一種草菇菌株0229分子特異性檢測標記及其檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種草菇菌株0229分子特異性檢測標記及其檢測方法，其特征在于：所述特異性檢測標記為特異性引物，其中引物序列為：F：CTTTCAGGAAGAGCCCAGC；R：TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA。檢測方法，包括：將草菇菌株接種PDA平板培養基，32℃培養5d，刮取表面菌絲裝入無菌離心管中，-70℃冰箱保存，然后用改進的CTAB法提取基因組DNA，得到DNA；將上述DNA為模板，特異性檢測標記引物為擴增引物，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，進行電泳檢測。本發明檢測時間短，準確性高的優點，利用所獲得的分子標記鑒別草菇菌株0229，有利于草菇育種工作的開展，加快草菇新品種的研發工作。
【專利說明】一種草菇菌株0229分子特異性檢測標記及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于草菇菌種檢測標記及其檢測領域，特別涉及一種草菇菌株0229分子特異性檢測標記及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]草燕(Volvariella volvacea)栽培起源于中國，迄今已有300多年的栽培歷史，在我國南方地區廣泛栽培。草菇味道鮮美，不僅具有豐富的營養價值，而且還具有重要的醫療保健作用，深受廣大消費者喜愛。草菇作為一種高溫栽培食用菌，同其它食用菌相比，其顯著的特點是生長速度極快，從播種到收獲一般只需要2周的時間，其年產量在我國食用菌產業中一直位居前十位。
[0003]我國草菇栽培面積廣，產量曾經在食用菌中排到第五位，但品種單一，檢測主要栽培草菇菌株交配型基因的類型，發現現有的菌株多源于上世紀七十年代野生草菇分離菌株V23菌株，通過對其進行系統選育獲得，遺傳背景比較狹窄，但農藝性狀有很大差別。面對這種情況，迫切需要加快草菇菌株鑒定技術的研究，開發更為有效的菌株鑒定方法。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種草菇菌株0229分子特異性檢測標記及其檢測方法，該發明檢測方法與常規形態學檢測、拮抗試驗和出菇試驗等方法相比，具有檢測時間短，準確性高的優點。可以利用所獲得的分子標記鑒別草菇菌株0229，有利于草菇育種工作的開展，從而加快草菇新品種的研發工作。
[0005]本發明的一種草菇菌株0229分子特異性檢測標記，其特征在于:所述特異性檢測標記為特異性引物，其中引物序列為:
[0006]F:CTTTCAGGAAGAGCCCAGC ；
[0007]R:TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA。
[0008]本發明的一種草菇菌株0229分子特異性檢測方法，包括:
[0009](I)將草菇菌株接種PDA平板培養基，32°C培養5d，刮取表面菌絲裝入無菌離心管中，_70°C保存，然后用改進的CTAB法提取基因組DNA，得到DNA ；
[0010](2)將上述DNA為模板，特異性檢測標記引物為擴增引物，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，進行電泳檢測，其中特異性檢測標記引物為F: CTTTCAGGAAGAGCCCAGC ； R:TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA。
[0011]所述步驟(1)中改進的CTAB法提取基因組DNA的具體方法步驟為:將冷凍干燥的菌絲研磨成粉末，加入65°C預熱2 X CTAB抽提液，分裝到2mL離心管中，65°C保溫45min，間或輕搖混勻；4°C, 12000rpm離心20min,取上清液加入等體積的氯仿:異戍醇(24: I)混合液，輕輕混勻，15min后4°C，12000rpm離心20min。取上清液移入新離心管中，加入2/3體積_20°C預冷的異丙醇,輕輕搖動,5min后4°C，8000rpm離心lOmin。棄上清液,沉淀用75%乙醇(含10mmol/L NaAc)洗漆3次,每次4°C , 8000rpm離心lOmin。最后用預冷的95%乙醇洗滌一次，輕輕上下顛倒，4°C，12000rpm離心20min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干，加入200 μ L雙蒸水溶解DNA沉淀。DNA溶液加入I μ L10mg/mL RNase, 37°C水浴lh，去除RNA。最終的DNA提取物于_20°C冰箱貯藏備用。
[0012]所述步驟(2)中PCR擴增體系為:總體積為25μ L，其中10XPCR buffer II (Mg2+Plus) 2.5 μ L，dNTP 各 2.5mM、2uL，5U/ μ L ExTaq DNA 酶(TaKaRa 公司)0.25 μ L，10 μ mol/L特異性引物對各 0.5 μ L，50ng/ μ L 模板 DNA0.5 μ L, ddH20 18.75 μ L。
[0013]所述步驟(2)中PCR反應條件為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環;72°C補平IOmin0
[0014]所述步驟(2)中電泳檢測方法為:取PCR擴增產物20 μ L，與12 μ L加樣緩沖液混勻，于95°C變性5分鐘，結束后置于冰水混合物中冷卻3分鐘，點樣3 μ L與6%變性聚丙烯酰胺上電泳，電泳緩沖液為I ΧΤΒΕ，電壓1000V，電流200mA，功率200W，電泳45分鐘，銀染，顯色，然后在凝膠成像儀上拍照。
[0015]所述草菇菌株0229能在分子量200bp_300bp之間擴增出2條特異條帶。
[0016]原理:
[0017]根據草菇基因組信息設計SSR引物，對現有主要栽培草菇菌株DNA進行擴增。篩選獲得針對草菇菌株0229特異條帶的引物，建立以特定SSR弓丨物為分子標記的快速鑒別草菇菌株0229分子生物學方法。采用特定引物對草菇菌株進行PCR擴增，草菇菌株0229能在分子量200bp-300bp之間擴增出2條特異條帶，其它草菇菌株不能同時擴增出2條條帶。
[0018]有益.效果
