一種抗生素pc190723抗性基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種抗生素PC190723抗性基因，其特征在于：其核苷酸序列為：（1）、序列表中SEQIDNo.2中核苷酸序列；（2）、與（1）中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；（3）、對上述1）或2）所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；（4）、與（1）中所示的核苷酸序列編碼相同蛋白的核苷酸序列。本發明還提供上述抗性基因的應用。當超表達本發明的抗性基因時可以幫助放線菌（例如ArthrobacterstrainA3）生存在含有PC190723的培養基中。因此利用該抗生素抗性基因可以構建出許多方便分子生物學研究與醫藥開發使用的商業化載體，具有很好的推廣使用價值。
【專利說明】—種抗生素PC190723抗性基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種抗生素PC190723抗性基因及其應用。
【背景技術】
[0002]大多數細菌都以二分裂方式進行分裂繁殖。在細菌細胞正常分裂時，細胞膜和細胞壁在細菌中部內陷并在兩個新復制的染色體間形成環狀復合物，膜結構的肽聚糖隨后水解將細胞一份為二。在這一過程中，FtsZ蛋白在GTP的參與下最早在細胞中部聚合成環狀骨架Z環，再與其他相關蛋白結合，從而引發并控制原核生物的細胞分裂過程。Z環位于細胞分裂處胞膜的內表面，受到多種調控水平的調控，同時標志著將來分裂的位置。
[0003]FtsZ是最保守的細菌分裂蛋白，幾乎存在于所有的細菌中。它由Rossmann折疊形成的N-端GTP酶區域和分支酸變位酶折疊的C-端GTP酶激活區域通過中心的螺旋H7和環T7相連接。FtsZ是人類微管蛋白的結構相似物，有證據表明這兩種蛋白在進化上具有相關性，不過只有10%-18%蛋白質序列相似。人類微管蛋白已經是用于抗腫瘤藥物設計的一個成熟祀點。然而，經典的微管蛋白抑制劑如nocodazole和paclitaxel等不能顯著抑制 FtsZ聚合或GTP酶的活性。這表明，FtsZ和微管蛋白在化學結構和生物學功能等方面存在很大差異，有可能設計出選擇性抑制FtsZ而不抑制人類微管蛋白的化合物。同時FtsZ和人類微管蛋白的同源性也為設計選擇性抑制劑提供了有一個很好的切入點。基于FtsZ蛋白在細菌細胞分裂的重要作用，人們希望以它為靶點發現新型抗菌藥物。
[0004]隨著基因組學、蛋白質組學及近期發展的細胞生物技術在細菌研究上的應用，對于全新抗菌藥作用靶位點的研究取得了重要進展。細胞分裂是細菌繁殖的基本過程，其中關鍵蛋白FtsZ作為一個具有潛力的藥物作用全新靶點，已有用于研發新型抗菌藥物的報道。
[0005]PC190723是一個于2008年報道的FtsZ抑制劑類抗生素。該抗生素是通過與FtsZ 結合抑制FtsZ聚合后的解聚過程，最終達到抑制細菌分裂的目的。該抗生素可以明顯抑制耐藥的金黃色葡萄球菌在小鼠體內、體外的生長，是一種新型有效的抗生素分子。
【發明內容】
[0006]本發明通過構建節桿菌超表達文庫，利用抗生素PC190723對文庫進行篩選，獲得了一個該抗生素的抗性基因。當超表達該抗性基因時可以幫助放線菌(例如 ArthrobacterstYain A3)生存在含有PC190723的培養基中。PC190723是細菌分裂過程中必須蛋白FtsZ的抑制劑，自2008發現至此尚未報道過該抗生素的抗性基因，本發明首次發現并報道該抗性基因。由于該抗性基因較短(900bp)，而對應的抗生素較新，因此利用該抗生素抗性基因可以構建出許多方便分子生物學研究與醫藥開發使用的商業化載體。因而， 具有很好的推廣使用價值。
[0007]本發明提供一種抗生素PC190723抗性基因，其特征在于:其核苷酸序列為1)、序列表中SEQID N0.2中核苷酸序列；
2)、與(I)中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；
3)、對上述I)或2)所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；
4)、與(I)中所示的核苷酸序列編碼相同蛋白的核苷酸序列。
[0008]本發明的第二個目的是提供一種重組蛋白，其由權利要求1所述的核苷酸序列編碼。
[0009]本發明的第三個目的是提供一種重組菌，其含有權利要求2所述的重組蛋白。
[0010]本發明的第四個目的是提供上述的抗性基因、重組蛋白或重組菌在含抗生素 PC190723的培養基中的應用。
