基于長探針同時檢測多種微量靶標的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于長探針同時檢測多種靶標的方法，包括以下特征：1）獲取待檢測的靶標及其內參18S?rRNA的核酸序列，再在每種待檢測靶標及其內參18S?rRNA的保守區設計緊密相連的兩條寡核苷酸的鑒別探針；2）設計通用引物及選擇填充物長序列，通用序列Tag2的3′與上游鑒別探針的5′相連組成上游LDR探針，填充物長序列與通用序列Tag1的5′端及下游鑒別探針的3′端相連組成下游LDR長探針；3）將上游LDR探針和下游LDR長探針與待檢測的靶標樣品一起進行連接酶檢測反應；4）利用上、下游通用引物擴增連接產物，通過瓊脂糖核酸電泳獲得條帶信息，從而獲知混合靶標的感染情況。
【專利說明】基于長探針同時檢測多種微量靶標的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種多重性微量檢測分析方法，具體涉及一種基于連接酶反應的新型長探針微量核酸電泳檢測方法。
【背景技術】
[0002]病原體作為一類重要病害微生物，嚴重影響臨床診斷、水與環境分析、食品安全及生物防治等諸多方面。特別是2013年在中國中部地區爆發的H7N9高致病禽流感，再次向人類提出控制和檢測病原體已經成為一項非常必要與緊迫的任務。因此，建立有效的診斷方法對于病原體的防治以及提高動植物的品質都具有非常重要的意義。
[0003]馬鈴薯作為世界性糧食作物之一，長期受到多種馬鈴薯病毒的侵染，對馬鈴薯的產量與品質均造成嚴重的影響。在病毒侵染農作物長期共生進化過程中，寄主通過基因沉默抵御病毒的侵染，而病毒為了對抗寄主基因沉默防御機制產生了具有拮抗功能的沉默抑制因子，這些抑制因子具有解除或干擾宿主的基因沉默途徑的功能(OlivierV, 2001., Lakatos L et al.，2006)。研究這些抑制因子，有助于深入理解病毒與宿主間的相互作用關系，對于進一步防御病原體的具有重要的意義。目前在馬鈴薯病毒中已發現馬鈴薯卷葉病毒(Potato leafroll virus, PLRV)P0 基因、煙草脆裂病毒(Tobacco rattlevirus, TRV) 16kDa基因、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV) 2b基因、甜菜西方黃化病毒(Beet western yellows virus, BWYV) P0 基因、馬鈴薯 Y 病毒(Potato virus Y,PVY)HcPro (Helper component-proteinase)基因、馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)P25基因具有抑制基因沉默的功能(Renovell et al., 2012;Moissiard and Voinnet2004;Chiuet al., 2010; Fukuzawa et al.，2010),這六種抑制因子均是通過 Argonaute (AGO)家族蛋白介導基因沉默。鑒于馬鈴薯能同時被多種病毒感染，極有可能多種抑制因子同時參與抑制多種病毒感染的現象，從而介導基因沉默的現象，同時由于參與介導基因沉默的抑制因子在馬鈴薯中的含量的比較低，因此，建立一種方法同時檢測多種微量病原體就顯得尤為迫切與必要。
[0004]目前涉及植物病原體的檢測方法很多如:指示植物檢測法、電鏡技術、以蛋白為基礎的免疫學方法、核酸介導的分子生物學方法。指示植物檢測法(吳凌娟等，2003 ;徐潔，2002)具有檢測便捷、操作簡單等優點，但需要專門防蟲溫室，培養時間較長，而且需要定期殺蟲與澆水。此外，指示植物與病毒種類的不同，采用的光照和溫度培養的條件也相應的不同。這些條件制約著指示植物鑒定法的應用。吳興泉等(2004)利用電鏡技術成功鑒定帶有花葉癥狀的馬鈴薯感染PVX病毒。但電鏡技術受到以下限制:的操作環境必須是真空，對觀察者的操作技術以及知識儲備要求比較高，同時需要對所檢測的生物樣品進行取材、漂洗、固定、脫水、浸透、包埋、聚合、切片以及染色等步驟的處理，消耗時間長(Najaet al.,2008;Nishiyama et al.