[0019]本發明的檢測方法與常規形態學檢測、拮抗試驗和出菇試驗等方法相比，具有檢測時間短，準確性高的優點；可以利用所獲得的分子標記鑒別草菇菌株0229，有利于草菇育種工作的開展，從而加快草菇新品種的研發工作。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為草菇菌株特異條帶擴增圖，其中M:Marker (50bp DNA ladder) ；1:草菇菌株0229 ；2:草菇菌株泰國I號；3:草菇菌株泗聯草菇；4.草菇菌株巨大草菇；5:草菇菌株V23 ；6:草菇菌株屏優。
【具體實施方式】
[0021]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0022]實施例1
[0023]DNA 提取:
[0024]將草菇菌株接種PDA平板培養基，32°C培養5d，刮取表面菌絲裝入無菌離心管中，-70°C冰箱保存，然后用改進的CTAB法提取基因組DNA(方法簡述如下:將冷凍干燥的菌絲研磨成粉末，加入65°C預熱2 X CTAB抽提液，分裝到2mL離心管中，65°C保溫45min，間或輕搖混勻；4°C, 12000rpm離心20min,取上清液加入等體積的氯仿:異戍醇(24: I)混合液，輕輕混勻，15min后4°C，12000rpm離心20min。取上清液移入新離心管中，加入2/3體積_2(TC預冷的異丙醇,輕輕搖動,5min后4?，8000rpm離心lOmin。棄上清液,沉淀用75%乙醇(含10mmol/L NaAc)洗漆3次，每次4°C , 8000rpm離心lOmin。最后用預冷的95%乙醇洗滌一次，輕輕上下顛倒，4°C，12000rpm離心20min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干，加入200 μ L雙蒸水溶解DNA沉淀。DNA溶液加入IyL 10mg/mL RNase，37°C水浴lh，去除RNA。最終的DNA提取物于_20°C冰箱貯藏備用。
[0025]PCR反應體系及條件:
[0026]將上述DNA為模板，特異性檢測標記引物為擴增引物，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0027]PCR 擴增體系為:總體性為 25μ L，其中 10XPCR buffer II (Mg2+ Plus) 2.5 μ L,dNTP 各 2.5mM、2uL，5U/y L ExTaq DNA 酶 0.25 μ L，10 μ mol/L 特異性引物對各0.5 μ L，模板 DNA 濃度 50ng/ μ L、0.5 μ L，ddH20 18.75 μ L0 特異性引物序列為:F:CTTTCAGGAAGAGCCCAGC ；R:TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA
[0028]PCR 反應條件為::95°C預變性 5min ;95°C變性 30s，54°C退火 30s，72°C延伸 30s，共35個循環；72°C補平IOmin。
[0029]電泳檢測:
[0030]取PCR擴增產物20 μ L，與12 μ L加樣緩沖液混勻，于95°C變性5分鐘，結束后置于冰水混合物中冷卻3分鐘，點樣3 μ L與6%變性聚丙烯酰胺上電泳，電泳緩沖液為I ΧΤΒΕ，電壓1000V，電流200mA，功率200W，電泳45分鐘，銀染，顯色，然后在凝膠成像儀上拍照。
[0031]如圖1所示:采用特異性引物對包括草菇菌株0229在內的6株草菇菌株進行PCR擴增，只有草菇菌株0229能在分子量200bp-300bp之間擴增出2條特異條帶，其它草菇菌株不能同時擴增出這2條條帶。[0001]
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【權利要求】
1.一種草菇菌株0229分子特異性檢測標記，其特征在于:所述特異性檢測標記為特異性引物，其中引物序列為:
F:CTTTCAGGAAGAGCCCAGC ；
R: TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA?
2.一種草菇菌株0229分子特異性檢測方法，包括: (1)將草菇菌株接種PDA平板培養基，32°C培養5d，將表面菌絲裝入無菌管中，_70°C保存，然后用改進的CTAB法提取基因組DNA，得到DNA ； (2)將上述DNA為模板，特異性檢測標記引物為擴增引物，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，進行電泳檢測，其中特異性檢測標記引物為F: CTTTCAGGAAGAGCCCAGC ； R:TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA。
3.根據權利要求2所述的一種草菇菌株0229分子特異性檢測方法，其特征在于:所述步驟(2)中PCR擴增體系為:總體積為25yL，其中10XPCR buffer II (Mg2+ Plus) 2.5 μ L,2.5mMdNTP各 2uL，5U/y L ExTaq DNA 酶0.25 μ L, 10 μ mol/L特異性引物對各 0.5 μ L，50ng/μ L 模板 DNA0.5 μ L，ddH20 18.75 μ L。
4.根據權利要求2所述的一種草菇菌株0229分子特異性檢測方法，其特征在于:所述步驟(2)中PCR反應條件為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環；72°C補平IOmin。
5.根據權利要求2所述的一種草菇菌株0229分子特異性檢測方法，其特征在于:所述步驟(2)中電泳檢測方法為:取PCR擴增產物20 μ L，與12 μ L加樣緩沖液混勻，于95°C變性5分鐘，結束后置于冰水混合物中冷卻3分鐘，點樣3 μ L與6%變性聚丙烯酰胺上電泳，電泳緩沖液為1ΧΤΒΕ，電壓1000V，電流200mA，功率200W，電泳45分鐘，銀染，顯色，然后在凝膠成像儀上拍照。
【文檔編號】C12N15/11GK103834641SQ201310643580
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年12月3日 優先權日:2013年12月3日
【發明者】汪虹, 王瑩, 陳明杰, 鮑大鵬, 馮愛萍 申請人:上海市農業科學院