3號染色體上與水稻黑條矮縮病抗性qtl緊密連鎖的ssr標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種與水稻抗黑條矮縮病主效QTL緊密連鎖的分子標記。本發明的實質是根據連鎖分離規律，以特特勃和RBSDV感病品種雜交后代F2群體為作圖群體，通過抗病性鑒定結果和SSR標記數據間的連鎖分析，獲得了3號染色體上與水稻黑條矮縮病抗性主效QTL緊密連鎖的SSR標記RM5626和RM7097。通過檢測特特勃及其衍生品種(系)與RBSDV感病品種雜交組合后代單個水稻植株的SSR標記帶型，可以判斷該植株是否具有水稻黑條矮縮病抗性，將其應用于特特勃及其衍生品種(系)/RBSDV感病品種水稻黑條矮縮病抗病品種的輔助選擇育種中，可以克服常規育種中水稻黑條矮縮病抗性鑒定穩定性和重復性差、費時費力和技術門檻高等缺點，其結果可以簡化選擇方法和提高育種效率，進而加快抗黑條矮縮病水稻病品種的選育進程。
【專利說明】3號染色體上與水稻黑條矮縮病抗性QTL緊密連鎖的SSR
標記及其應用
【技術領域】:[0001]本發明涉及3號染色體上一種與水稻黑條矮縮病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記RM5626和RM7097,可應用于分子標記輔助育種,屬于水稻抗病育種和分子生物學領域。
【背景技術】:[0002]水稻黑條矮縮病，病原為水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwavf virus, RBSDV)，是一種由灰飛虱以持久性不經卵方式傳播的惡性病毒病。感染RBSDV水稻病株大都不能抽穗，減產嚴重，除水稻外，還危害小麥、玉米、大麥及高粱等作物。20世紀 60,90年代后期該病害在華北、華東等地暴發成災，近年來，感病品種的廣泛種植及稻麥輪作方式的推廣和冬季氣候變暖等環境條件的變化使傳毒介體灰飛虱的發生量不斷上升，導致該病害在華東稻區大面積發生。迄今為止，幾乎沒有能有效防治病毒病的化學藥劑，治蟲防病的應急措施無法作為一項長期策略，利用品種自身抗病性是防治病毒病最為經濟、 有效的方法。目前，對于水稻黑條矮縮病抗性遺傳的研究報道較少，研究結果(作物學報， 2009,35(12):2213-2217 ;作物學報，2010，36 (8):1258-1264 ；Molecular Breeding, 2012, 29(4):925-938)多表現數量性狀的特征，但不同研究的抗性基因位點不相同，也有研究 (Treat ofCrop Res, 2007 (8):105-115)發現普通野生稻導入系對水稻黑條矮縮病的抗性由一對顯性核基因控制，其抗性為質量性狀。這表明不同來源的水稻資源中可能存在差異化的水稻黑條矮縮病抗性機制，而且遺傳機制較為復雜。[0003]水稻黑條矮縮病重病區田間鑒定方法方便快捷，但因其易受環境條件、年度和區域間灰飛虱發生情況(發生量和帶毒率)不一致等因素影響了結果的重演性，導致不同研究間抗性鑒定結果相去甚遠，另外重病區田間鑒定極易受到同時由灰飛虱傳播的水稻條紋葉枯病的干擾。人工接種鑒定方法(植物保護學報，2011，38 (4) =301-305)是在可控條件下開展的一種抗性鑒定，利用其評價水稻品種對水稻黑條矮縮病的抗性水平，除了可以很好地克服田間鑒定中難以規避的兩個問題外，還可以拓寬鑒定時間，但是由于RBSDV不經灰飛虱卵傳，使得該方法相對費時費力。導致抗性鑒定成為水稻黑條矮縮病育種工作進展緩慢的重要原因之一。[0004]分子標記輔助育種技術有效的解決了這一問題，通過構建重要抗源的遺傳連鎖圖譜和數量性狀位點(Quantitative Trait Locus,QTL)分析,可以有效的找到與水稻黑條矮縮病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記，使用這些標記可以對該抗源的后代及其衍生品系在苗期進行早世代篩選，淘汰感病植株，不僅節約了成本，還提高了育種效率。
【發明內容】
:[0005]本發明針對上述研究背景，以篩選到的水稻黑條矮縮病抗病品種特特勃和感病主栽品種淮稻5號為材料,在842對(http://www.gramene.0rg)微衛星標記中篩選到160個多態性SSR標記，從中選用127個SSR標記對淮稻5號/特特勃F2群體進行分析，構建水稻遺傳連鎖圖譜，將其與F2:3家系的抗病性鑒定結果進行連鎖分析，獲得了 3號染色體上與水稻黑條矮縮病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記RM5626和RM7097，可應用于水稻黑條矮縮病抗病品種的輔助選擇育種。
[0006]本發明所提供的3號染色體上與水稻黑條矮縮病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記RM5626和RM7097，是通過以下方法獲得的:
[0007]I)感病品種淮稻5號(早)與抗病品種特特勃(色)雜交獲得雜種FpF1自交得 F2作圖群體單株收獲F2:3家系種子用于抗病性鑒定；
[0008]2) CTAB法提取親本、F1及F2群體DNA ；
[0009]3)利用選出的127對SSR引物對親本、F1及F2群體進行PCR擴增，擴增產物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，獲得分子標記數據，構建遺傳連鎖圖；
[0010]4)采用人工接種鑒定方法測定F2:3家系的抗病性，以發病與否區分為抗病和感病；
[0011 ] 5)根據標記帶型用Mapmaker/Exp3.0軟件計算出標記間連鎖遺傳距離，并用 Mapdraw軟件根據各標記在染色體上的位置畫圖，構建水稻遺傳連鎖圖譜；
