一種從人羊膜中制取干細胞的方法
【專利摘要】本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法，具體指一種羊膜中分離上皮細胞和間充質干細胞方法，涉及細胞分離【技術領域】。通過自制的無菌、高效、穩定的胎盤保護液對胎盤進行采集，利用消化法和爬片法的組合，將羊膜上皮細胞與羊膜間充質干細胞分離開來，分別得到高純度的羊膜上皮細胞和羊膜間充質干細胞。本發明解決了現有技術中存在人羊膜采集污染率高、采集后的細胞活性差，直接影響了后續的細胞分離及培養的問題。是對從人羊膜中分離干細胞的方法進行改良和創新，形成了一套標準化的分離方案，能夠更穩定，充分利用羊膜的干細胞資源，無污染，純度高，細胞數量更多，在保持細胞活性的同時，保證了干細胞的原始特性。
【專利說明】—種從人羊膜中制取干細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種細胞分離技術，尤其涉及一種羊膜中分離上皮細胞和間充質干細胞方法。
【背景技術】 [0002]羊膜是胚胎期發育的產物，羊膜細胞具有干細胞特性，且不表達人類白細胞抗原HLA-1及HLA-1I,無異體免疫排斥反應，因此適合用于細胞治療,羊膜中的干細胞主要有上皮細胞和間充質干細胞。
羊膜上皮細胞具有亞全能干細胞特性，其分化能力強，可向三個胚層分化，并且無致瘤性及倫理學問題，是組織工程和細胞治療的理想種子細胞。羊膜間充質干細胞有一定多向分化潛能，但相對羊膜上皮細胞其特點主要在于其具有免疫調節及促進造血恢復的功能。這兩種細胞各有特點且在羊膜中含量豐富，因此探索有效可行的從羊膜中分離這兩種細胞的方法，具有十分重要的意義。目前廣泛使用的酶解法利用胰蛋白酶及膠原酶將羊膜進行消化，并將消化產物接種培養，從而獲得羊膜中的干細胞。但是使用胰蛋白酶對細胞損傷過大、消化時間長，導致消化下來的細胞不易貼壁生長，細胞成活率低，而消化時間短又不能得到足夠的細胞。另外，分步多次消化會增加操作污染的幾率，并使得分離步驟繁瑣，且得到的細胞不純，成功率低。
【發明內容】
[0003]本發明公開了一種從人羊膜中制取干細胞的方法，用以解決現有技術中羊膜采集污染率高、采集后的細胞活性差，直接影響了后續的細胞分離及培養的問題。
[0004]本發明的上述目的是通過以下技術方案實現的:
一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，包括采集，分離，培養，凍存，檢測；其中，分離過程中，羊膜上皮細胞采用酶消化法，繼而羊膜間充質干細胞采用組織爬片法，兩者分步連續完成。
[0005]如上所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，所述采集包括:
將采集的胎盤，放入含有0.2克/升鏈霉素和0.12克/升青霉素的D-Hanks液胎盤保護液的無菌袋內，將無菌袋進行密封并放入采集盒，將采集盒放入恒溫采集箱，在24小時內將恒溫采集箱送至干細胞庫。
[0006]如上所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，所述恒溫采集箱具體溫度為2V~8°C ;所述采集胎盤至送入干細胞庫的時間為12小時內。
[0007]如上所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，所述羊膜上皮細胞的分離具體包括:
將胎盤平鋪在面積為400cm2圓盤內，用生理鹽水將血絲沖洗干凈；
用手術剪剪取整個正面的羊膜；
將羊膜放入面積為200cm2的圓盤中，使之鋪展開，用止血鉗除去羊膜上的血絲后，放入燒杯中，用生理鹽水沖洗5飛次，每次使用100毫升~150毫升生理鹽水；
之后通過酶消化法對羊膜進行處理，所述酶消化法具體包括:
將經生理鹽水沖洗后的羊膜放入第一血漿瓶中，向其中加入濃度為2.5克/升的胰蛋白酶30毫升；
37°C恒溫靜止消化，使整塊羊膜完全與胰蛋白酶充分接觸后，經37°C恒溫靜止消化8分鐘~12分鐘；
將羊膜取出，棄消化液，將羊膜置于第二血漿瓶中，加入濃度為2.5克/升的胰蛋白酶30毫升，使整塊羊膜完全與胰蛋白酶液充分接觸后，經37°C恒溫靜止消化10分鐘~20分鐘；
消化結束后，用藥勺在第二血漿瓶中將羊膜均勻攪拌0.5分鐘~I分鐘至消化液變為乳白色渾濁液體，再向其中加入2毫升胎牛血清終止消化；
用止血鉗夾起羊膜,用100毫升生理鹽水沖洗一遍后，收集消化液和沖洗液,并用100目細胞篩過濾；
將所得細胞懸液進行細胞計數，取50微升細胞懸液與50微升0.4%臺盼藍混勻后，用移液器打入血球計數板中，靜置I分鐘后，顯微鏡下觀察計數；
過濾后的液體分裝于50毫升離心管中，經300G~800G離心機工作5分鐘；
將離心所得細胞用含5 %胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培養液15毫升吹打混勻后接種于第一個培養瓶中進行培養，或使用DMSO直接凍存。
[0008]如上所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，計數過程中對細胞數進行判斷，如果細胞數大于2.0X IO7則直接凍存；否則進行培養，培養至細胞數達到大于
2.0X IO7的標準后進行凍存。
[0009]如上所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，所述凍存的具體包括:
取DMS01.35毫升于15毫升離心管中，再向其中加入3.15毫升的胎牛血清后制成混合液，于4°C環境下靜止30分鐘以上；
向離心后的細胞中加入全部的混合液(共4.5毫升)，再向其中加入9毫升的胎牛血清混勻后，平均加入9個凍存管中，每管1.5毫升；
將所述凍存管置于4°C中10分鐘后，放入液氮罐長期保存。
[0010]如上所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，在第一血漿瓶中最佳恒溫靜止消化的消化時間為10分鐘；在第二血漿瓶中最佳恒溫靜止消化的時間為15分鐘；消化結束后，最佳攪拌時間為I分鐘。
[0011]如上所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，對獲得的羊膜上皮細胞進行檢測，如果發現羊膜上皮細胞中混有羊膜間充質干細胞，則進行如下處理:
去除第一培養瓶中的培養液，用10毫升生理鹽水沖洗2遍；
在第一培養瓶中加入濃度為2.5克/升的胰蛋白酶2毫升，經37°C恒溫靜止消化0.5分鐘~1.5分鐘；
在顯微鏡下觀察羊膜間充質干細胞，當細胞全部消化下來后，加入0.5毫升胎牛血清終止消化；
向第一培養瓶中加入10毫升生理鹽水，混勻后收集培養瓶中的細胞懸液，
將收集到的液體經200G離心工作5分鐘；收集到的羊膜間充質干細胞經計數，接種于培養瓶中，若細胞數在6X IO6以下接種于T25的培養瓶中，細胞數在6 X IO6及以上接種于T75的培養瓶中，加入培養液繼續培養；
第一培養瓶中的羊膜上皮細胞加入含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培養液繼續培養；
如上所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，所述羊膜間充質干細胞的分離方法包括:
采用整塊組織爬片法，將消化剩余的羊膜放入第一燒杯中，用50毫升生理鹽水反復沖洗3次，沖洗后的羊膜置于第二燒杯中晾干；
培養:將整塊羊膜鋪展在T75培養瓶中，如果羊膜塊面積大于培養瓶底面積，可以將羊膜塊剪成2-3大塊，分別鋪展在另外培養瓶中，經37°C培養箱中恒溫放置3小時后，緩慢加入5毫升的DMEM/F12 (含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF)培養液將羊膜塊組織潤濕培養;
6天后，全量換液，待細胞爬出至細胞長滿培養瓶底面積的30%及以上后，進行傳代操作，傳代后細胞可進行凍存或用于實驗研究。
[0012]如上所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，
采用碎塊組織爬片法，將消化剩余的羊膜放入第一燒杯中，用50毫升生理鹽水反復沖洗3次，沖洗后的羊膜置于第二燒杯中用手術剪將其剪碎至I毫米3的小塊；
培養:用藥勺將剪好的羊膜塊均勻地鋪展在T75培養瓶中，羊膜塊中間的間隔在0.2cm左右，每個T75培養瓶接種200塊羊膜組織，經37°C培養箱中恒溫放置3小時后，緩慢加入10毫升的DMEM/F12，DMEM/F12含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF，培養液將所有羊膜組織潤濕培養。
