專利名稱：能產抗真菌抗生素的茭白黑粉菌菌株及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及能產抗真菌抗生素的茭白黑粉菌菌株及其用途。
背景技術：
農業可持續發展戰略的實施，引起了人們對化學農藥危險和危害的重視。因此，符合環保、健康、高效、安全、環境友好的生物農藥成為當前生態農業研究的主題。隨著世界性生物技術的崛起，生物農藥得到快速發展，成為有近期經濟效益和社會效益的產業。對于農用抗生素，日本已實用有效霉素、春日霉素、多氧霉素、滅瘟素等幾十個，美國投產Avermectin、Gibberllin等多個品種，俄羅斯有卡蘇霉素、灰黃霉素、抗真菌素、植菌霉素等。迄今為止，已確定化學結構的抗生素逾900種，但具實用價值的只有20多種。常用的有井岡霉素、春雷霉素、公主嶺霉素、農抗120、武夷菌素、中生菌素、寧南霉素、多氧霉素、阿維菌素和赤霉素等。目前，已有20％～30％的化學農藥被微生物農藥所取代。
我國農用抗生素的研究始于20世紀50年代，一些品種已達到世界先進水平。現已成功用于農作物病害防治的農用抗生素主要有阿維菌素、并崗霉素等。特別是阿維菌素的消費量增長快速，年產制劑量約8000噸，并大量出口。我國是農藥生產和使用最多的國家。目前，我國農藥市場仍是化學農藥唱主角，主要用的化學農藥是多菌靈、甲基托布津、速克靈等由于常年使用這些殺菌劑，導致病害產生抗性，需要有新的藥劑替代。且由于化學農藥含量超標而使我國農產品出口受阻。
化學農藥引起的中毒十分嚴重。據WHO對19個國家的統計數據，全世界每年大約發生300萬起化學農藥中毒事件，其中急性中毒事件約50萬起。化學農藥污染還可導致死胎、流產和癌癥等疾病發生，據全美資源保護委員會和兒童科學院的調查，自1950年以來，兒童癌癥患者增加了9.8％，成人腎癌患者增加了109.4％，皮膚癌增加了321％，淋巴癌增加了158.6％。我國農藥污染是世界上最嚴重的國家之一，食品中農藥檢出率高達90％以上。此外，化學農藥大量殺傷天敵生物，破壞了生態平衡。因此，大力發展高效、低毒、安全、環境友好的生物農藥已成為必然的趨勢。目前，我國農用抗生素研究開發的重點①篩選新的農用抗生素，多品種結構發展是生物農藥發展的必然趨勢；②提高生產菌株的發酵水平，降低生產成本；③通過研制新劑型或復配等方法進行完善或創新，以降低應用成本和穩定藥效。
發明內容
本發明的目的在于克服上述缺點而提供的一種能產生抗真菌抗生素，為開發和生產醫用抗真菌抗生素和具有藥肥雙效、廣譜、安全、經濟的新型生物農藥提供可能的能產抗真菌抗生素的茭白黑粉菌(Ustilago esculenta或Yenia esculenta)菌株UEZC1。
本發明的另一目的在于提供該能產抗真菌抗生素的茭白黑粉菌菌株在產生抗真菌抗生素方面的用途。
能產抗真菌抗生素的茭白黑粉菌(Ustilago esculenta或Yenia esculenta)菌株UEZC1，其冬孢子萌發后形成的擔孢子和短菌絲的特征描述為冬孢子在馬鈴薯葡萄糖液體培養基上萌發后先形成擔子原菌絲，在其上產生1～4個具隔的擔孢子原菌絲，在擔孢子原菌絲的分隔處或頂部側生或頂生次生擔孢子原菌絲或擔孢子或小孢子，擔孢子極易脫落，擔孢子梭形，棒形，柱形，尤以梭形最多，兩端尖銳或略鈍圓，15.0～45×1.5～6μm；擔孢子脫落后，從兩端或一端繼續發育伸長，擔孢子兩端首先變細伸出極細的菌絲，后慢慢伸長膨大至與原菌絲長寬相近時，在伸出細菌絲處產生一分隔，隨后繼續生長，最后形成梭狀短菌絲，梭狀短菌絲分隔；菌絲可于分隔處產生1～3級分支，或不分支直接著生擔孢子，擔孢子兩端尖銳或略鈍圓，1.50～6.0×16.5～225.0μm。
