2H2O 0.10～0.23mg， KI0.31～0.71mg， CuSO4.5H2O0.01～0.029mg， CoCl2 0.01～0.029mg， FeSO4.7H2O9～17mg， 乙二胺四乙酸二鈉 12～32mg， 肌醇 50～1750mg， 維生素B1 0.3～0.9mg， 谷氨酰胺 400～800mg， 甘露醇700～4200mg， 蔗糖 15,000～75,000mg， 聚乙二醇 10000～220000mg， 酸水解酪蛋白 350～850mg， 脫落酸3～200mg， 瓊脂 2,000～7,000mg。
本發明通過對培養基組分的優化，提高了胚性細胞誘導頻率，提高了胚頭與胚柄正常率，原胚的愈傷化和畸形胚減少，且可見的子葉胚基本為同步化、標準化，其生根、伸長率達到90％，解決了胚性細胞系培養過程中原胚發育同步化癥結，在針葉樹中首先建立了體細胞胚同步化與規模化培養體系。



圖1為本發明實施例的同步化調控后發生的落葉松體細胞胚； 圖2為本發明實施例的同步化調控后液體上規模化發生的落葉松體細胞胚； 圖3為本發明實施例的成熟培養基上發生的落葉松體細胞胚形態； 圖4為本發明實施例的同步化調控后固體上規模化發生的落葉松體細胞胚。

具體實施例方式 以下對本發明的較佳實施例加以詳細說明。
本發明所提供的同步化調控針葉樹體細胞胚發生的培養基，包括誘導培養基、繼代培養基、增殖培養基和成熟培養基，可應用于同步化調控針葉樹體細胞胚發生的各個步驟中。其中，這四種培養基均以基本培養基為基礎，針對不同的培養基，可適當調整基本培養基中各成分的含量，以提高胚性細胞誘導頻率、胚頭與胚柄正常率等，下面逐一舉例說明。
實施例1 本發明的用于同步化調控針葉樹體細胞胚發生的基本培養基，每升培養基溶液中各組分及其含量如表1所示。
以下表1中示出了5組基本培養基的組分，分別為組分1、組分2、組分3、組分4和組分5。
表1基本培養基各組分(單位mg/L) 實施例2 本發明的用于同步化調控針葉樹體細胞胚發生的誘導培養基，包括實施例1中的基本培養基各組分，每升誘導培養基溶液中還包括鐵鹽、維生素及其他有機成分。
以下表2中示出了5組誘導培養基的組分，分別為組分1、組分2、組分3、組分4和組分5，溶液pH值為5.4-6.4。
表2誘導培養基中各組分(單位mg/L) 實施例3 本發明的用于同步化調控針葉樹體細胞胚發生的繼代培養基，包括實施例1中的基本培養基各組分，每升繼代培養基溶液中還包括鐵鹽、維生素及其他有機成分。
以下表3中示出了5組繼代培養基的組分，分別為組分1、組分2、組分3、組分4和組分5，溶液pH值為5.4-6.4。
表3繼代培養基中各組分(單位mg/L) 實施例4 本發明的用于同步化調控針葉樹體細胞胚發生的增殖培養基，包括實施例1中的基本培養基各組分，每升增殖培養基溶液中還包括鐵鹽、維生素及其他有機成分。
以下表4中示出了5組增殖培養基的組分，分別為組分1、組分2、組分3、組分4和組分5，溶液pH值為5.4-6.4。
表4增殖培養基中各組分(單位mg/L) 實施例5 本發明的用于同步化調控針葉樹體細胞胚發生的成熟培養基，包括實施例1中的基本培養基各組分，每升成熟培養基溶液中還包括鐵鹽、維生素及其他有機成分。
以下表5中示出了5組誘導培養基的組分，分別為組分1、組分2、組分3、組分4和組分5，溶液pH值為5.4-6.4。其中優選采用分子量為4000的聚乙二醇(PEG4000)。
表5成熟培養基中各組分(單位mg/L) 實施例6 本實施例給出了在誘導培養基、繼代培養基、成熟培養基和增殖培養基(以下以“四種培養基”代稱)中優選的基本培養基所含有的組分，如下表6所示。
表6四種培養基中分別優選的基本培養基組分(單位mg/L) 實施例7 本實施例給出了同步化調控針葉樹體細胞胚發生方法，包括實驗材料、實驗方法以及實驗結果，下面分別描述如下 一、實驗材料與方法 1、實驗材料 選用華北落葉松、日本落葉松、長白落葉松、雜種落葉松等針葉樹的未成熟合子胚誘導與建立胚性細胞系。
