5號染色體上與lrpw相關水稻干尖線蟲抗性qtl連鎖的ssr標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標記。本發明的實質是根據連鎖分離規律，以水稻干尖線蟲抗病品種Tetep和感病品種淮稻5號雜交后代F2群體為作圖群體，通過水稻干尖線蟲抗性鑒定結果和SSR標記數據間的連鎖分析，獲得5號染色體上與穗重損害率(LRPW)相關2個水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的SSR標記RM163，RM18620和RM440，RM161。通過檢測Tetep及其衍生品種(系)與水稻干尖線蟲感病品種雜交組合后代單個水稻植株的SSR標記帶型，可以判斷該植株是否具有水稻干尖線蟲抗性，將其應用于Tetep及其衍生品種(系)/感病品種水稻干尖線蟲抗病品種的輔助選擇育種中，可以克服常規育種中水稻干尖線蟲抗性鑒定穩定性、重復性差及費時費力等缺點，其結果可以簡化選擇方法和提高育種效率，進而加快抗水稻干尖線蟲水稻病品種的選育進程。
【專利說明】5號染色體上與LRPW相關水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的SSR標記及其應用
【技術領域】:
[0001]本發明涉及水稻5號染色體上與LRPW相關2個水稻干尖線蟲抗性QTL(qLRPW5a，qLRPWSb)連鎖的分子標記RM163，RM18620和RM440，RM161，可應用于分子標記輔助育種，屬于水稻抗病育種和分子生物學領域。
【背景技術】:
[0002]水稻干尖線蟲是一種水稻外寄生病原物，其典型癥狀是葉片尖部扭曲成干尖，該病害一旦發生會使糧食產量損失慘重(Journal of the faculty of Agriculture,Kyushu, University,1950,9(3):309-333 ；Nematologica,1975,21 (3):351-357；Journalof Agricultural Technology, 2011, 337-344)。水稻干尖線蟲傳統控制方法成本大,還會造成嚴重的環境問題(Journal of Agricultural Science and Technology, 2011,14 (I):195-203)。利用水稻品種自身抗性是控制水稻干尖線蟲最經濟、環保、有效的策略(Annualreview of phytopathology,2001,39 (I):285-312 ;Plant resistance to parasiticnematodes,2002,141-151)。
[0003]育種家曾篩選到一些水稻干尖線蟲抗性品種，如cvs Arkansas Fortuna,Nira43, Asa-Hi, Binam, Domsiah 等(Phytopathology, 1949, 39 ；Bulletin of the KyushuAgricultural Experiment Station,1953,I(3):339-349 ;Journal of AgriculturalScience and Technology, 2011,14 (I): 195-203)。但有些水稻干尖線蟲抗性品種要么僅在特一地區表現抗性，要么僅對水稻干尖線蟲表現抗性，對其他病原物高度敏感或僅有較低的產量(Plant parasitic nematodes in subtropical and tropical agriculture,2005,87-130)。另外，水稻干尖線蟲種群的遺傳變異會降低抗性品種的有效抗性，甚至造成品種抗性的消失。目前，水稻品種對水稻干尖線蟲抗性的遺傳基礎及其分子機制也不清楚。闡明水稻對干尖線蟲的抗性遺傳基礎及其分子機制有助于更深入的了解線蟲與水稻的互作機制，為線蟲抗性育種奠定基礎(The Plant Journal2004, 38 (2):285-297)。另外，為寄主植物線蟲抗性基因的鑒定和分離以及進一步在分子和生化水平上研究線蟲與植物的互作機制提供了新的視野(The Plant Journal，2002，31 (2):127-136)。迄今，在甜菜、番茄、馬鈴薯、大豆等作物中定位到Hl、GroVl、Cre、Mi3等許多線蟲抗性位點(Genome, 1993, 36 (I):152-156 ;Molecular Breeding,1996, 2(I):51-60 !Theoretical and Applied Genetics,1994,89(7-8):927-930 !Theoretical and Applied Genetics,1995,91 (3):457-464)。而且，已克隆到Hslpro-1、M1-1、HeroA和Gpa2等幾個線蟲抗性基因并對這些抗性基因進行了遺傳和功能分析(Sciencel997, 275 (5301):832-834 ；Nature biotechnology, 1998,16(13): 1365-1369 ；The Plant Journal,2002,31 (2):127-136 ;The Plant Journal,2000,23(5):567-576)，這極大的增強了我們對這些寄主作物線蟲抗性的分子機制的認識。然而，目前未見關于水稻品種對水稻干尖線蟲抗性的數量性狀位點(Quantitative TraitLocus, QTL)或基因的報道，對水稻干尖線蟲的抗性研究僅在品種抗性鑒定水平上，這極大的限制了水稻干尖線蟲抗性資源在抗性育種中的有效利用。
