一種二次親和層析法提取激肽釋放酶原的方法
【專利摘要】本發明公開了一種二次親和層析提取激肽釋放酶原的方法，其特點在于優化原有親和層析提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的洗脫條件，從中提取激肽釋放酶原的收率為0.2％～0.4％。
【專利說明】一種二次親和層析法提取激肽釋放酶原的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體地說涉及一種應用二次親和層析提取激肽釋放酶原的方法。
【背景技術】
[0002]激肽釋放酶原是激肽釋放酶的前體，激肽釋放酶屬于絲氨酸蛋白酶，它包括血漿型激肽釋放酶和組織型激肽釋放酶兩種類型，均能使激肽原釋放出一種多肽——激肽，而激肽釋放酶-激肽系統(kallikrein kinin system, KKS)是體內主要的降壓系統之一,作為一個復雜的內源性多酶系統，參與調控心血管、腎臟、神經系統等的生理功能，與心臟病、腎病、炎癥反應、癌癥等疾病的發生有著密切關系。
[0003]近年來在心血管系統方面的研究進展很快，許多臨床研究和基礎實驗已證實糖尿病、高血壓、心力衰竭、心肌梗死及左心室肥厚等疾病的發生與KKS的活性降低有關。因而深入研究KKS的作用為研究心血管相關疾病的發病機制和治療手段提供了又一新的途徑。
[0004]本發明人自2008年開始對胰酶的生產工藝進行試驗研究，特別是在糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的生產過程中，不斷探索，力求優化完善工藝參數，并且在原有工藝的基礎上另辟蹊徑，成功完成提取激肽釋放酶原的工藝研究，其收率為0.2%~0.4%，生產工藝穩定，質量可控。
【發明內容】
[0005]本發明提供了種應用二次親和層析提取激肽釋放酶原的方法，特別是采用優化原有親和層析工藝，得到激肽釋放酶原。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案予以實現:
[0007]—種二次親和層析提取激肽釋放酶原的方法，其特征在于:在通過對原有工藝的優化，提取所得激肽釋放酶原收率為0.2 %~0.4 %。在發明技術方案中，其特征還在于所述提取工藝包括如下步驟:
[0008]I)原料預處理
[0009]胰臟洗凈后，立即浸入預先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。
[0010]2)蛋白浸潰提取
[0011]2.1)取預處理過的胰臟投入絞肉機中絞碎成胰漿(必要時應絞3次)，加入胰漿2倍量的冰冷硫酸，置冷室中，多次攪拌，浸潰提取。
[0012]2.2)浸潰物過濾后，濾渣再用I倍量的冰冷硫酸重復上述過程，再進行過濾，棄濾渣，合并2次濾液，加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達到40%飽和度，冷室放置，過夜。
[0013]2.3)虹吸上清液，底層沉淀加入適量硅藻土作助濾劑，減壓過濾，上清液和濾液合并，得提取液，加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達到70%飽和度，冷室放置過夜。
[0014]3)分級沉淀
[0015]3.1)次日上層清液棄去，底層沉淀減壓過濾至干，加入3倍于濾餅重的冰水使之溶解，重復用硫酸銨40%和70%飽和度分級沉淀；
[0016]3.2)將最后一次70%飽和度沉淀濾餅，加入1.5倍于濾餅重的冰水溶解，并加入
0.5倍濾餅重量的飽和硫酸銨溶液。
[0017]4) 一次親和層析
[0018]4.1)用適量的0.01-0.3mol/L,PH5-10的Tris-HCL緩沖液平衡親和層析快膠柱；
[0019]4.2)將混合液流經此柱，流速控制在l_5mL/min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液；
[0020]4.3)平衡后，用0.l-5mol/L的NaCL溶液洗脫完全，得含胰蛋白酶原的淋洗液。
[0021]5) 二次親和層析
[0022]5.1)用適量的0.01-0.3mol/L, PH3-8的醋酸鹽緩沖液來平衡親和層析快膠柱；
[0023]5.2)平衡后，用含 0.l-3mol/L NaCl 的 0.01-0.3mol/L,PH3-8 的醋酸鹽緩沖液洗脫完全，流速控制在l_5mL/min左右，得含激肽釋放酶原的洗脫峰。
[0024]6)結晶
[0025]6.1)將含激肽釋放酶原的洗脫峰于_20°C冰箱中靜置結晶22~24h ；
[0026]6.2)將結晶減壓抽濾，干燥后得激肽釋放酶原。
[0027]經核算，所得激肽釋放酶原收率約為0.2%~0.4%。
[0028]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:
[0029]選用二次親和層析提取激肽釋放酶原，在穩定收率的前提下，其理化性質和生物活性也保持穩定，從而有利于下一步對激肽釋放酶原進行精制，最終使激肽釋放酶的各項指標均符合中國藥典標準。更重要的是，通過工藝的不斷改進和完善，特別是采用二次親和層析優化原有工藝，激肽釋放酶原收率0.2%~0.4%，節約成本，提高了經濟效益。
【具體實施方式】
[0030]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，而不以任何方式限制。
[0031]實施例1
[0032]I)原料預處理
[0033]胰臟洗凈后，去掉脂肪、結締組織等雜物，立即浸入預先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。
[0034]2)蛋白浸潰提取
[0035]2.1)將預處理過的胰臟投入絞肉機中絞碎成胰漿，稱重后積滿IOOkg投入反應罐，加入200L冰冷硫酸。置冷室中，每I~2h攪拌I次，浸潰提取24h。