采用前述各實施例中的培養基溶液進行培養，也可調整培養基各組分含量，使之應用于云杉、華山松、白皮松、北美喬松、思茅松等針葉樹的未成熟合子胚誘導與建立胚性細胞系。
需要說明的是，本發明以下方法中的生物反應器規模化增殖方法只適合于各種落葉松，其它針葉樹種適合采用三角瓶液體培養方法。
2、實驗方法 1)接種、誘導培養 用鑷子從球果中取出種子，采用70％酒精浸泡1分鐘，采用0.1％升汞溶液浸泡6分鐘，采用無菌水沖洗5次后，接種備用；在超凈臺中剝取種胚，從側部劃開種殼，取出種仁，劃破內種皮，挑開胚乳，將嫩胚同胚柄一起接種于培養基上，每皿接種15～25個，整齊排放、重復4次；在溫度21～27℃下暗培養，20～30天根據顏色、形態、結構等特征，初步確定胚性細胞組織； 2)繼代培養 針葉樹胚性細胞在誘導培養基中繼代培養兩次，然后轉接于繼代培養基中進行胚性保持繼代培養，每次轉接時均選取新分化的胚性細胞，在三角瓶中液體繼代時，按照重量于體積比2％進行接種，即100ml液體培養基中接種2克新鮮的胚性細胞系，搖床轉速110±30轉/分鐘，在溫度為23±5℃、暗培養條件下進行培養； 3)同步化調控培養 針葉樹胚性愈傷組織在誘導培養基中繼代培養兩次后，轉接于增殖培養基中進行增殖、繼代培養，每次轉接時均選取新分化的胚性細胞，再將繼代保持得到的胚性細胞系接種于液體培養基的增殖培養基中的三角瓶內，在130±50轉/分、23±5℃、暗培養條件下進行同步化調控培養，根據培養物生長情況調節培養條件，增殖獲得同步化頻率90％以上的胚性細胞系，如圖1所示； 4)規模化增殖培養將上述胚性細胞系培養物接種于液體培養基的相同新鮮增殖培養基，用生物反應器中進行胚性細胞系原胚的規模化增殖培養。在專用生物反應器中液體增殖時按照重量于體積比0.5～1％進行接種，即100ml液體培養基中接種0.5～1克新鮮、游離的胚性細胞系，在23±5℃、暗培養條件下進行培養，觀察同步化調控后液體上規模化發生的落葉松體細胞胚如圖2所示，同步化調控后固體上規模化發生的落葉松體細胞胚如圖4所示； 5)成熟培養針葉樹胚性細胞在增殖培養基中增殖培養到一定數量后，轉接于成熟培養基中進行成熟培養，在23±5℃、暗培養條件下進行培養。在成熟培養基上約20～65天時間段內，不同胚性細胞系的成熟時間差異較大，有可見的小胚發生后，移到25±3℃、1600～2000lx的光照條件下進行光培養，不同胚性細胞系選擇成熟培養基發生體細胞胚的數量與質量差異較大，觀察成熟培養基上發生的落葉松體細胞胚形態如圖3所示。
本實施例中，所采用的誘導培養基、繼代培養基、成熟培養基和增殖培養基，可以是實施例2至5中對應的四種培養基，優選采用以下組分，如表7所示，各培養基溶液pH值優選配置為5.8。
表7四種培養基優選組分(單位mg/L) 二、實驗結果 采用上述培養基、培養條件得到的體細胞胚照片如圖1至圖4所示；落葉松不同胚性細胞系體細胞胚發生數量及畸形胚比率見表8。
表8落葉松不同胚性細胞系體細胞胚發生數量及畸形胚比率 以上結果表明，使用本發明的同步化調控針葉樹體細胞胚發生方法后，提高了胚性細胞誘導頻率，早期原胚質量大大改善，胚頭與胚柄正常率達到90％以上，原胚的愈傷化和畸形胚減少45％，高質量子葉胚90％以上，每升增殖后的液體培養基中含有30000～50000個原胚，每克胚性愈傷組織上可發生260～460個子葉胚，畸形胚近于10％以下，且可見的子葉胚基本為同步化、標準化，其生根、伸長率達到90％；比現有技術中胚性細胞系的增殖頻率和增殖數量提高15～20倍。子葉胚發生頻率與固體培養體系相當，但由于增殖的胚性細胞或原胚數量大，所以實際獲得的正常子葉胚的數量是固體系統的10～15倍。
綜上所述，通過采用本發明方案，包括同步化調控針葉樹體細胞胚發生方法及其配套使用的基本培養基，及其對應的四種培養基，大大改善了現有固體培養系統中，每克胚性愈傷組織上發生5～25個子葉胚、畸形胚占到70％以上、體細胞胚生根率0～7％等狀況，解決了胚性細胞系培養過程中原胚發育同步化癥結，真正突破了針葉樹體細胞胚規模化發生難關，目前已在落葉松等針葉樹胚性細胞系上獲得成功，在針葉樹中首先建立了體細胞胚同步化與規模化培養體系。