，2010)。因此，利用電鏡技術檢測馬鈴薯病毒受到很大的限制。Singh et al (1992)利用免疫學方法成功區分PVYN，PVY0, PVYN:°三種株系，但是ffeidemann et al (1998)利用免疫學檢測技術檢測PVYN和PVYN?時，出現血清交叉反應，并且檢測結果不穩定。此外，免疫學檢測方法不能用于純度與含量低病毒以及缺少外殼蛋白的類病毒檢測。同時該方法容易被污染易產生假陽性(Matic S et al.，2009)。
[0005]核酸介導的分子生物學方法因操作簡單快捷，目前廣泛被應用于各種病原體的檢測檢驗中。常見的核酸介導的分子生物學方法有:聚合酶鏈式反應(Polymerase chainreaction, PCR)、核酸分子雜交技術(Nucleic acid hybridization technique)。PCR 技術利用一對特異性引物與相關試劑擴增DNA的一種特異性方法，與傳統檢測方法以及免疫學方法相比，PCR檢測技術極大地提高病原體檢測的靈敏度和精確性。即使是極其微量的DNA，利用PCR檢測也能達到極易檢測的水平。此外，PCR檢測技術克服了免疫學檢測方法不能檢測類病毒、同種病毒的不同株系以及休眠種薯的缺陷(Erlich, 1989.，Suo etal, 2009., Song et al, 2009., Lee et al，2009)。通常情況下，動植物體同時受到多種病原體入侵感染，因此建立一種同時檢測多種病原體的檢測方法就顯得尤為重要。與普通PCR檢測方法相比，多重PCR檢測技術具有在一次反應中可以檢測多種病原體，降低檢測的時間和成本。但是多重PCR對引物的設計要求特別高，多對引物之間的發夾結構、錯配以及退火溫度的差異都可能導致低效率的擴增，甚至沒有擴增。并且需要對反應條件進行優化，特別需要對引物濃度比進行優化，過程復雜，消耗時間長(Li et al, 2009., Boonham etal, 2003)。這些因素極大的限制多重PCR的應用。
[0006]以基因芯片為代表的核酸介導的分子雜交技術近年廣泛的應用于病原體的檢測，Busti等(2002)設計6種特異性的連接酶檢測反應(ligase detection reaction, LDR)探針，其中每一對探針由鑒別寡核酸和通用探針組成，將通用探針進行熒光標記，從而達到檢測的目的。Szemes等(2005)將錨定探針(padlock probes, PLPs)技術和通用芯片技術結合用于檢測屬、種和亞種水平的植物病原生物鑒定，錨定探針的連接產物在通用熒光標記引物的作用下進行熒光標記，通過玻片雜交的達到鑒別不同病原體，該方法具有良好的特異性和靈敏性。Wang等(2011)設計11組LDR探針，其中上游LDR探針由上游鑒別探針和上游通用靶標組成，下游LDR探針由下游鑒別探針、Zip code序列以及下游通用靶標序列組成。通過設計這11組LDR探針與事先點制好的Zip通用芯片雜交，成功的檢測10種馬鈴薯病毒和18S rRNA陽性對照樣品。上述方法由于多重性好、靈敏度高、特異性強等優勢廣受研究者的青睞，但由于芯片雜交容易出現假陽性，檢測過程需要對不同的參數進行優化、檢測的樣品需要熒光標記、需要合成長的探針勢必增加檢測的成本。因此需要建立一種多重性好、特異性強、靈敏度相對高、操作簡單快捷、成本低的檢測方法。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題是提供一種基于長探針同時檢測多種靶標的方法，該方法屬于用于電泳檢測多種微量靶標的長探針LDR-PCR擴增方法，該方法能具有簡捷可靠、易于操作、靈敏度高、特異性強、多重性好以及價格便宜等優勢，使用該方法能對任何不同科、屬和種的病原體進行檢測和鑒定。`
[0008]為了解決上述技術問題，本發明提供一種基于長探針同時檢測多種靶標的方法(即多重LDR-PCR同時檢測多種微量混合靶標的方法)，包括以下步驟:
[0009]1)、獲取待檢測的靶標及其內參18S rRNA的核酸序列，利用相關軟件(例如NCBI)比對每種靶標的各個株系的核酸序列，獲得每種靶標的保守區；再在每種待檢測靶標及其內參ISSrRNA的保守區設計緊密相連的兩條寡核苷酸的鑒別探針(長度為20~25bp)，即上游鑒別探針和下游鑒別探針，所述上、下游鑒別探針是一對首尾相連并與各自的靶標序列互補的寡聚核苷酸，每種待檢測的靶標及其內參18S rRNA分別設計兩組上、下游鑒別探針 ；
[0010]即，獲取待檢測靶標的核酸序列，利用獲取每種靶標序列的全長序列，合成相應的上下游引物，通過RT-PCR獲取相應的全長靶標序列，并利用相應的軟件對每種靶標的多個株系的核酸序列進行相應的比對，從而獲取相應的保守區；再分別在每種靶標的保守區設計長度為20~25bp兩條緊密相連的寡核苷酸鑒別探針，即上游鑒別探針和下游鑒別探針，上、下游鑒別探針是一對首尾相連并與各自的靶序列互補的寡核苷酸；
[0011]2)、設計通用引物及選擇填充物長序列，所述通用引物由上、下游通用引物組成，所述填充物、通用引物以及待檢測的靶標序列均無同源性且不形成穩定空間結構的寡聚核苷酸；通用序列Tag2的3'與上游鑒別探針的5'相連組成上游LDR探針，填充物長序列與通用序列Tagl的5'端及下游鑒別探針的3'端相連組成下游LDR長探針；通用序列Tagl與下游通用引物互補，通用序列Tag2與上游通用引物相同；
[0012]備注說明:每種待檢測靶標的對應的填充物的長度不一樣,每種待檢測靶標對應的長度均唯一；
[0013]梯度長片段填充物和上下游通用引物均是根據大小和空間結構與靶序列均無同源性且不形成穩定的空間結構(如發夾結構和二聚體)。梯度長片段填充物是長度范圍在126~716bp的寡核苷酸，分別與Tagl的5'端、下游鑒別探針的3'端相連組成下游LDR長探針；Tag2的3,與上游鑒別探針的5,相連組成上游LDR探針；梯度長片段的填充物用于檢測通用引物擴增的連接產物。
[0014]3)、將上游LDR探針和下游LDR長探針與待檢測的靶標樣品一起進行連接酶檢測反應，得到連接產物；
[0015]4)利用上、下游通用引物擴增連接產物，通過瓊脂糖核酸電泳獲得條帶信息，從而獲知混合靶標的感染情況；
[0016]當出現與上述待檢測靶標長度相同的條帶時，被認定為感染了該待檢測靶標；
[0017]反之，當沒有出現任何條帶時，被認定為沒有感染待檢測靶標。
[0018]作為本發明的基于長探針同時檢測多種靶標的方法的改進:
[0019]所述待檢測的靶標為16kDaTKV、2b.、P0BWYV、HcProPVY、P25PVX、P0PLEV ；
[0020]所述步驟4)為:
[0021]16kDa?連接產物擴增長度為204bp ；2bCMV連接產物擴增長度為312bp ；P0BWYV連接產物擴增長度為398bp ；18S rRNA連接產物擴增長度為474bp ;HcProPVY連接產物擴增長度為578bp ；P25pvx連接產物擴增長度為647bp ；P0PLEV連接產物擴增長度為793bp。
[0022]作為本發明的基于長探針同時檢測多種靶標的方法的進一步改進:
[0023]所述上游通用引物為:5' >GGCATCGCATAACATAAGCA<3'，下游通用引物為:
[0024]>GTCCGTCCAACCGTCTG<3 ;;通用序列Tagl與下游通用引物互補，通用序列Tag2與上游通用引物相同。
[0025]作為本發明的基于長探針同時檢測多種靶標的方法的進一步改進:所述的填充物長序列為以下序列的一部分:[0026]5 , >ATGGGGAGGGGAAGGGTTCAGTTGAAGAGGATCGAAAACAAAATCAACAGGCAGGTCACTTTCTCAAAGAGAAGGTCTGGTTTGCTGAAGAAAGCCCATGAGATCTCTGTGCTTTGTGATGCTGAGGTGGCTCTGATTGTTTTCTCTACCAAAGGGAAGGTCTTTGAGTATTCTACTGATTCTTGTATGGAAAGGATTCTTGAAAGGTATGAGAGATATTCATATGCAGAGAGGCAACTTATTGCACATGATCTCGAACAAAATGGAAGCTGGACTCTGGAGCATGCGAAGCTCAAGGCTAGGATGGAGATTTTACAAAGAAATCAAAAGTATTTCATGGGAGAAGATCTCGACTCCTTGAGTCTTAAAGAGCTTCAAAATTTGGAGCAGCAGCTTGATTCTGCTCTCAAACACATCAGGTCGAGAAAGAACCAAGTTATGCACGAATCCATTTCGGATCTTCAGAAAAAGGATAAGGCATTGCAGGAGCAAAACAACGTGCTTGCCAAGCAGGTGAAGGAGAAAGAAAAGGAATTACTTGCCGAACAGGCACAATGGGATATTCAGCATAATCAAACACTTGACACATCCTCTATCCTTCCACAAACGTTGCTGCCCTTGGACACTATTGGGACTGCGTCCTACCAAGCAATTAGAAGCAGCGAAAGAGAAGATGAGGCAAGACCATCTCGACATCG AGCCAA TGCAGTACTCCTGCC CCCTTGGATGCTTAGCCATCTTGATTAATAG<3/ ；
[0027]其中16kDa?填充物為594~719堿基，共126個堿基；2bGMV填充物為487~719堿基，共233個堿基；P0BWYV填充物為401~719堿基，共319個堿基；18S rRNA填充物為323~719堿基，共397個堿基；HcProPVY填充物為221~719堿基，共499個堿基；P25pvx填充物為114~719堿基，共606個堿基；Ρ0ρ?填充物為4~719堿基，共716個堿基。
[0028]備注說明:單劃線的為上游引物的位置，雙劃線的為下游引物(所有的一樣)。
[0029]作為本發明的基于長探針同時檢測多種靶標的方法的進一步:產生梯度長度的連接產物，每種長度對應固定靶標，采用電泳的方法可以將其清晰的區分。
[0030]本發明的基于長探針同時檢測多種靶標的方法:通過不對稱PCR獲得梯度長度的下游長探針，且制作所有靶標下游長探針過程中使用的下游引物相同，節約了實驗合成成本。本發明的基于長探針同時檢測多種微量靶標的方法，克服現有多重LDR-PCR方法合成長探針以及使用基因芯片成本高的缺陷，具有成本低、檢測快速、可同時檢測多種靶標。本發明設計7對特異性探針，其中上游探針由生物公司直接合成，該部分由待檢測模板互補的序列的特異性上游探針與Tag2兩部分序列組成；下游長探針通過不對稱PCR割膠單鏈回收得到，該部分由待檢測的模板互補的特異性下游探針序列、長片段填充物以及Tagl三部分組成。通過連接酶檢測反應(ligase detection reaction, LDR) 7種連接產物的長度能明顯區分；本發明設計特異性探針具有高的退火溫度且連接產物具有相同的Tag，擴增的產物大小在203-793bp之間。依據本發明所建立的多重LDR-PCR反應體系，能實現一次LDR-PCR 反應同時檢測 7 種靶標，即 16kDaTKV、2bCMV、P0BWYV、18S rRNA、HcPropv\ P25pvx、P0PLEV的檢測效果。
[0031]綜上所述，本發明設計7組LDR探針，其中上游探針LDR由上游通用靶標和上游鑒別探針組成，下游LDR探針由下游鑒別探針、填充物長序列及下游通用靶標組成。本發明不需要通過熒光標記等手段進行芯片雜交，只需要通過簡單的電泳就能達到區分檢測多種微量靶標的目的，具有多重性好、特異性強、靈敏度相對高、操作簡單快捷、成本低的檢測優勢。不僅對新檢測方法的發展具有重要的理論意義，而且對于提升病原檢測水平，防止危險性病原傳入我國具有 重要的實踐意義和應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。[0033]圖1是本發明的同時檢測多種混合微量靶標的方法的原理示意圖。
【具體實施方式】
[0034]本發明的基于長探針同時檢測多種微量靶標的方法，具體實施方案包括以下步驟:
[0035]1)分別對感染馬鈴薯病毒的馬鈴薯樣品進行檢測，確定馬鈴薯病毒中基因沉默抑制的因子的種類。目前在馬鈴薯病毒中已發現有6種沉默抑制因子，分別為煙草脆裂病毒16kDa (16kDaTKV)基因、黃瓜花葉病毒2b (2bGMV)基因、甜菜西方黃化病毒P0 (P0BffYV)基因、馬鈴薯Y病毒HcPro (HcProPVY)基因、馬鈴薯X病毒P25 (P25pvx)基因、馬鈴薯卷葉病毒P0(P0PLEV)基因；
[0036]從NCBI網站下載待檢測的6種抑制因子和內參18S rRNA的核酸序列，并克隆6種沉默抑制因子全序列和內參18S rRNA的部分核酸序列。使用DNAStar軟件比對每種抑制因子和內參18S rRNA的各個株系的核酸序列比對，尋找保守區，利用Primer5.0在保守區設計緊密相連的兩條寡核苷酸鑒別探針(一對首尾相連并與各自的靶序列互補的20~25bp左右的寡核苷酸)；
[0037]2)設計填充物長序列和通用靶標:填充物長序列和通用靶標與待檢測的靶標之間沒有任何同源性的寡核苷酸。填充物長序列與Tagl的5'端、下游鑒別探針的3'端相連組成下游長探針；Tag2的3,與上游鑒別探針的5,相連組成上游探針；梯度長片段的填充物用于檢測通用引物擴增的連接產物，檢測的原理和過程如圖1所示；
[0038]3)將上、下游探針與待檢測樣品靶標一起進行連接酶檢測反應，只有當檢測到靶標序列與互補的兩條寡核苷酸接頭對應處堿基完全匹配，連接反應才能進行，下游的鑒別探針和填充物長序列才能被上、下`游通用引物擴增，經過電泳得到相應的長度梯度的PCR擴增產物；反之則不能形成連接產物，下游的鑒別探針和填充物長序列亦不能被擴增；
[0039]4)擴增結果的檢測采用本領域公知的方法，得到核酸電泳圖像文件，采用陰性對照和陽性對照，確定陽性對照的值為30ng，陰性對照小于10ng，經軟件和圖像分析擴增條帶的灰度值，進而得知感染的馬鈴薯樣品中抑制因子分布情況。
[0040]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0041]實施例1: 一種基于新型長探針同時檢測多種微量靶標的方法，分別對疑似感染的50份馬鈴薯病毒的葉樣品進行檢測，確定感染樣品中的沉默抑制因子的種類，公知常見有6種，分別為煙草脆裂病毒16kDa基因(16kDaTKV)、黃瓜花葉病毒2b基因Gb?)、甜菜西方黃化病毒P0基因(P0BWYV)、馬鈴薯Y病毒HcPro基因(HcProPVY)、馬鈴薯X病毒P25基因(P25pvx)、馬鈴薯卷葉病毒P0基因(Ρ0ρ?);本發明方法具體依次進行如下步驟:
[0042]1)從NCBI網站下載待檢測的6種抑制因子和內參18S rRNA的核酸序列，克隆相應的全長序列，全長引物見表1，并用DNAstar軟件對每一種抑制因子和內參的各個株系的核酸序列進行序列進行比對，尋找保守區；再利用Primer5.0軟件分別在每種抑制因子和內參的保守區內設計緊密相連的兩條寡核苷酸鑒別探針，每種設計兩組，具體如表2所示:
[0043]表1本發明中待檢測靶標及連接產物的全長引物
[0044]
【權利要求】
1.基于長探針同時檢測多種靶標的方法，其特征在于包括以下特征:1)、獲取待檢測的靶標及其內參18SrRNA的核酸序列，利用相關軟件比對每種靶標的各個株系的核酸序列，獲得每種靶標的保守區；再在每種待檢測靶標及其內參18S rRNA的保守區設計緊密相連的兩條寡核苷酸的鑒別探針，即上游鑒別探針和下游鑒別探針，所述上、下游鑒別探針是一對首尾相連并與各自的靶標序列互補的寡聚核苷酸，每種待檢測的靶標及其內參18S rRNA分別設計兩組上、下游鑒別探針；2)、設計通用引物及選擇填充物長序列，所述通用引物由上、下游通用引物組成，所述填充物、通用引物以及待檢測的靶標序列均無同源性且不形成穩定空間結構的寡聚核苷酸；通用序列Tag2的3'與上游鑒別探針的5'相連組成上游LDR探針，填充物長序列與通用序列Tagl的5'端及下游鑒別探針的3'端相連組成下游LDR長探針；通用序列Tagl與下游通用引物互補，通用序列Tag2與上游通用引物相同；3)、將上游LDR探針和下游LDR長探針與待檢測的靶標樣品一起進行連接酶檢測反應，得到連接產物；4)、利用上、下游通用引物擴增連接產物，通過瓊脂糖核酸電泳獲得條帶信息，從而獲知混合靶標的感染情況； 當出現與上述待檢測靶標長度相同的條帶時，被認定為感染了該待檢測靶標；反之，當沒有出現任何條帶時，被認定為沒有感染待檢測靶標。