[0013]6天后，全量換液，待細胞爬出至細胞長滿培養瓶底面積的30%及以上后，進行傳代操作，傳代后細胞可進行凍存或用于實驗研究。
[0014]如上所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，對羊膜上皮細胞和羊膜間充質干細胞的微生物進行檢測，具體包括:
需氧厭氧菌檢測:將打入細胞培養液的需氧厭氧菌培養瓶一對的條碼掃入血培養儀并且編好號碼，上入到血培養儀內觀察，檢測7天，7天后如果結果為陰性即出具細菌檢測合格報告，如果檢測結果為陽性，則出具陽性報告；
支原體檢測:配置兩種培養基，支原體肺炎培養基和半流體培養基，將配置好的培養基121.(TC滅菌15分鐘，然后進行分裝，每份樣品接種每種培養基兩管，共四管放入36.(TC培養7天，7天以后取每種培養基一管再轉種兩管，與前面的四管加起來共八管培養21天，每三天觀察一次結果；從接種后起28天內如果結果為陰性出具支原體檢測陰性報告，如果為陽性則出具支原體陽性檢測報告；
如上所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，對羊膜上皮細胞進行驗證，具體包括:
通過流式細胞儀進行以下檢測:
CD45檢測:準備兩支流式管，對兩支流式管進行編號，一支為質控管一支為樣品管，將CD45的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升，再將CD45試劑搖勻，向樣品管中加入20微升CD45試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果=2%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告；
HLA-DR檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將HLA-DR的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升，再將HLA-DR試劑搖勻，向樣品管中加入20微升HLA-DR試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果=2%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告；
SSEA-4檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將SSEA-4的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升,再將SSEA-4試劑搖勻，向樣品管中加入20微升SSEA-4試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，測陽性結果3 80%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告； CD29檢測:準備兩支流式管，對兩支流式管進行編號，一支為質控管一支為樣品管，將CD29的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升，再將CD29試劑搖勻，向樣品管中加入20微升CD29試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果3 80%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告；
熒光定量PCR，具體檢測Naneg、0ct4、Kcf4和S0X2基因的表達量，具體包括以下操作步驟:
步驟一:樣品RNA的抽提
從-70°C冰箱取出細胞樣品后，放于冰上，后轉移至操凈臺，在細胞樣品管中迅速加入I毫升Trizol試劑，將此樣品管標為I號管；待I號管中細胞融化后，用I毫升移液槍反復吹打直至看不見任何不溶物，吸取I毫升細胞樣品轉移至2號干凈無RNA酶的EP離心管中，對樣品進行對應編號；
兩相分離:將已混合均勻的樣品放在掌上離心機離心3s，使管蓋的Trizol試劑進入管內；每I毫升的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2毫升的氯仿，蓋緊管蓋；將已蓋緊的2號EP管手動劇烈震蕩15s，在15到30°C靜置5分鐘；4°C下12000r/m離心15分鐘；離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層；RNA全部被分配于水相中；水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60% ；
RNA沉淀:小心地從離心機中拿出已離心好的樣品，放在超凈臺上；將2號管傾斜45°角，將水相上層轉移到3號干凈無RNA酶的離心管中，切勿碰到管壁和吸到中間層；加入等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，蓋緊管蓋，寫好與之對應的編號；輕輕顛倒5次，使之混勻；混勻后在15到30°C靜置10分鐘后，于4°C下12000r/m離心10分鐘；此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊；
RNA清洗:移去3號管中的上清液，每I毫升TRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少I毫升的75%乙醇(75%乙醇用DEPC水配制)，清洗RNA沉淀；蓋緊管蓋，反復顛倒數次，使沉淀漂浮起來；室溫靜置5分鐘；然后將3號管4°C下7500r/m離心5分鐘；
RNA干燥:盡可能的小心吸去3號管中所有乙醇溶液，切勿吸走沉淀；開風機，風干5-10分鐘左右；然后使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘；
溶解RNA沉淀:加入適量的RNase-free H2O,靜置5分鐘；在58°C的的水浴鍋中水浴8分鐘；從水浴鍋中取出溶解好的RNA，在漩渦振蕩器上震蕩10秒；獲得的3號管的RNA溶液保存于-80°C待用；
步驟二:RNA質量檢測，采用紫外吸收法測定，具體包括:先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零，然后取少量RNA溶液用TE稀釋，稀釋的比例為1:100，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液的濃度和純度；
濃度測定:A260下讀值為I表示40 ug RNA/毫升；樣品RNA濃度(ug/毫升)計算公式為:A260 X稀釋倍數X 40 ug/毫升；具體計算如下:
RNA溶于40微克DEPC水中，取5微克，1:100稀釋至495微克的TE中，測得A260 =
0.21 ；
RNA 濃度=0.21 X 100 X 40 ug/ 毫升=840 ug/ 毫升或 0.84 ug/ 微升；
取5微升用來測量以后，剩余樣品RNA為35微升，剩余RNA總量為:
35 微升 X0.84 ug/ 微升=29.4 ug ；
純度檢測=RNA溶液的的比值即為RNA純度，質量合格的RNA溶液的A260/A280比值范圍應為1.8到2.1 ；
還包括:變性瓊脂糖凝膠電泳測定，具體包括:
制膠:取0.3g瓊脂糖溶于25.5毫升MOPS電泳緩沖液中，冷卻至60°C，加入2微升熒光染料及5.4毫升的37%甲醛溶液12.3 M0灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25微升溶液；膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的IX MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米；10X MOPS電泳緩沖液具體為:M0PS 0.4M pH 7.0,乙酸鈉0.1M, EDTA0.01M ；準備RNA樣品:取0.2^1.0 μδ RNA,加3倍體積的甲醛上樣染液，加熱至70° C孵育5分鐘使樣品變性；
電泳:上樣前凝膠須預電泳5分鐘，隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3cm ；