本發明的菌株UEZC1，其分類命名為茭白黑粉菌(Ustilago esculenta或Yenia esculenta)，已于2006年2月11日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC保藏。
能產抗真菌抗生素的茭白黑粉菌菌株(Ustilago esculenta或Yeniaesculenta)UEZC1的分離純化方法將老熟茭白用自來水沖洗去表面的污物，晾干，再用75％的酒精搽拭表面。待揮去酒精后，用無菌小刀縱向切開，取適量孢子粉加入有玻璃珠和0.05％土溫80水溶液的三角瓶中，充分打散冬孢子，終濃度為2×104個/ml即制得均一的冬孢子懸液。取50μl冬孢子懸液涂布PDA瓊脂平板或水瓊脂平板，然后將涂布冬孢子懸液的平板于顯微鏡下觀察，在只有單個冬孢子的位置作標記。28℃恒溫培養4～7天，將標記處長出的菌落轉接PDA斜面，28℃恒溫培養5天即獲得單孢子分離的純培養茭白黑粉菌(Ustilagoesculenta或Yenia esculenta)菌株UEZC1。
本發明的能產抗真菌抗生素的藥食用真菌——茭白黑粉菌菌株，其能為藥肥雙效、廣譜、安全的醫用和農用抗真菌抗生素的工業化生產提供可能。同時為環保、健康、環境友好和可持續發展的戰略和建設生態農業提供條件和保障。
生物法檢測UEZC1菌株對A.niger的拮抗作用具體實施方式
(一)本發明的茭白黑粉菌菌株(Ustilago esculenta或Yenia esculenta)UEZC1的分離純化方法將老熟茭白用自來水沖洗去表面的污物，晾干，再用75％的酒精搽拭表面。待揮去酒精后，用無菌小刀縱向切開，取適量孢子粉加入有玻璃珠和0.05％土溫80水溶液的三角瓶中，充分打散冬孢子，終濃度為2×104個/ml即制得均一的冬孢子懸液。取50μl冬孢子懸液涂布PDA瓊脂平板或水瓊脂平板，然后將涂布冬孢子懸液的平板于顯微鏡下觀察，在只有單個冬孢子的位置作標記。28℃恒溫培養4～7天，將標記處長出的菌落轉接PDA斜面，28℃恒溫培養5天即獲得單孢子分離的純培養茭白黑粉菌菌株(Ustilago esculenta或Yenia esculenta)UEZC1。
(二)冬孢子萌發后形成的擔孢子和短菌絲的特征描述為冬孢子在馬鈴薯葡萄糖液體培養基上萌發后先形成擔子原菌絲，在其上產生1～4個具隔的擔孢子原菌絲，在擔孢子原菌絲的分隔處或頂部側生或頂生次生擔孢子原菌絲或擔孢子，擔孢子極易脫落，擔孢子梭形，棒形，柱形，尤以梭形最多，兩端尖銳或略鈍圓，15.0～45×1.5～6μm；擔孢子脫落后，從兩端或一端繼續發育伸長，擔孢子兩端首先變細伸出極細的菌絲，后慢慢伸長膨大至與原菌絲長寬相近時，在伸出細菌絲處產生一分隔，隨后繼續生長，最后形成梭狀短菌絲，梭狀短菌絲分隔；菌絲可于分隔處產生1～3級分支，或不分支直接著生擔孢子，擔孢子兩端尖銳或略鈍圓，1.50～6.0×16.5～225.0μm。
(三)該微生物菌株培養性狀在PDA瓊脂平板上，置28℃恒溫培養14天菌落圓形，直徑10mm，中部隆起約0.4mm，其中央略微凹陷，表面粗糙，蛋殼黃至肉色；其外有網狀的較細皺褶，乳白色，邊緣齒狀，菌落背面近酪黃。室溫延長培養20天，菌落表面較濕潤，皺褶加粗，中部和邊緣出現白色絮狀菌絲；菌絲無色，壁薄，透明，不易著色。短菌絲1～3級分支或不分支而直接產生擔孢子，梭形，兩端尖銳或略微鈍圓，6.5～225.0×1.5～5.3μm。