[0012]6)采用基于復合區間作圖法的軟件Windows QTL Cartographer V2.5檢測水稻黑條矮縮病的抗性QTL。LOD值的閾值定為2.0，按P = 0.005概率值檢測抗性QTL的數目及其在染色體上的位置。
[0013]3號染色體上與水稻黑條矮縮病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記RM5626和 RM7097的應用包括:以特特勃其衍生品種(系)與RBSDV感病品種雜交組合后代的單個水稻植株為對象，通過檢測其3號染色體上RM5626和RM7097標記的帶型數據，可以預測該植株對水稻黑條矮縮病的抗性。
[0014]本發明能克服常規育種中水稻黑條矮縮病抗性鑒定穩定性、重復性較差及費時費力等缺點，其結果可以簡化選擇方法和提高育種效率，進而加快抗病品種的育種進程。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0015]圖1利用淮稻5號/特特勃F2群體構建的分子連鎖圖譜
[0016]圖2特特勃中水稻黑條矮縮病抗性QTL遺傳連鎖群定位分析示意圖
[0017]其中:包含QTL的連鎖群區段被顯示，左側為標記間遺傳距離(CM);右側為標記名稱。
【具體實施方式】:
[0018]下面實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
[0019]實施例1，與水稻黑條矮縮病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記的獲得
[0020]1、植物材料
[0021]2008年在江蘇省農科院大田種植親本淮稻5號和特特勃，并雜交獲得雜種F1,次年？:自交得F2種子，2009年在海南繁殖F2群體，作為作圖群體。F2單株編號，分蘗期取親本、雜種F1及F2群體各單株的部分葉片，_70°C冰箱保存用于SSR分析，F2群體單株收種， 以備表型鑒定。2010年對感病主栽品種淮稻5號、抗病品種特特勃、F1和F2:3家系進行人工接種鑒定(植物保護學報，2011，38 (4):301-305)。[0022]2、傳毒介體的篩選
[0023]于江蘇鹽城、徐州、連云港等水稻黑條矮縮病重病區采集表現RBSDV癥狀(浙江農業科學，1984，(4) =185-192.)的水稻病株，通過RT-PCR方法(江蘇農業學報，2009，25 (6): 1263-1267)檢測病株是否攜帶RBSDV，利用水稻條紋葉枯病毒(RSV)外殼蛋白基因對應的引物(CP-F:ATGGGTACCAACAAGCC, CP-R:CTAGTCATCTGCACCTT)檢測病株，選取不攜帶 RSV 的 RBSDV病株作為毒源。將1-2齡無毒灰飛虱若蟲在毒源上飼毒2-3d，而后移入育有武育粳3 號秧苗的燒杯中飼養使其度過循回期，12-13d后從每杯中隨機取出30頭經DIBA方法(南京農業大學碩士論文，2012，杜琳琳)測定其帶毒率，用于測算有效接種蟲量[有效接種蟲量(蟲)=接種蟲量(蟲)X帶毒率(％)]。
[0024]3、DNA 提取(CTAB 法)
[0025]I)稱取500mg水稻葉片置于2.0mL Eppendorf管中，將離心管置于液氮中冷卻，灌滿液氮后迅速取出，用研磨棒研磨成粉末狀；
[0026]2)65°C條件下水浴 1-1.5h，15min 震蕩 I 次；
[0027]3)4°C條件下13，OOOrpm離心lOmin，取上層水相；
[0028]4)加入900 u L氯仿:異戊醇溶液(24: I)，充分混勻震蕩至溶液顏色由綠色變為白色；
[0029]5)4°C條件下13，OOOrpm離心lOmin，取上層水相；
[0030]6)加入等體積異丙醇 (或2倍體積無水乙醇)，_20°C條件下靜置20_30min，沉淀出絮狀DNA ；
[0031]7)4°C條件下13，OOOrpm離心lOmin，棄上清，加入lmL70%乙醇洗滌，4°C條件下 13，OOOrpm離心5min,棄上清并用濾紙吸干,置于超凈臺上晾干。
[0032]8)加30 ii L去離子水溶解DNA，4°C保存備用。
[0033]用Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀測定OD值和濃度,將各樣品 DNA稀釋至20ng/ u L備用。
[0034]4、SSR標記分析
[0035](I) PCR 擴增
[0036]采用10 ii L的PCR反應體系，如表1 ;
[0037]表1PCR反應體系
【權利要求】
1.一種與水稻黑條矮縮病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記，其特征在于:以RBSDV 感病品種/特特勃雜交后代F2群體為作圖群體，通過簡單重復序列標記(SSR)數據和抗病性鑒定結果間的連鎖分析，獲得3號染色體上與水稻黑條矮縮病抗性主效QTL連鎖的分子標記 RM5626 和 RM7097。
2.按照權利I所獲得一種與RBSDV感病品種/特特勃組合中水稻黑條矮縮病抗性主效 QTL連鎖的分子標記的應用，其特征在于:以特特勃及其衍生品種(系)與R BSDV感病品種雜交后代的單個水稻植株為對象，通過檢測其分子標記RM5626和RM7097的帶型數據，可以判斷該植株是否具有水稻黑條矮縮病抗性。
【文檔編號】C12Q1/68GK103555718SQ201310576578
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月18日 優先權日:2013年11月18日
【發明者】周彤, 杜琳琳, 周益軍, 王英, 王躒姣, 蘭瑩, 孫楓 申請人:江蘇省農業科學院