紫外透射光下觀察并拍照:28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍；還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA組成，低分子量的RNA具體包括tRNA和5S核糖體RNA ;在18S和28S核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成；RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶；RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散；用數碼照相機拍下電泳結果；
步驟三:樣品cDNA合成，具體包括:
反應體系:
將2微升逆轉錄buffer、0.2微升上游引物、0.2微升下游引物、0.1微升dNTP、0.5微升逆轉錄酶M毫升V、5微升DEPC水、2微升RNA模版等反應物于I號離心管內，輕彈管底將溶液充分混合， 6000r/m短暫離心30秒；在I號離心管中加入逆轉錄酶M毫升V之前先70°C干浴3分鐘，取出后立即插于冰上，然后加逆轉錄酶0.5微升，37°C水浴60分鐘；
取出I號管后立即95°C干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于_80°C待用；
步驟四:梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因β-actin實時定量PCR;β-actin陽性模板的標準梯度制備β-actin陽性模板的濃度為1011，反應前取β -actin陽性模板3微升按10倍稀釋，加水27微升并充分混勻，為101(1，依次稀釋至109、IO8UO7UO6UO5UO4,以備用；
反應體系如下: 標準品反應體系:10微升SYBRGreenl染料、0.5微升陽性模板上游引物F、0.5微升陽性模板下游引物R、0.5微升dNTP、I微升Taq酶、5微升陽性模板DNA、32.5微升ddH20混合于陽性標準對照管1，輕彈管底將溶液充分混合，6000r/m短暫離心30秒；
管家基因反應體系:10微升SYBR Green I染料、0.5微升內參照上游引物F、0.5微升內參照下游引物R、0.5微升dNTP、I微升Taq酶、5微升待測樣品cDNA、32.5微升ddH20混合于檢測樣本管2，輕彈管底將溶液充分混合，6000r/m短暫離心30秒；
制備好的陽性標準對照管I和檢測樣本管2同時上機，反應條件為:40個循環，具體為:93°C 2分鐘，93°C I分鐘，55°C 2分鐘；
步驟五:制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板
針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應；
反應體系:2.5微升IOX PCR緩沖液、1.5微升MgC12溶液、0.5微升上游引物F、0.5微升下游引物R、3微升dNTP混合液、I微升Taq聚合酶、I微升cDNA混合上述反應物于離心管1，輕彈管底將溶液充分混合，6000r/m短暫離心30秒；
反應條件:35個PCR循環，94°C I分鐘；55°C I分鐘；72°C I分鐘；72°C延伸5分鐘；PCR產物與DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶；
將PCR產物進行10倍梯度稀釋:將PCR產物進行10倍梯度稀釋:設定PCR產物濃度為I XlOltl,依次稀釋至109U08U07U06U05U04幾個濃度梯度；
步驟六:待測樣品的待測基因實時定量PCR 所有cDNA樣品分別配置實時定量PCR反應體系；
體系配置如下:
10微升SYBRGreenl染料、I微升上游引物、I微升下游引物、I微升dNTP、2微升Taq聚合酶、5微升待測樣品cDNA、30微升ddH20混合上述反應物于離心管1，輕彈管底將溶液充分混合，6000r/m短暫離心30秒；
將配制好的離心管I反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應,反應條件為:93 0C 2分鐘預變性，然后40個循環:93°C I分鐘，55 °C I分鐘，72 °C I分鐘，最后72 °C 7分鐘延伸；
PCR完成后，程序分析結果，查看擴增曲線和表達量變化。
[0015]如上所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，對羊膜間充質干細胞進行驗證，具體包括:流式細胞儀檢測:
CD73檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將CD73的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升，再將CD73試劑搖勻，向樣品管中加入20微升⑶73試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果3 95%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告； CD90檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將CD90的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升,再將CD90試劑搖勻，向樣品管中加入10微升⑶90試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果3 95%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告；
CD105檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將CD105的control試劑搖勻，向質控管中加入10微升,再將CD105試劑搖勻，向樣品管中加入5微克CD105試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果3 95%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告；
CD45檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將CD45的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升,再將CD45試劑搖勻，向樣品管中加入20微升⑶45試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果=2%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告；
HLA-DR檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將HLA-DR的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升，再將HLA-DR試劑搖勻，向樣品管中加入20微升HLA-DR試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果=2%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告。
[0016]綜上所述，由于采用了上述技術方案，本發明解決了現有技術中羊膜采集污染率高、采集后的細胞活性差，直接影響了后續的細胞分離及培養的問題，通過自制的無菌、高效、穩定的胎盤保護液對胎盤進行采集，之后利用消化法和爬片法的組合，將羊膜上皮細胞與羊膜間充質干細胞分離開來，分別得到高純度的羊膜上皮細胞和羊膜間充質干細胞，本發明從人羊膜中分離干細胞的方法進行了改良和創新，形成了一套標準化的分離方案，相比現有的技術，此法能夠更穩定地從羊膜中先后分離得到人羊膜上皮細胞和人羊膜間充質干細胞，充分利用了羊膜的干細胞資源，且無污染，細胞數量更多，純度高，在保持細胞活性的同時，保證了干細胞的原始特性。【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的羊膜上皮細胞驗證的第一流式圖 ；