應當理解，上述針對具體實施例的描述較為詳細，并不能因此而認為是對本發明專利保護范圍的限制，本發明的專利保護范圍應以所附權利要求為準。
權利要求
1、一種用于同步化調控針葉樹體細胞胚發生的基本培養基，其特征在于，每升基本培養基溶液中包括以下組分
KNO3 2036～2936mg，
NH4NO3 233～340mg，
KH2PO4 60～120mg，
CaCl2.2H2O 380～380mg，
MgSO4.7H2O 130～230mg，
H3BO32～13mg，
ZnSO4.7H2O 3～8mg，
MnSO4.H2O5.5～11.5mg，
Na2MoO4.2H2O 0.10～0.23mg，
KI 0.31～0.71mg，
CuSO4.5H2O 0.01～0.029mg，
CoCl20.01～0.029mg。
2、一種包括如權利要求1所述基本培養基的誘導培養基，其特征在于，每升誘導培養基溶液中還包括以下組分
FeSO4.7H2O 13～21mg，
乙二胺四乙酸二鈉15～27mg，
肌醇50～1500mg，
維生素B10.4～0.6mg，
谷氨酰胺400～700mg，
蔗糖20,000～55,000mg，
2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg，
酸水解酪蛋白350～1050mg，
6-芐氨基嘌呤0.05～3.1mg，
激動素 0.05～2.6mg，
瓊脂2,500～7,000mg。
3、如權利要求2所述的誘導培養基，其特征在于，所述誘導培養基中的基本培養基中各組分為
KNO32273mg，
NH4NO3267mg，
KH2PO482mg，
CaCl2.2H2O326mg，
MgSO4.7H2O160mg，
H3BO3 3.1mg，
ZnSO4.7H2O4.3mg，
MnSO4.H2O 8.4mg，
Na2MoO4.2H2O 0.12mg，
KI0.42mg，
CuSO4.5H2O0.0125mg，
CoCl2 0.0125mg。
4、一種包括如權利要求1所述基本培養基的繼代培養基，其特征在于，每升繼代培養基溶液中還包括以下組分
FeSO4.7H2O 13～21mg，
乙二胺四乙酸二鈉15～27mg，
肌醇50～1500mg，
維生素B10.4～0.6mg，
谷氨酰胺400～700mg，
甘露醇 1000～4000mg，
蔗糖20,000～55,000mg，
2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg，
酸水解酪蛋白350～1050mg，
6-芐氨基嘌呤0.05～3.1mg。
5、如權利要求4所述的繼代培養基，其特征在于，所述繼代培養基中基本培養基中各組分為
KNO3 2718mg，
NH4NO3 328mg，
KH2PO4 112mg，
CaCl2.2H2O 326mg，
MgSO4.7H2O 201mg，
H3BO38.9mg，
ZnSO4.7H2O 4.8mg，
MnSO4.H2O10.5mg，
Na2MoO4.2H2O 0.14mg，
KI 0.48mg，
CuSO4.5H2O 0.0125mg，
CoCl2 0.0125mg。
6、一種包括如權利要求1所述基本培養基的增殖培養基，其特征在于，每升增殖培養基溶液中還包括以下組分
FeSO4.7H2O12～22mg，
乙二胺四乙酸二鈉 13～28mg，
肌醇 50～1750mg，
維生素B1 0.3～0.9mg，
谷氨酰胺 400～800mg，
甘露醇700～4200mg，
蔗糖 15,000～75,000mg，
2，4-二氯苯氧乙酸 0.2～3.7mg，
酸水解酪蛋白 350～850mg，
6-芐氨基嘌呤 0.05～2.7mg。
7、如權利要求6所述的增殖培養基，其特征在于，所述增殖培養基中的基本培養基中各組分為