[0004]分子標記輔助育種技術有效的解決了這一問題，通過構建重要抗源的遺傳連鎖圖譜和QTL分析，可以有效的找到與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標記，使用這些標記可以對該抗源的后代及其衍生品系在苗期進行早世代篩選，淘汰感病植株，不僅節約了成本，還提聞了育種效率。
【發明內容】
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[0005]本發明針對上述研究背景，以篩選到的水稻干尖線蟲抗病品種Tetep和感病主栽品種淮稻5號為材料,在842對(http://www.gramene.0rg)微衛星標記中篩選到160個多態性SSR標記，從中選用127個SSR標記對淮稻5號/Tetep F2群體進行分析，構建水稻遺傳連鎖圖譜，將其與F2: 3家系水稻干尖線蟲人工接種鑒定后的穗重損害率(loss rate ofpanicle weight, LRPff)之間進行連鎖分析,獲得了 5號染色體上與2個水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的SSR標記RM163，RM18620和RM440，RM161，可應用于水稻干尖線蟲抗病品種的分子輔助選擇育種。
[0006]本發明所提供的5號染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的SSR標記RM163，RM18620, RM440和RM161，是通過以下方法獲得的:
[0007]I)感病品種淮稻5號(早)與抗病品種Tet印(^ )雜交獲得雜種F1, F1自交得F2群體，單株收獲F2: 3家系種子用于抗性鑒定；
[0008]2) CTAB法提取親本、F1及F2群體138個單株的DNA ；
[0009]3)利用選出的127對SSR引物對親本、F1及F2群體進行PCR擴增，擴增產物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，獲得分子標記數據，構建遺傳連鎖圖；
[0010]4)親本淮稻5號、Tetep及其雜交后代F1和F2: 3家系進行水稻干尖線蟲人工接種鑒定，種子成熟后單穗收種，計算LRPW，LRPff =(對照單穗重-處理單穗重)/對照單穗重。
[0011]5)根據標記帶型用MAPMAKER/EXP3.0軟件計算出標記間連鎖遺傳距離，并用Mapdraw根據各標記在染色體上的位置畫圖，構建水稻遺傳連鎖圖譜；
[0012]6)采用基于復合區間作圖法的軟件Windows QTL Cartographer V2.5檢測水稻干尖線蟲的抗性QTL。LOD值的閾值定為2.5，按P = 0.05概率值檢測抗性QTL的數目及其在染色體上的位置。
[0013]5號染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標記RM163，RM18620，RM440和RM161的應用包括:以Tetep及其衍生品種(系)與水稻干尖線蟲感病品種雜交組合后代的單個水稻植株為對象，通過檢測其5號染色體上RM163，RM18620, RM440和RM161標記的帶型數據，可以預測該植株對水稻干尖線蟲的抗性。
[0014]本發明能克服常規育種中水稻干尖線蟲抗性鑒定穩定性、重復性較差及費時費力等缺點，其結果可以簡化選擇方法和提高育種效率，進而加快抗病品種的育種進程。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0015]圖1利用淮稻5號/Tet印F2群體構建的分子遺傳連鎖圖譜
[0016] 圖25號染色體上與LRPW相關的水稻干尖線蟲抗性QTL遺傳連鎖群定位分析示意圖
[0017]注:?代表與LRPW相關的QTL連鎖群區段，左側為標記間遺傳距離(cM);右側為標記名稱
【具體實施方式】:
[0018] 下面實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
[0019]實施例1，與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標記的獲得
[0020]1、植物材料
[0021]2008年在江蘇省農科院大田種植淮稻5號和Tet印，并雜交獲得雜種F1，次年F1自交得F2種子，2009年在海南繁殖F2群體，作為作圖群體。F2單株編號，分蘗期取親本、雜種F1及F2群體各單株的部分葉片，_70°C冰箱保存用于SSR分析，F2群體單株收種，以備表型鑒定。