圖2是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的羊膜上皮細胞驗證的第二流式圖；圖3是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的羊膜上皮細胞驗證的第三流式圖；圖4是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的羊膜上皮細胞驗證的第四流式圖；圖5是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的羊膜上皮細胞表達的胚胎干細胞特異性基因Naneg的第一示意圖；
圖6是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的羊膜上皮細胞表達的胚胎干細胞特異性基因Naneg的第二不意圖；
圖7是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的羊膜上皮細胞表達的胚胎干細胞特異性基因0ct4的第一示意圖；
圖8是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的羊膜上皮細胞表達的胚胎干細胞特異性基因0ct4的第二示意圖；
圖9是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的羊膜上皮細胞表達的胚胎干細胞特異性基因Kcf4的第一示意圖；
圖10是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的羊膜上皮細胞表達的胚胎干細胞特異性基因Kcf4的第二示意圖；
圖11是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的羊膜上皮細胞表達的胚胎干細胞特異性基因S0X2的第一示意圖；
圖12是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的羊膜上皮細胞表達的胚胎干細胞特異性基因S0X2的第二示意圖；
圖13是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的流式細胞儀檢測間充質干細胞特異性表面抗原的陰性對照流式圖；
圖14是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的流式細胞儀檢測間充質干細胞特異性表面抗原CD73流式圖；
圖15是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的流式細胞儀檢測間充質干細胞特異性表面抗原CD90流式圖；
圖16是本發明一種從人羊膜中制取干細胞的方法的流式細胞儀檢測間充質干細胞特異性表面抗原⑶105流式圖。
【具體實施方式】
[0018]下面結合附圖和實施例對本發明做進一步描述:
一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其中，包括采集，分離，培養，凍存，檢測；其中，分離過程中，羊膜上皮細胞采用酶消化法，繼而羊膜間充質干細胞采用組織爬片法，兩者分步連續完成。
[0019]本發明的采集具體包括:將采集的胎盤，放入含有0.2克/升鏈霉素和0.12克/升青霉素的D-Hanks液胎盤保護液的無菌袋內，將無菌袋進行密封并放入采集盒，將采集盒放入恒溫采集箱，在24小時內用恒溫采集箱送至干細胞。
[0020]本發明中的胎盤采集一般是在醫院中進行的，從醫院中采集胎盤樣本，將胎盤的樣本放入含有保護液的無菌袋內，之后放入采集盒，并對采集盒進行登記；將采集盒運輸至干細胞庫，并進行登記。
[0021]進一步的說明:恒溫采集箱具體溫度為2°C~8°C，其溫度控制在2°C~8°C保存效果最佳；采集胎盤至送入干細胞庫的時間為12小時內，將胎盤從采集至入庫的時間控制在12小時內效果最佳。
[0022]本發明的羊膜上皮細胞的分離具體包括:
將胎盤平鋪在面積為400cm2圓盤內，用生理鹽水將胎盤上的血絲沖洗干凈；
用手術剪剪取整個正面的羊膜；
將羊膜放入面積為200cm2的圓盤中，或者也可以將羊膜放入腎形盤中，使之鋪展開，也就是說將羊膜鋪展開，用止血鉗除去羊膜上的血絲后，放入燒杯中，用生理鹽水沖洗5飛次，每次使用100毫升~150毫升生理鹽水，上述步驟中去除了血絲，保證了后續酶消化的有效性；
完成羊膜的沖洗之后通過酶消化法對羊膜進行處理，酶消化法具體包括:
預消化工藝:經生理鹽 水沖洗后的羊膜放入第一血漿瓶中，向其中加入濃度為2.5克/升的胰蛋白酶30毫升；
37°C恒溫靜止消化:使整塊羊膜完全與胰蛋白酶充分接觸后，經37°C恒溫靜止消化8分鐘~12分鐘，通過對預消化工藝的預消化時間和溫度的控制有效去除羊膜表面的雜質，對后續的進一步消化同樣具有有益的技術效果；
對羊膜進行再次的消化:將羊膜取出，棄消化液，將羊膜置于第二血漿瓶中，加入濃度為2.5克/升的胰蛋白酶30毫升，使整塊羊膜完全與胰蛋白酶液充分接觸后，經37°C恒溫靜止消化10分鐘~20分鐘，通過對消化時間和溫度的控制，使得在保證細胞分離效率的同時可以保持細胞的活性；
進一步的說明:本發明中在第一血漿瓶中恒溫靜止消化的最優消化時間為十分鐘；在第二血漿瓶中恒溫靜止消化的最優消化時間為15分鐘。
[0023]本發明中在消化結束后，用藥勺在第二血漿瓶中將羊膜均勻攪拌0.5分鐘分鐘至消化液變為乳白色渾濁液體，再向其中加入2毫升胎牛血清終止消化，其中，用藥勺進行攪拌的最佳時間是為I分鐘，對攪拌時間進行控制能縮短胰酶消化時間的同時提高細胞得率和細胞活性；
完成攪拌操作后，用止血鉗夾起羊膜，用100毫升生理鹽水沖洗一遍后，收集消化液和沖洗液，并用100目細胞篩過濾，細胞篩過濾可去除剩余組織塊及大顆粒雜質，保證細胞純凈均一；
將所得細胞懸液進行細胞計數，取50微升細胞懸液與50微升0.4%臺盼藍混勻后，用移液器打入血球計數板中，靜置I分鐘后，顯微鏡下觀察計數；
過濾后的液體分裝于50毫升離心管中，經300G100G下離心5分鐘；
將離心所得細胞用含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培養液15毫升吹打混勻后接種于第一個培養瓶中進行培養，或使用DMSO加胎牛血清直接凍存。
[0024]進一步說明:在計數過程中對細胞數進行判斷，如果細胞數大于2.0X IO7則直接凍存；否則進行培養，培養至細胞數達到大于2.0XlO7的標準后進行凍存。
[0025]本發明凍存具體包括:
取DMS01.35毫升于15毫升離心管中，再向其中加入3.15毫升的胎牛血清后制成混合液，于4°C環境下靜止30分鐘以上；
向離心后的細胞中加入全部的混合液(共4.5毫升)，再向其中加入9毫升的胎牛血清混勻后，平均加入9個凍存管中，每管1.5毫升；
將凍存管置于4°C中10分鐘后，放入液氮罐長期保存。
[0026]在本發明的一個實施例中，對獲得的羊膜上皮細胞進行檢測，如果發現羊膜上皮細胞中混有間充質干細胞，則進行如下處理:
去除第一培養瓶中的培養液，用10毫升生理鹽水沖洗2遍；
在第一培養瓶中加入濃度為2.5克/升的胰蛋白酶2毫升，經37°C恒溫靜止消化0.5分鐘~1.5分鐘；
最優的，在37°C恒溫靜止消化I分鐘。
[0027]在顯微鏡下觀察間充質干細胞，當細胞全部消化下來后，加入0.5毫升胎牛血清終止消化；
向第一培養瓶中加入10毫升生理鹽水，混勻后收集培養瓶中的細胞懸液，
將收集到的液體經200G離心工作5分鐘，
收集到的羊膜間充質干細胞經計數，接種于培養瓶中(若細胞數在6X IO6以下接種于T25的培養瓶中，細胞數在6X IO6及以上接種于T75的培養瓶中)，加入培養液繼續培養；第一個培養瓶中的羊膜上皮細胞加入含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培養液繼續培養；
本實施例利用了羊膜上皮細胞與羊膜間充質干細胞貼壁強度的差異，使用胰蛋白酶把容易消化的羊膜間充質干細胞消化下來，而將貼壁牢固的羊膜上皮細胞留在培養瓶中，從而純化了羊膜上皮細胞，又得到了少量間充質干細胞。
[0028]本發明中的羊膜間充質干細胞的分離方法包括:
采用整塊組織爬片法進行羊膜間充質干細胞的分離:采用整塊組織爬片法，將消化剩余的羊膜放入第一燒杯中，用50毫升生理鹽水反復沖洗3次，沖洗后的羊膜置于第二燒杯中晚干； 培養:將整塊羊膜鋪展在T75培養瓶中，如果羊膜塊面積大于培養瓶底面積，可以將羊膜塊剪成2-3大塊，分別鋪展在另外培養瓶中，經37°C培養箱中恒溫放置3小時后，緩慢加入5毫升的DMEM/F12 (含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF)培養液將羊膜塊組織潤濕培養;