KNO32336mg，
NH4NO3 276mg，
KH2PO4 86mg，
CaCl2.2H2O 326mg，
MgSO4.7H2O 172mg，
H3BO3 3.1mg，
ZnSO4.7H2O 4.3mg，
MnSO4.H2O 8.45mg，
Na2MoO4.2H2O0.125mg，
KI 0.42mg，
CuSO4.5H2O 0.0125mg，
CoCl2 0.0125mg。
8、一種包括如權利要求1所述基本培養基的成熟培養基，其特征在于，每升成熟培養基溶液中還包括以下組分
FeSO4.7H2O 9～17mg，
乙二胺四乙酸二鈉12～32mg，
肌醇50～1750mg，
維生素B10.3～0.9mg，
谷氨酰胺400～800mg，
甘露醇 700～4200mg，
蔗糖15,000～75,000mg，
聚乙二醇10000～220000mg，
酸水解酪蛋白350～850mg，
脫落酸 3～200mg，
瓊脂2,000～7,000mg。
9、如權利要求8所述的成熟培養基，其特征在于，所述成熟培養基中的基本培養基中各組分為
KNO3 2542mg，
NH4NO3 285mg，
KH2PO4 88mg，
CaCl2.2H2O 326mg，
MgSO4.7H2O 188mg，
H3BO38.9mg，
ZnSO4.7H2O 4.52mg，
MnSO4.H2O8.89mg，
Na2MoO4.2H2O 0.131mg，
KI 0.46mg，
CuSO4.5H2O 0.0125mg，
CoCl20.0125mg。
10、一種同步化調控針葉樹體細胞胚發生方法，包括以下步驟
A、將針葉樹種未成熟胚消毒后接種于誘導培養基中，在23±5℃溫度、暗培養條件下進行培養，得到胚性細胞系；
B、將胚性細胞在誘導培養基中繼代培養兩次后，選取新分化的胚性細胞，轉接于繼代培養基中，控制搖床轉速為110±30轉/分鐘，在23±5℃溫度、暗培養條件下進行胚性保持繼代培養；
C、將繼代后的胚性細胞系接種于增殖培養基中，控制搖床轉速為110±30轉/分鐘，在23±5℃溫度、暗培養條件下，進行同步化調控培養，增殖獲得同步化的胚性細胞系；
D、將步驟C中得到的胚性細胞系培養物接種于增殖培養基中，在23±5℃溫度、暗培養條件下，進行胚性細胞系原胚的規模化增殖培養；
E、胚性細胞在增殖培養基中增殖培養到預定數量后，轉接于成熟培養基中進行成熟培養，在23±5℃溫度、暗培養條件下進行培養，得到體細胞胚。
11、如權利要求10所述的體細胞胚發生方法，其特征在于，所述步驟A中采用的誘導培養基中，每升溶液包括以下組分
KNO32036～2936mg，
NH4NO3 233～340mg，
KH2PO4 60～120mg，
CaCl2.2H2O 380～380mg，
MgSO4.7H2O 130～230mg，
H3BO3 2～13mg，
ZnSO4.7H2O 3～8mg，
MnSO4.H2O 5.5～11.5mg，
Na2MoO4.2H2O0.10～0.23mg，
KI 0.31～0.71mg，
CuSO4.5H2O 0.01～0.029mg，
CoCl2 0.01～0.029mg，
FeSO4.7H2O 13～21mg，
乙二胺四乙酸二鈉15～27mg，
肌醇50～1500mg，
維生素B10.4～0.6mg，
谷氨酰胺400～700mg，
蔗糖20,000～55,000mg，
2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg，
酸水解酪蛋白350～1050mg，
6-芐氨基嘌呤0.05～3.1mg，
激動素 0.05～2.6mg，
瓊脂2,500～7,000mg。
12、如權利要求10所述的體細胞胚發生方法，其特征在于，所述步驟B中采用的繼代培養基中，每升溶液包括以下組分
KNO32036～2936mg，
NH4NO3 233～340mg，
KH2PO4 60～120mg，