氣生菌絲是從梭狀短菌絲的兩端或分隔出伸出，寬1.5～1.8μm，稍較短菌絲易染色；在查氏平板上，置28℃恒溫培養14天菌落圓形，直徑可達15mm，中部微隆呈茉莉黃，表面粗糙，有較稀疏的乳白色絨狀菌絲。其外是極細，緊貼平板的放射狀乳白色菌絲；菌落背面，中部由近香水玫瑰黃；梭狀短菌絲12.0～165.0×0.9～6.0μm；在薩氏平板上，置28℃恒溫培養14天菌落圓形，直徑7mm，無氣生菌絲。微隆，表面粗糙，顆粒狀，有皺褶，邊緣圓齒狀，正面近鹿角棕，背面近風帆黃；梭狀菌絲9.0～270.0×1.2～6.8μm。
(四)拮抗實驗——生物檢測法菌懸液、孢子懸液和混菌培養基的制備用0.05％土溫80無菌水溶液洗下活化3代的UEZC1斜面菌苔或指示菌Aspergillus niger(黑曲霉)斜面孢子，轉入帶玻璃珠的三角瓶中，制成均一的菌懸液或孢子懸液。然后取2ml A.niger孢子懸液加入100ml冷卻至55℃～60℃的PDA(瓊脂濃度1.5％)培養基中，混勻，終濃度為5～8×107個/ml。
雙層培養基的制備取10ml備好的PDA培養基傾入7.5cm的無菌培養皿中，待凝固后于其上再傾倒7ml混菌培養基，凝固制得雙層培養基。
拮抗實驗用瓊脂擴散法取200μl UEZC1菌懸液涂布PDA平板，28℃恒溫培養7天，然后用打孔器從平板上取帶菌圓形瓊脂塊置于雙層培養基上，28℃恒溫培養3～4天后觀察，UEZC1對A.niger有很強的拮抗作用(如圖所示)。
權利要求
1.一種能產抗真菌抗生素的茭白黑粉菌(Ustilago esculenta或Yeniaesculenta)菌株UEZC1，其特征在于冬孢子萌發后形成的擔孢子和短菌絲的特征描述為冬孢子在馬鈴薯葡萄糖液體培養基上萌發后先形成擔子原菌絲，在其上產生1～4個具隔的擔孢子原菌絲，在擔孢子原菌絲的分隔處或頂部側生或頂生次生擔孢子原菌絲或擔孢子或小孢子，擔孢子極易脫落，擔孢子梭形，棒形，柱形，尤以梭形最多，兩端尖銳或略鈍圓，15.0～45×1.5～6μm；擔孢子脫落后，從兩端或一端繼續發育伸長，擔孢子兩端首先變細伸出極細的菌絲，后慢慢伸長膨大至與原菌絲長寬相近時，在伸出細菌絲處產生一分隔，隨后繼續生長，最后形成梭狀短菌絲，梭狀短菌絲分隔；菌絲可于分隔處產生1～3級分支，或不分支直接著生擔孢子，擔孢子兩端尖銳或略鈍圓，1.50～6.0×16.5～225.0μm。
2.如權利要求1所述的能產抗真菌抗生素的茭白黑粉菌(Ustilagoesculenta或Yenia esculenta)菌株UEZC1在產抗真菌抗生素方面的用途。
全文摘要
本發明公開了一種能產抗真菌抗生素的茭白黑粉菌(Ustilago esculenta或Yenia esculenta)菌株UEZC1及其用途，其特征在于冬孢子萌發后形成的擔孢子和短菌絲的特征描述為冬孢子在馬鈴薯葡萄糖液體培養基上萌發后先形成擔子原菌絲，在其上產生1～4個具隔的擔孢子原菌絲，在擔孢子原菌絲的分隔處或頂部側生或頂生次生擔孢子原菌絲或擔孢子或小孢子，擔孢子脫落后，從兩端或一端繼續發育伸長，擔孢子兩端首先變細伸出極細的菌絲，后慢慢伸長膨大至與原菌絲長寬相近時，在伸出細菌絲處產生一分隔，隨后繼續生長，最后形成梭狀短菌絲，菌絲可于分隔處產生1～3級分支，或不分支直接著生擔孢子，擔孢子兩端尖銳或略鈍圓。本發明能產生抗真菌抗生素，為開發和生產醫用和農用抗真菌抗生素提供可能。
文檔編號C12P1/02GK1821382SQ200610050940
公開日2006年8月23日 申請日期2006年2月14日 優先權日2006年2月14日
發明者周禮紅, 程龍, 梁宗琦 申請人:貴州大學, 程龍