6天后，全量換液，待細胞爬出至細胞長滿培養瓶底面積的30%及以上后，進行傳代操作，傳代后細胞可進行凍存或用于實驗研究。
[0029]本發明還可以采用碎塊組織爬片法，采用碎塊組織爬片法，將消化剩余的羊膜放入第一燒杯中，用50毫升生理鹽水反復沖洗3次，生理鹽水可以洗去殘留在羊膜上的胰酶，從而避免其對間充質干細胞的影響，沖洗后的羊膜置于第二燒杯中用手術剪將其剪碎至I毫米3的小塊，組織塊大小的控制可以保證后續細胞的爬出效率；
培養:用藥勺將剪好的羊膜塊均勻地鋪展在T75培養瓶中，羊膜塊中間的間隔在0.2cm左右，間隔距離的控制既保證了間充質干細胞的爬出的空間，又保證細胞密度與數量，每個T75培養瓶接種200塊羊膜組織，經37°C培養箱中恒溫放置3小時后，緩慢加入10毫升的DMEM/F12，DMEM/F12含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF，培養液將所有羊膜組織潤濕培養。
[0030]6天后，全量換液，待細胞爬出至細胞長滿培養瓶底面積的30%及以上后，進行傳代操作，傳代后細胞可進行凍存或用于實驗研究。
[0031]根據本發明的技術方案，一張完整羊膜可以得到超過IX 108個羊膜上皮細胞，經流式檢測羊膜上皮細胞細胞表面標識物SSEA-4百分率可高達90%以上，完全能夠滿足用于科研或細胞治療，從而解決了因羊膜上皮細胞不易培養擴增帶來的細胞數量不夠的問題。另外，爬片法得到的間充質干細胞，細胞數量多，活性強，可以經傳代擴增后用于臨床及科研，是組織工程種子細胞的理想來源。
該實驗方法在對羊膜進行分離處理時能夠很好控制胰蛋白酶對羊膜上皮細胞的作用，減少對細胞損傷的同時，最大限度的增加了分離所得細胞的數量。根據我們上百例羊膜的分離情況統計，此方法成功率在95%以上，使得羊膜上皮細胞和羊膜間充質干細胞的分離達到標準化要求且更易于產業化。
[0032]在本發明中可以對羊膜上皮細胞和羊膜間充質干細胞進行微生物檢測，具體包括:
一、羊膜上皮細胞和羊膜間充質干細胞的微生物檢測 需氧厭氧菌檢測:
將打入細胞培養液的需氧厭氧菌培養瓶一對的條碼掃入血培養儀并且編好號碼，然后上入到血培養儀內觀察，檢測7天，七天后如果結果為陰性即出具細菌檢測合格報告，如果檢測結果為陽性，則出具陽性報告。
[0033]支原體檢測:
配置兩種培養基，支原體肺炎培養基和半流體培養基，將配置好的培養基121.(TC滅菌15分鐘，然后進行分裝，每份樣品接種每種培養基兩管，共四管放入36.(TC培養七天，七天以后取每種培養基一管再轉種兩管，與前面的四管加起來共八管培養21天，每三天觀察一次結果。從接種后起28天內如果結果為陰性出具支原體檢測陰性報告，如果為陽性則出具支原體陽性檢測報告。
[0034]二、羊膜上皮細胞的驗證:
(一)、流式細胞儀
CD45檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將CD45的control試劑搖勻，向質控管中加入20ul，再將⑶45試劑搖勻，向樣品管中加入20ul⑶45試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600ul樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向質控管和樣品管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240ul的PBS后混勻上機，檢測陽性結果=2%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告。
[0035]HLA-DR檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將HLA-DR的control試劑搖勻，向質控管中加入20ul，再將HLA-DR試劑搖勻，向樣品管中加入20ulHLA-DR試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600ul樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后質控管和樣品管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240ul的PBS后混勻上機，檢測陽性結果=2%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告。
[0036] SSEA-4檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將SSEA-4的control試劑搖勻，向質控管中加入20ul，再將SSEA-4試劑搖勻，向樣品管中加入20ulSSEA-4試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600ul樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后質控管和樣品管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240ul的PBS后混勻上機，檢測陽性結果蘭80%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告。
[0037](二)、熒光定量PCR (檢測Naneg、0ct4、Kcf4和S0X2基因的表達量，引物由專業基因公司合成)以下為操作步驟:
1.樣品RNA的抽提
①從-70°C冰箱取出細胞樣品后，放于冰上，后轉移至操凈臺，在細胞樣品管中迅速加入I毫升Trizol試劑。將此樣品管標為I號管。待I號管中細胞融化后，用I毫升移液槍反復吹打直至看不見任何不溶物，吸取I毫升細胞樣品轉移至2號干凈無RNA酶的EP離心管中，寫好與樣品對應的編號。
[0038]②兩相分離將已混合均勻的樣品放在掌上離心機離心3s，使管蓋的Trizol試劑進入管內。每I毫升的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2毫升的氯仿，蓋緊管蓋。將已蓋緊的2號EP管手動劇烈震蕩15s，在15到30°C靜置5分鐘。4°C下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
[0039]③RNA沉淀小心地從離心機中拿出已離心好的樣品，放在超凈臺上。將2號管傾斜45°角，將水相上層轉移到3號干凈無RNA酶的離心管中，切勿碰到管壁和吸到中間層。加入等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，蓋緊管蓋，寫好與之對應的編號。輕輕顛倒5次，使之混勻。混勻后在15到30°C靜置10分鐘后，于4°C下12000rpm離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
[0040]④RNA清洗移去3號管中的上清液，每I毫升TRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少I毫升的75%乙醇(75%乙醇用DEPC水配制)，清洗RNA沉淀。蓋緊管蓋，反復顛倒數次，使沉淀漂浮起來。室溫靜置5分鐘。然后將3號管4°C下7500rpm離心5分鐘。
[0041]⑤RNA干燥盡可能的小心吸去3號管中所有乙醇溶液，切勿吸走沉淀。開風機，風干5-10分鐘左右。然后使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
[0042]⑥溶解RNA沉淀加入適量的RNase-free H20，靜置5分鐘。在58°C的的水浴鍋中水浴8分鐘。從水浴鍋中取出溶解好的RNA，在漩渦振蕩器上震蕩10秒。獲得的3號管的RNA溶液保存于_80°C待用。
[0043]2.RNA質量檢測 I)紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液的濃度和純度。
[0044]①濃度測定A260下讀值為I表示40 ug RNA/毫升。樣品RNA濃度(ug/毫升)計算公式為:A260X稀釋倍數X 40 ug/毫升。具體計算如下:
RNA 溶于 40ul DEPC 水中，取 5ul，l:100 稀釋至 495ul 的 TE 中，測得 A260 = 0.21