CaCl2.2H2O 380～380mg，
MgSO4.7H2O 130～230mg，
H3BO3 2～13mg，
ZnSO4.7H2O 3～8mg，
MnSO4.H2O 5.5～11.5mg，
Na2MoO4.2H2O0.10～0.23mg，
KI 0.31～0.71mg，
CuSO4.5H2O 0.01～0.029mg，
CoCl2 0.01～0.029mg，
FeSO4.7H2O 13～21mg，
乙二胺四乙酸二鈉15～27mg，
肌醇50～1500mg，
維生素B10.4～0.6mg，
谷氨酰胺400～700mg，
甘露醇 1000～4000mg，
蔗糖20,000～55,000mg，
2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg，
酸水解酪蛋白350～1050mg，
6-芐氨基嘌呤0.05～3.1mg。
13、如權利要求10所述的體細胞胚發生方法，其特征在于，所述步驟C或D中采用的增殖培養基中，每升溶液包括以下組分
KNO3 2036～2936mg，
NH4NO3233～340mg，
KH2PO460～120mg，
CaCl2.2H2O380～380mg，
MgSO4.7H2O130～230mg，
H3BO3 2～13mg，
ZnSO4.7H2O3～8mg，
MnSO4.H2O 5.5～11.5mg，
乙二胺四乙酸二鈉 0.10～0.23mg，
KI0.31～0.71mg，
CuSO4.5H2O0.01～0.029mg，
CoCl2 0.01～0.029mg，
FeSO4.7H2O12～22mg，
Na2.EDTA.H2O13～28mg，
肌醇50～1750mg，
維生素B10.3～0.9mg，
谷氨酰胺400～800mg，
甘露醇 700～4200mg，
蔗糖15,000～75,000mg，
2，4-二氯苯氧乙酸 0.2～3.7mg，
酸水解酪蛋白350～850mg，
6-芐氨基嘌呤0.05～2.7mg。
14、如權利要求10所述的體細胞胚發生方法，其特征在于，所述步驟E中采用的成熟培養基中，每升溶液包括以下組分
KNO3 2036～2936mg，
NH4NO3233～340mg，
KH2PO460～120mg，
CaCl2.2H2O380～380mg，
MgSO4.7H2O130～230mg，
H3BO3 2～13mg，
ZnSO4.7H2O3～8mg，
MnSO4.H2O 5.5～11.5mg，
Na2MoO4.2H2O 0.10～0.23mg，
KI0.31～0.71mg，
CuSO4.5H2O0.01～0.029mg，
CoCl2 0.01～0.029mg，
FeSO4.7H2O9～17mg，
乙二胺四乙酸二鈉 12～32mg，
肌醇 50～1750mg，
維生素B1 0.3～0.9mg，
谷氨酰胺 400～800mg，
甘露醇700～4200mg，
蔗糖 15,000～75,000mg，
聚乙二醇 10000～220000mg，
酸水解酪蛋白 350～850mg，
脫落酸3～200mg，
瓊脂 2,000～7,000mg。
全文摘要
本發明公開了一種同步化調控針葉樹體細胞胚發生方法及其培養基，其中所提供培養基包括誘導培養基、繼代培養基、增殖培養基和成熟培養基。應用上述培養基，液體培養獲得針葉樹種體細胞胚的方法，包括如下步驟誘導培養、繼代培養、同步化調控培養、規模化增殖培養和成熟培養，最后得到體細胞胚。本發明通過對培養基組分的優化，提高了胚性細胞誘導頻率，提高了胚頭與胚柄正常率，原胚的愈傷化和畸形胚減少，且可見的子葉胚基本為同步化、標準化，其生根、伸長率達到90％，解決了胚性細胞系培養過程中原胚發育同步化癥結，在針葉樹中首先建立了體細胞胚同步化與規模化培養體系。
文檔編號C12N5/04GK101633903SQ20091010926
公開日2010年1月27日 申請日期2009年7月30日 優先權日2009年7月30日
發明者齊玉琛 申請人:齊玉琛