[0011]優選地，所述應用為權利要求1所述的抗性基因在放線菌中表達后，重組放線菌能在含抗生素PC190723的培養基中存活。
[0012]優選地，所述應用為權利要求2所述的重組蛋白在放線菌中表達后，重組放線菌能在含抗生素PC190723的培養基中存活。
[0013]優選地，所述應用為權利要求3所述的重組菌能在含抗生素PC190723的培養基中存活。
[0014]優選地，所述放線菌為節桿菌A3。
[0015]本發明通過構建`節桿菌超表達文庫，利用抗生素PC190723對文庫進行篩選，獲得了一個該抗生素的抗性基因。當超表達該抗性基因時可以幫助放線菌(例如 ArthrobacterstYain A3)生存在含有PC190723的培養基中。PC190723是細菌分裂過程中必須蛋白FtsZ的抑制劑，自2008發現至此尚未報道過該抗生素的抗性基因，本發明首次發現并報道該抗性基因。由于該抗性基因較短(900bp)，而對應的抗生素較新，因此利用該抗生素抗性基因可以構建出許多方便分子生物學研究與醫藥開發使用的商業化載體。因而， 具有很好的推廣使用價值。
【具體實施方式】
[0016]下面的實施例有助于本領域技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0017]下述實施例中所用的方法如無特別說明均為常規方法。
[0018]限制性內切酶1、及麗TI，堿性磷酸酶，T4 DNA連接酶均購自NEB公司； 節桿菌超表達載體pART2由Freiburg University的Cristinel Sandu教授惠贈； 節桿菌 Arthrobacter strain A3 為市售；
DNA凝膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5 a感受態細胞購自天根生化科技(北京)有限公司。
[0019]實施例1節桿菌超表達文庫的構建 1、節桿菌基因組隨機酶切
利用限制性內切酶I IOU對75 i! g節桿菌總DNA在進行隨機酶切15分鐘(50 U I 的體系為:NEBufferl.1 IOX h UNEB SauJAl I u I, DNA 44y L，反應溫度為 37°C )，通過瓊脂糖凝膠電泳分離獲得大小在0.75-2kb隨機切碎的DNA片段，并通過DNA凝膠回收試劑盒對DNA進行濃縮回收。[0020]2、節桿菌超表達文庫質粒的構建
利用限制性內切酶及麗TI IOU對25 ii g節桿菌超表達載體pART2進行酶切2h (50 U I的體系為:NEBuffer3.1 IOX 5 u L，BamHl lul, DNA 44 u L,反應溫度為 37°C )，并通過堿性磷酸酶對DNA進行去磷酸化處理lOmin，防止載體在下面的連接過程中發生自連。通過DNA 凝膠回收試劑盒對切開的載體進行回收。
[0021]利用T4 DNA連接酶IOOU對步驟I中獲得的節桿菌基因組隨機酶切片段與步驟2 中制備獲得的線性載體進行連接，16°C過夜。
[0022]將連接產物通過電擊轉化到大腸桿菌DH5 a感受態細胞中。電擊條件為:2500V、 25UF.200Q以及2mm電擊杯。涂布在含有卡那霉素(20 y g/ml)的LB平板上，37°C下培養。
[0023]3、抗生素PC190723抗性基因的篩選
將步驟2中獲得的超表達文庫質粒通過電擊轉化到節桿菌電擊感受態(將節桿菌 Arthrobacter strain A3 在 LB 平板中于 20°C下養到 0D600=0.6 時,用 4°C 的 10% 甘油洗 3 次，重懸即可制得節桿菌電擊感受態。)中。電擊條件為:2500V、25uF、800Q以及2mm電擊杯。涂布在含有卡那霉素(140ii g/ml)、PC190723 (I y g/ml)的LB平板上20oC篩選培養。
[0024]從可在該培養基中生長的節桿菌中提取質粒并測序，測序得到的核苷酸序列參見序列表中 SEQ ID N0.1，共 987bp。
[0025]實施例2抗生素PC190723抗性基因(aap)功能的驗證
1、抗生素PC190723抗性基因編碼區
通過生物信息學分析發現序列表中SEQ ID N0.1的序列中存在一個開放閱讀框:第 87-986位核苷酸為開放閱讀框區，即抗生素PC190723抗性基因(aap)，核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.2，開放閱讀框區核苷酸編碼的蛋白序列參見序列表中SEQ ID N0.，3。
[0026]2、抗生素PC190723抗性基因(aap)功能的驗證
根據開放閱讀框區核苷酸序列設計引物，利用引物Pl:5’ AAGGATCCGGTGATGAATACCCATGCCGC 3’ 與 P2:5’ AATCTAGACTAGCTCCGGCGTCGTACGGG 3’ 以節桿菌A3基因組為模板進行PCR擴增。PCR反應體系25 u L: Proof DNA聚合酶2 y L，