RNA 濃度=0.21 X 100 X 40 ug/ 毫升=840 ug/ 毫升或 0.84 ug/ 微升 取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 ul，剩余RNA總量為:
35 ul X 0.84 ug/ul = 29.4 ug
②純度檢測
RNA溶液的的比值即為RNA純度，質量合格的RNA溶液的A260/A280比值范圍應為1.8到 2.1。
[0045]2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠
取0.3g瓊脂糖溶于25.5毫升MOPS電泳緩沖液中，冷卻至60°C，加入2ul熒光染料及
5.4毫升的37%甲醛溶液(12.3 M)。灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25微升溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的IX MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。{注:10X MOPS 電泳緩沖液(MOPS 0.4M pH 7.0,乙酸鈉 0.1M, EDTA0.01M) }
②準備RNA樣品
取0.2^1.0 μg RNA,加3倍體積的甲醛上樣染液，加熱至70° C孵育5分鐘使樣品變性。
[0046]③電泳
上樣前凝膠須預電泳5分鐘，隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3cm。
[0047]④紫外透射光下觀察并拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型)，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA CtRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶。RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。
[0048]3.樣品cDNA合成 ①反應體系
碰物劑量-1 j^^bnffer 2WY
~2~上游引物 O】徵升
_3_卞游引物_ O】冊
4dNTP__Oll 微升
5籌M毫升0_5微升-
6水5徵升.7|Rm獅_2微升
T~ I總體積110微升.混合上述反應物于I號離心管內，輕彈管底將溶液充分混合，6000rpm短暫離心30秒。[0049]②在I號離心管中加入逆轉錄酶M毫升V之前先70°C干浴3分鐘，取出后立即插于冰上，然后加逆轉錄酶0.5微升，37 °C水浴60分鐘。
[0050]③取出I號管后立即95°C干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于_80°C待用。
[0051]4.梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因(β-actin)實時定量PCR
①β -actin陽性模板的標準梯度制備β -actin陽性模板的濃度為1011，反應前取β -actin陽性模板3微升按10倍稀釋(加水27微升并充分混勻)為101(1，依次稀釋至109、IO8UO7UO6UO5UO4,以備用。
[0052]②反應體系如下:
標準品反應體系
【權利要求】
1.一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，包括采集，分離，培養，凍存，檢測；其中，分離過程中，羊膜上皮細胞采用酶消化法，繼而羊膜間充質干細胞采用組織爬片法，兩者分步連續完成。
2.根據權利要求1所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，所述采集包括: 將采集的胎盤，放入含有0.2克/升鏈霉素和0.12克/升青霉素的D-Hanks液胎盤保護液的無菌袋內，將無菌袋進行密封并放入采集盒，將采集盒放入恒溫采集箱，在24小時內將恒溫采集箱送至干細胞庫，所述恒溫采集箱具體溫度為2V~8V ;所述采集胎盤至送入干細胞庫的最佳時間為12小時內。
3.根據權利要求1所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，所述羊膜上皮細胞的分離具體包括: 將胎盤平鋪在面積為400cm2圓盤內，用生理鹽水將血絲沖洗干凈； 用手術剪剪取整個正面的羊膜； 將羊膜放入面積為200cm2的圓盤中，使之鋪展開，用止血鉗除去羊膜上的血絲后，放入燒杯中，用生理鹽水沖洗5飛次，每次使用100毫升~150毫升生理鹽水； 之后通過酶消化法對羊膜進行處理，所述酶消化法具體包括: 將經生理鹽水沖洗后的羊膜放入第一血漿瓶中，向其中加入濃度為2.5克/升的胰蛋白酶30毫升； 37°C恒溫靜止消化，使整塊羊膜完全與胰蛋白酶充分接觸后，經37°C恒溫靜止消化8分鐘~12分鐘； 將羊膜取出，棄消化液，將羊膜置于第二血漿瓶中，加入濃度為2.5克/升的胰蛋白酶30毫升，使整塊羊膜完全與胰蛋白酶液充分接觸后，經37°C恒溫靜止消化10分鐘~20分鐘； 消化結束后，用藥勺在第二血漿瓶中將羊膜均勻攪拌0.5分鐘~I分鐘至消化液變為乳白色渾濁液體，再向其中加入2毫升胎牛血清終止消化； 用止血鉗夾起羊膜,用100毫升生理鹽水沖洗一遍后，收集消化液和沖洗液,并用100目細胞篩過濾； 將所得細胞懸液進行細胞計數，取50微升細胞懸液與50微升0.4%臺盼藍混勻后，用移液器打入血球計數板中，靜置I分鐘后，顯微鏡下觀察計數； 過濾后的液體分裝于50毫升離心管中，經300G~800G離心機工作5分鐘； 將離心所得細胞用含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培養液15毫升吹打混勻后接種于第一個培養瓶中進行培養，或使用DMSO加胎牛血清直接凍存。
4.根據權利要求3所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，計數過程中對細胞數進行判斷，如果細胞數大于2.0 X IO7則直接凍存；否則進行培養，培養至細胞數達到大于2.0X IO7的標準后進行凍存； 所述凍存具體包括: 取DMS01.35毫升于10毫升離心管中，再向其中加入3.15毫升的胎牛血清后制成混合液，于4°C環境下靜止30分鐘以上； 向離心后的細胞中加入全部的混合液4.5毫升，再向其中加入9毫升的胎牛血清混勻后，平均加入9個凍存管中，每管1.5毫升； 將所述凍存管置于4°C中10分鐘后，放入液氮罐長期保存。
5.根據權利要求3所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，在第一血漿瓶中最佳恒溫靜止消化的消化時間為10分鐘；在第二血漿瓶中最佳恒溫靜止消化的時間為15分鐘；消化結束后，攪拌時間為I分鐘。
6.根據權利要求3所述的一種從人羊膜中制取羊膜上皮細胞的方法，其特征在于，對獲得的羊膜上皮細胞進行檢測，如果發現羊膜上皮細胞中混有羊膜間充質干細胞，則進行如下處理: 去除第一培養瓶中的培養液，用10毫升生理鹽水沖洗2遍； 在第一培養瓶中加入濃度為2.5克/升的胰蛋白酶2毫升，經37°C恒溫靜止消化0.5分鐘~1.5分鐘； 在顯微鏡下觀察羊膜間充質干細胞，當細胞全部消化下來后，加入0.5毫升胎牛血清終止消化； 向第一培養瓶中加入10毫升生理鹽水，混勻后收集培養瓶中的細胞懸液， 將收集到的液體經200G離心工作5分鐘；收集到的羊膜間充質干細胞經計數，接種于培養瓶中，若細胞數在6 X IO6以下接種于T25的培養瓶中，細胞數在6 X IO6及以上接種于T75的培養瓶中，加入培養液繼續培養； 第一培養瓶中的羊膜上皮細胞加入含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培養液繼續培養。
7.根據權利要求1所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，所述羊膜間充質干細胞的分離方法包括: 采用整塊組織爬片法，將消化剩余的羊膜放入第一燒杯中，用50毫升生理鹽水反復沖洗3次，沖洗后的羊膜置于第二燒杯中晾干； 培養:將整塊羊膜鋪展在T75培養瓶中，如果羊膜塊面積大于培養瓶底面積，可以將羊膜塊剪成2-3大塊，分別鋪展在另外培養瓶中，經37°C培養箱中恒溫放置3小時后，緩慢加入5毫升的DMEM/F12含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF培養液將羊膜塊組織潤濕培養; 6天后，全量換液，待細胞爬出至細胞長滿培養瓶底面積的30%及以上后，進行傳代操作，傳代后細胞可進行凍存或用于實驗研究。