2.根據權利要求1所述的基于長探針同時檢測多種靶標的方法，其特征在于:所述待檢測的靶標為 16kDa ?、2bGMV、P0BffYV、HCPrOPVY、P25pvx、P0PLKV;所述步驟4)為:16kDa TEV連接產物擴增長度為204bp ；2bCMV連接產物擴增長度為312bp ；P0BffYV連接產物擴增長度為398bp ；18S rRNA連接產物擴增長度為474bp ;HcPr0PVY連接產物擴增長度為578bp ；P25pvx連接產物擴增長度為647bp ;P0PLKV連接產物擴增長度為793bp。
3.根據權利要求2所述的基于長探針同時檢測多種靶標的方法，其特征在于:所述上游通用引物為:5' >GGCATCGCATAACATAAGCA<3'，下游通用引物為:5' >GTCCGTCCAACCGTCTG<3/ ;通用序列Tagl與下游通用引物互補，通用序列Tag2與上游通用引物相同。
4.根據權利要求3所述的基于長探針同時檢測多種靶標的方法，其特征在于:所述的填充物長序列為以下序列的一部分:5' >ATGGGGAGGGGAAGGGTTCAGTTGAAGAGGATCGAAAACAAAATCAACAGGCAGGTCACTTTCTCAAAGAGAAGGTCTGGTTTGCTGAAGAAAGCCCATGAGATCTCTGTGCTTTGTGATGCTGAGGTGGCTCTGATTGTTTTCTCTACCAAAGGGAAGGTCTTTGAGTATTCTACTGATTCTTGTATGGAAAGGATTCTTGAAAGGTATGAGAGATATTCATATGCAGAGAGGCAACTTATTGCACATGATCTCGAACAAAATGGAAGCTGGACTCTGGAGCATGCGAAGCTCAAGGCTAGGATGGAGATTTTACAAAGAAATCAAAAGTATTTCATGGGAGAAGATCTCGACTCCTTGAGTCTTAAAGAGCTTCAAAATTTGGAGCAGCAGCTTGATTCTGCTCTCAAACACATCAGGTCGAGAAAGAACCAAGTTATGCACGAATCCATTTCGGATCTTCAGAAAAAGGATAAGGCATTGCAGGAGCAAAACAACGTGCTTGCCAAGCAGGTGAAGGAGAAAGAAAAGGAATTACTTGCCGAACAGGCACAATGGGATATTCAGCATAATCAAACACTTGACACATCCTCTATCCTTCCACAAACGTTGCTGCCCTTGGACACTATTGGGACTGCGTCCTACCAAGCAATTAGAAGCAGCGAAAGAGAAGATGAGGCAAGACCATCTCGACATCG AGCCAA TGCAmACXCCTGCO CCCTTGGATGCTTAGCCATCTTGATTAATAG<3,?其中16kDa?v填充物為594~719堿基，共126個堿基；2bGMV填充物為487~719堿基，共233個堿基；P0BffYV填充物為401~719堿基，共319個堿基；18S rRNA填充物為323~719堿基，共397個堿基；HcProPVY填充物為221~719堿基，共499個堿基；P25pvx填充物為114~719堿基，共606個堿基；Ρ0ρ?填充物為4~719堿基，共716個堿基。
5.根據權利要求4所述的基于長探針同時檢測多種靶標的方法，其特征在于:產生梯度長度的連接產物，每種長度對應固定靶標，采用電泳的方法可以將其清晰的區分。
6.根據權利要求1~5所述的基于長探針同時檢測多種靶標的方法，其特征在于:步驟1)所述的鑒別探針具體如下:
【文檔編號】C12Q1/68GK103642939SQ201310643752
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月3日 優先權日:2013年12月3日
【發明者】汪平, 徐英武, 呂洪玉 申請人:浙江農林大學