[0022]2、線蟲的培養與分離
[0023]將灰葡萄抱菌(Botrytiscinerea)菌塊接種在 Potato Dextrose Agar (PDA)培養基上25°C培養,待灰葡葡孢菌長滿培養基后,用3%雙氧水對水稻干尖線蟲表面消毒IOmin,滅菌超純水洗滌3次后，將約400頭水稻干尖線蟲接種到長滿培養基的灰葡萄孢菌上，于 25°C 培養 20d 左右(Journal of nematology, 2009,41 (I):17)。用 Baermann 漏斗技術分尚培養的水稻干尖線蟲，并用3%雙氧水表面消毒(Rice Science, 2009,16 (4):301-306)，無菌水沖洗后收集線蟲，作為接種材料。
[0024]3、CTAB 法提取 DNA
[0025]I)稱取500mg水稻葉片置于2.0mL Eppendorf管中，將離心管置于液氮中冷卻，灌滿液氮后迅速取出，用研磨棒研磨成粉末狀；
[0026]2)65°C條件下水浴 1-1.5h，15min 震蕩 I 次；
[0027]3)4°C條件下13，OOOrpm離心10min，取上層水相；
[0028]4)加入900 μ L氯仿:異戊醇溶液(24: I)，充分混勻震蕩至溶液顏色由綠色變為白色；
[0029]5)4°C條件下13，OOOrpm離心10min，取上層水相；
[0030]6)加入等體積異丙醇，_20°C條件下靜置20-30min，沉淀出絮狀DNA ；
[0031]7)4°C條件下13，OOOrpm離心10min，棄上清，加入lmL70%乙醇洗滌，4°C條件下13, OOOrpm離心5min,棄上清,置于超凈臺上晾干；
[0032]8)加30 μ L去離子水溶解DNA，4°C保存備用。
[0033]用Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀測定OD值和濃度,將各樣品DNA稀釋至20ng/ μ L備用。
[0034]4、SSR標記分析
[0035](I) PCR 擴增
[0036]采用10 μ L 的 PCR 反應體系:DNA (IOng/ μ L) 1.3 μ L，Primer (4pmol/ μ L) 1.5 μ L，10 X PCR buffer (w/Mg) 1.5 μ L，dNTP (2.5mM) 0.2 μ L, Taq (5U/ μ L)0.1 μ L, ddH205.4 μ L。PCR反應程序:95°C變性5min ;95°C變性30s、54°C退火30s、72°C延伸lmin，進行35個循環；72°C延伸lOmin。產物加入loading buffer中止反應，待用。[0037](2)聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0038]采用8%聚丙烯酰胺凝膠檢測上述PCR反應產物，所用的電泳儀為雙板夾芯垂直電泳槽DYCZ-30型(北京六一儀器廠)。具體操作步驟如下:
[0039]I)用洗潔精把玻璃板反復擦洗干凈，用蒸餾水沖洗，烘箱烘干，組裝玻璃板之前可用酒精擦拭。
[0040]2)將兩塊玻璃板放進橡膠封條內，瓊脂糖凝膠封住底部安裝至電泳槽上。
[0041]3)按表1順序加入各儲液配制丙烯酰胺凝膠，充分搖勻后用移液器將配好的膠均勻注入兩玻璃板之間，再插入梳子，注意防止梳子底部產生氣泡。靜置Ih左右待其凝固。
[0042]表1制備聚丙烯酰胺凝膠所用試劑的體積
[0043]
【權利要求】
1.一種與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標記,其特征在于:以水稻干尖線蟲感病品種與抗病品種Tetep雜交后代F2群體為作圖群體，通過簡單重復序列標記(SSR)數據與水稻干尖線蟲人工接種鑒定后穗重損害率(LRPW)之間的連鎖分析，獲得5號染色體上與LRPW相關的2個水稻干尖線蟲抗性QTL (qLRPW5a, qLRPW5b)連鎖的SSR標記RM163，RM18620和 RM440，RM161。
2.按照權利I所獲得一種與水稻干尖線蟲感病品種/Tetep雜交組合中水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標記的應用，其特征在于:以Tetep及其衍生品種(系)與水稻干尖線蟲感病品種雜交后代的單個水稻植株為對象，通過檢測其分子標記RM163，RM18620, RM440和RM161的帶型數據，可 以判斷該植株是否抗水稻干尖線蟲。
【文檔編號】C12N15/11GK103981180SQ201410239698
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月25日 優先權日:2014年5月25日
【發明者】周彤, 杜琳琳, 周益軍, 高存義, 蘭瑩, 孫楓 申請人:江蘇省農業科學院