8.根據權利要求1所述的一種從人羊膜中制取羊膜間充質干細胞的方法，其特征在于， 采用碎塊組織爬片法，將消化剩余的羊膜放入第一燒杯中，用50毫升生理鹽水反復沖洗3次，沖洗后的羊膜置于第二燒杯中用手術剪將其剪碎至I毫米3的小塊； 培養:用藥勺將剪好的羊膜塊均勻地鋪展在T75培養瓶中，羊膜塊中間的間隔在0.2cm左右，每個T75培養瓶接種200塊羊膜組織，經37°C培養箱中恒溫放置3小時后，緩慢加入10毫升的DMEM/F12，DMEM/F12含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF培養液將所有羊膜組織潤濕培養； 6天后，全量換液，待細胞爬出至細胞長滿培養瓶底面積的30%及以上后，進行傳代操作，傳代后細胞可進行凍存或用于實驗研究。
9.根據權利要求1、3、7、8任一所述的一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，對羊膜上皮細胞和羊膜間充質干細胞的微生物進行檢測，具體包括: 需氧厭氧菌檢測:將打入細胞培養液的需氧厭氧菌培養瓶一對的條碼掃入血培養儀并且編好號碼，然后上入到血培養儀內觀察，檢測7天，7天后如果結果為陰性即出具細菌檢測合格報告，如果檢測結果為陽性，則出具陽性報告； 支原體檢測:配置兩種培養基，支原體肺炎培養基和半流體培養基，將配置好的培養基121.(TC滅菌15分鐘，然后進行分裝，每份樣品接種每種培養基兩管，共四管放入36.(TC培養7天，7天以后取每種培養基一管再轉種兩管，與前面的四管加起來共八管培養21天，每三天觀察一次結果；從接種后起28天內如果結果為陰性出具支原體檢測陰性報告，如果為陽性則出具支原體陽性檢測報告。
10.根據權利要求1、3、7任一所述的一種從人羊膜中制取羊膜上皮細胞的方法，其特征在于，對羊膜上皮細胞進行驗證，具體包括: 通過流式細胞儀進行以下檢測: CD45檢測:準備兩支流式管，對兩支流式管進行編號，一支為質控管一支為樣品管，將CD45的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升，再將CD45試劑搖勻，向樣品管中加入20微升CD45試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果=2%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告； HLA-DR檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將HLA-DR的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升，再將HLA-DR試劑搖勻，向樣品管中加入20微升HLA-DR試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果=2%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告； SSEA-4檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將SSEA-4的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升,再將SSEA-4試劑搖勻，向樣品管中加入20微升SSEA-4試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果3 80%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告； CD29檢測:準備兩支流式管，對兩支流式管進行編號，一支為質控管一支為樣品管，將CD29的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升，再將CD29試劑搖勻，向樣品管中加入20微升CD29試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果3 80%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告； 熒光定量PCR，具體檢測Naneg、0ct4、Kcf4和S0X2基因的表達量，具體包括以下操作步驟:步驟一:樣品RNA的抽提 從-70°C冰箱取出細胞樣品后，放于冰上，后轉移至操凈臺，在細胞樣品管中迅速加入I毫升Trizol試劑，將此樣品管標為I號管；待I號管中細胞融化后，用I毫升移液槍反復吹打直至看不見任何不溶物，吸取I毫升細胞樣品轉移至2號干凈無RNA酶的EP離心管中，對樣品進行對應編號； 兩相分離:將已混合均勻的樣品放在掌上離心機離心3秒，使管蓋的Trizol試劑進入管內；每I毫升的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2毫升的氯仿，蓋緊管蓋；將已蓋緊的2號EP管手動劇烈震蕩15秒，在15到30°C靜置5分鐘；4°C下12000轉/分鐘離心15分鐘；離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層；RNA全部被分配于水相中；水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60% ； RNA沉淀:小心地從離心機中拿出已離心好的樣品，放在超凈臺上；將2號管傾斜45°角，將水相上層轉移到3號干凈無RNA酶的離心管中，切勿碰到管壁和吸到中間層；加入等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，蓋緊管蓋，寫好與之對應的編號；輕輕顛倒5次，使之混勻；混勻后在15到30°C靜置10分鐘后，于4°C下12000轉/分鐘離心10分鐘；此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊； RNA清洗:移去3號管中的上清液，每I毫升TRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少I毫升的75%乙醇(75%乙醇用DEPC水配制)，清洗RNA沉淀；蓋緊管蓋，反復顛倒數次，使沉淀漂浮起來；室溫靜置5分鐘；然后將3號管4°C下7500轉/分鐘離心5分鐘； RNA干燥:盡可能的小心吸去3號管中所有乙醇溶液，切勿吸走沉淀；開風機，風干5-10分鐘左右；然后使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘； 溶解RNA沉淀:加入適量的RNase-free H2O,靜置5分鐘；在58°C的的水浴鍋中水浴8分鐘；從水浴鍋中取出溶解好的RNA，在漩渦振蕩器上震蕩10秒；獲得的3號管的RNA溶液保存于-80°C待用； 步驟二:RNA質量檢測，采用紫外吸收法測定，具體包括:先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零，然后取少量RNA溶液用TE稀釋，稀釋的比例為1:100，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液的濃度和純度； 濃度測定:A260下讀值為I表示40 ug RNA/毫升；樣品RNA濃度(ug/毫升)計算公式為:A260 X稀釋倍數X 40 ug/毫升；具體計算如下: RNA溶于40微升DEPC水中，取5微升，1:100稀釋至495微升的TE中，測得A260 =.0.21 ； RNA 濃度=0.21 X 100 X 40 ug/ 毫升=840 ug/ 毫升或 0.84 ug/ 微升； 取5微升用來測量以后，剩余樣品RNA為35微升，剩余RNA總量為:
35微升 X0.84 ug/ 微升=29.4 ug ； 純度檢測=RNA溶液的的比值即為RNA純度，質量合格的RNA溶液的A260/A280比值范圍應為1.8到2.1 ； 還包括:變性瓊脂糖凝膠電泳測定，具體包括: 制膠:取0.3g瓊脂糖溶于25.5毫升MOPS電泳緩沖液中，冷卻至60°C，加入2微升熒光染料及5.4毫升的37%甲醛溶液12.3 M0灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25微升溶液；膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的IX MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米；10X MOPS電泳緩沖液具體為:M0PS 0.4M pH 7.0,乙酸鈉0.1M, EDTA0.01M ；準備RNA樣品:取0.2^1.0 μδ RNA,加3倍體積的甲醛上樣染液，加熱至70° C孵育5分鐘使樣品變性； 電泳:上樣前凝膠須預電泳5分鐘，隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3cm ； 紫外透射光下觀察并拍照:28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍；還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA組成，低分子量的RNA具體包括tRNA和5S核糖體RNA ;在18S和28S核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成；RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶；RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散；用數碼照相機拍下電泳結果； 步驟三:樣品cDNA合成，具體包括: 反應體系: 將2微升逆轉錄buffer、0.2微升上游引物、0.2微升下游引物、0.1微升dNTP、0.5微升逆轉錄酶M毫升V、5微升DEPC水、2微升RNA模版等反應物于I號離心管內，輕彈管底將溶液充分混合，6000轉/分鐘短暫離心30秒； 在I號離心管中加入逆轉錄酶M毫升V之前先70°C干浴3分鐘，取出后立即插于冰上，然后加逆轉錄酶0.5微升，37°C水浴60分鐘； 取出I號管后立即95°C干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于_80°C待用； 步驟四:梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因β-actin實時定量PCR;β-actin陽性模板的標準梯度制備β-actin陽性模板的濃度為1011，反應前取β -actin陽性模板3微升按10倍稀釋，加水27微升并充分混勻，為101(1，依次稀釋至109、IO8UO7UO6UO5UO4,以備用； 反應體系如下: 標準品反應體系:10微升SYBRGreenl染料、0.5微升陽性模板上游引物F、0.5微升陽性模板下游引物R、0.5微升dNTP、I微升Taq酶、5微升陽性模板DNA、32.5微升ddH20混合于陽性標準對照管I，輕彈管底將溶液充分混合，6000轉/分鐘短暫離心30秒； 管家基因反應體系:10微升SYBR Green I染料、0.5微升內參照上游引物F、0.5微升內參照下游引物R、0.5微升dNTP、I微升Taq酶、5微升待測樣品cDNA、32.5微升ddH20混合于檢測樣本管2，輕彈管底將溶液充分混合，6000轉/分鐘短暫離心30秒； 制備好的陽性標準對照管I和檢測樣本管2同時上機，反應條件為:40個循環，具體為:93°C 2分鐘，93°C I分鐘，55°C 2分鐘； 步驟五:制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板 針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應； 反應體系:2.5微升IOX PCR緩沖液、1.5微升MgC12溶液、0.5微升上游引物F、0.5微升下游引物R、3微克dNTP混合液、I微升Taq聚合酶、I微升cDNA混合上述反應物于離心管1，輕彈管底將溶液充分混合，6000轉/分鐘短暫離心30秒； 反應條件:35個PCR循環，94°C I分鐘；55°C I分鐘；72°C I分鐘；72°C延伸5分鐘；PCR產物與DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶； 將PCR產物進行10倍梯度稀釋:將PCR產物進行10倍梯度稀釋:設定PCR產物濃度為I XlOltl,依次稀釋至109U08U07U06U05U04幾個濃度梯度； 步驟六:待測樣品的待測基因實時定量PCR 所有cDNA樣品分別配置實時定量PCR反應體系； 體系配置如下: 10微升SYBRGreenI染料、I微升上游引物、I微升下游引物、I微升dNTP、2微升Taq聚合酶、5微升待測樣品cDNA、30微升ddH20混合上述反應物于離心管1，輕彈管底將溶液充分混合，6000轉/分鐘短暫離心30秒； 將配制好的離心管I反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應,反應條件為:930C 2分鐘預變性，然后40個循環:93°C I分鐘，55°C I分鐘，72°C I分鐘，最后72°C 7分鐘延伸； PCR完成后，程序分析結果，查看擴增曲線和表達量變化； 對羊膜間充質干細胞進行驗證，具體包括: 流式細胞儀檢測: CD73檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將CD73的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升，再將CD73試劑搖勻，向樣品管中加入20微升⑶73試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果3 95%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告； CD90檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將CD90的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升,再將CD90試劑搖勻，向樣品管中加入10微升⑶90試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果3 95%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告； CD105檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將CD105的control試劑搖勻，向質控管中加入10微升,再將CD105試劑搖勻，向樣品管中加入5微升CD105試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果3 95%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告； CD45檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將CD45的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升,再將CD45試劑搖勻，向樣品管中加入20微升⑶45試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果=2%則為合格，出具細胞表面標記物檢測合格報告； HLA-DR檢測:準備兩支流式管，編號，其中一支為質控管一支為樣品管，將HLA-DR的control試劑搖勻，向質控管中加入20微升，再將HLA-DR試劑搖勻，向樣品管中加入20微升HLA-DR試劑，然后將樣品震蕩搖勻向兩支流式管中各加入600微升樣品，然后混勻，置于4°C左右避光孵育30分鐘，然后向樣品管和質控管中分別加入I毫升PBS，混勻后1500轉/分鐘離心5分鐘，后棄去上清，加入240微升的PBS后混勻上機，檢測陽性結果=2%則為合格，出具細胞 表面標記物檢測合格報告。
【文檔編號】C12N5/0775GK103642751SQ201310650384
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月6日 優先權日:2013年12月6日
【發明者】徐志國, 貢波, 薛飛, 虞焰志, 劉擁軍, 路建偉, 朱德琳, 章靖, 王學軍 申請人:上海同澤和濟生物科技有限公司