IXProof buffer 2.5 u L, 25 mmol/L MgCl2 3 u L, 10 mmol/L dNTP 0.5 u L, DNA 模板 2uL,引物各lOpmol，其余為水。PCR反應條件為:94°C預變性2 min ;98°C變性10 S，68。。 延伸30 S，反應30個循環。
[0027]通過BamHl與Xba I對PCR產物和pART2分別進行雙酶切(50 的體系為: NEBuffer2.1 10X 5u L, NEB BamHI I u I, NEB XbaI I u I, DNA 43 y L，反應溫度為 37 °C )。
[0028]利用T4 DNA連接酶連接上述兩個酶切產物(20 的體系為:NEB T4DNA Ligase Reaction Buffer 10X 2 u L, NEB T4 DNA Ligasel u I,連接產物 13 u L,載體 4yL，反應溫度為20°C，反應時間16 H)。將連接產物電擊轉入大腸桿菌 DH5 a感受態細胞中，電擊條件為:2500V、25iiF、200Q以及2mm電擊杯，篩選獲得正確的連接克隆，提取質粒并電擊轉化至節桿菌A3中。電擊條件為:2500V、25iiF、800Q以及2mm電擊杯。涂布在含有卡那霉素(140ii g/ml)、PC190723 (I y g/ml)的LB平板上20°C篩選培養。將在該篩選培養基中生長的單克隆菌(即含抗生素PC190723抗性基因(aap)的節桿菌)以及僅帶有pART2質粒的節桿菌(陰性對照)分別接種到含有卡那霉素(140ii g/ml)、PC190723 (lu g/ml)的 LB液體培養基中培養。發現只有含抗生素PC190723抗性基因(aap)的節桿菌可以在含有 PC190723 (I u g/ml)的LB液體培養基中存活。
[0029]最后應說明的是:以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明， 盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。 凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
序列表
<110>中國科學院寒區旱區環境與工程研究所 〈120〉一種抗生素PC190723抗性基因及其應用 〈160〉 I
<170> PatentIn version 3.3
〈210〉 I
〈211〉 987
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 I
【權利要求】
1.一種抗生素PC190723抗性基因，其特征在于:其核苷酸序列為(1)、序列表中SEQID N0.2中核苷酸序列；(2)、與(1)中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；(3)、對上述1)或2)所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；(4)、與(1)中所示的核苷酸序列編碼相同蛋白的核苷酸序列。
2.重組蛋白，其由權利要求1所述的核苷酸序列編碼。
3.重組菌，其含有權利要求2所述的重組蛋白。
4.權利要求1所述的抗性基因、權利要求2所述的重組蛋白或權利要求3所述的重組菌在含抗生素PC190723的培養基中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:所述應用為權利要求1所述的抗性基因在放線菌中表達后，重組放線菌能在含抗生素PC190723的培養基中存活。
6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:所述應用為權利要求2所述的重組蛋白在放線菌中表達后，重組放線菌能在含抗生素PC190723的培養基中存活。
7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:所述應用為權利要求3所述的重組菌能在含抗生素PC190723的培養基中存活。
8.根據權利要求5-7任一所述的應用，其特征在于:所述放線菌為節桿菌A3。
【文檔編號】C12N15/31GK103555736SQ201310518999
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】陳熙明, 張昺林, 張威, 張滿效, 陳拓, 劉光琇 申請人:中國科學院寒區旱區環境與工程研究所