[0036]2.2)浸潰物用粗濾袋(或二層紗布)過濾，濾干后，得到濾渣86kg。再用86L冰冷硫酸重復上述過程，再進行過濾，棄濾渣，合并2次濾液共270L，加入固體硫酸銨65.34kg,使硫酸銨濃度達到40%飽和度，冷室放置，過夜。
[0037]2.3)虹吸上清液，底層沉淀加入適量硅藻土作助濾劑，減壓過濾，上清液和濾液合并，得提取液264L，加入固體硫酸銨54.12kg，使硫酸銨濃度達到70%飽和度，冷室放置過夜。
[0038]3)分級沉淀
[0039]3.1)次日上層清液棄去，底層沉淀減壓過濾至干稱重46.68kg，加入140L冰水使之溶解，重復用硫酸銨40%和70%飽和度分級沉淀；
[0040]3.2)取第二次70%飽和度沉淀濾餅9.6kg，加入14.4L冰水溶解，并加入4.8L飽和硫酸銨溶液。
[0041]4) 一次親和層析
[0042]4.1)用80L0.2mol/L, PH8的Tris-HCL緩沖液平衡親和層析快膠柱；
[0043]4.2)將混合液19.2L流經此柱，流速控制在2mL/min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液16.4L ；
[0044]4.3)平衡后，用36.8L1.5mol/L的NaCL溶液洗脫，得含胰蛋白酶原的淋洗液37.4L。
[0045]5) 二次親和層析
[0046]5.1)用40L的0.05mol/L, PH6的醋酸鹽緩沖液來平衡親和層析快膠柱；
[0047]5.2)平衡后，用含0.5mol/L NaCl的0.05mol/L, PH6的醋酸鹽緩沖液洗脫完全，流速控制在4mL/min左右，得含激肽釋放酶原的洗脫峰12.5L。
[0048]6)結晶
[0049]6.1)將含激肽釋放酶原的洗脫峰于_20°C冰箱中靜置結晶24h ；
[0050]6.2)將結晶減壓抽濾，干燥后得激肽釋放酶原0.32kg。
[0051]經核算，所得激肽釋放酶原收率約為0.32%。
[0052]實施例2
[0053]I)原料預處理
[0054]胰臟洗凈后，去掉脂肪、結締組織等雜物，立即浸入預先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。
[0055]2)蛋白浸潰提取
[0056]2.1)將預處理過的胰臟投入絞肉機中絞碎成胰漿，稱重后積滿IOOkg投入反應罐，加入200L冰冷硫酸。置冷室中，每I~2h攪拌I次，浸潰提取24h。
[0057]2.2)浸潰物用粗濾袋(或二層紗布)過濾，濾干后，得到濾渣88kg。再用88L冰冷硫酸重復上述過程，再進行過濾，棄濾渣，合并2次濾液共275L，加入固體硫酸銨66.55kg,使硫酸銨濃度達到40%飽和度，冷室放置，過夜。
[0058]2.3)虹吸上清液，底層沉淀加入適量硅藻土作助濾劑，減壓過濾，上清液和濾液合并，得提取液268L，加入固體硫酸銨54.94kg，使硫酸銨濃度達到70%飽和度，冷室放置過夜。
[0059]3)分級沉淀
[0060]3.1)次日上層清液棄去，底層沉淀減壓過濾至干稱重48.67kg，加入146L冰水使之溶解，重復用硫酸銨40%和70%飽和度分級沉淀；
[0061]3.2)取第二次70%飽和度沉淀濾餅9.8kg，加入14.7L冰水溶解，并加入4.9L飽和硫酸銨溶液。
[0062]4)親和層析
[0063]4.1)用82L0.15mol/L, PH7的Tris-HCL緩沖液平衡親和層析快膠柱；
[0064]4.2)將混合液19.6L流經此柱，流速控制在3mL/min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液16.8L ；[0065]4.3)平衡后，用38.5Llmol/L的NaCL溶液洗脫，得含胰蛋白酶原的淋洗液37.6L。
[0066]5) 二次親和層析
[0067]5.1)用40L的0.05mol/L, PH6的醋酸鹽緩沖液來平衡親和層析快膠柱；
[0068]5.2)平衡后，用含0.5mol/L NaCl的0.05mol/L, PH6的醋酸鹽緩沖液洗脫完全，流速控制在4mL/min左右，得含激肽釋放酶原的洗脫峰16.6L。
[0069]6)結晶
[0070]6.1)將含激肽釋放酶原的洗脫峰于_20°C冰箱中靜置結晶24h ；
[0071]6.2)將結晶減壓抽濾，干燥后得激肽釋放酶原0.38kg。 [0072]經核算，所得激肽釋放酶原收率為0.38 %。
[0073]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發明技術方案的保護范圍。
【權利要求】
1.一種二次親和層析提取激肽釋放酶原的方法，應用親和層析法對原有糜蛋白酶原和胰蛋白酶原提取工藝進行了研究、改進，通過工藝參數的研究、改進，特別是采用二次親和層析從中提取激肽釋放酶原。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述激肽釋放酶原是通過以牛胰或豬胰等為原料，將原料依次經過預處理、蛋白浸潰提取、分級沉淀、一次親和層析、二次親和層析、結晶制備得到的。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述提取工藝包括如下步驟: (1)胰臟洗凈后，立即浸入預先冰凍好的硫酸溶液保存； (2)將上述胰臟絞成胰漿，加入冰冷硫酸置于冷室中，攪拌后浸潰提取； (3)過濾,濾液中加入硫酸銨,冷室放置過夜后,減壓過濾； (4)經硫酸銨分級沉淀后得含激肽釋放酶原、糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的混合液，經過一次親和層析，分別得到含糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的淋洗液； (5)經過第二次親和層析，得到含激肽釋放酶原的洗脫峰； (6)將含激肽釋放酶原的洗脫峰于_20°C冰箱中靜置結晶，減壓抽濾，得激肽釋放酶原。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，胰臟在絞碎前，始終在冰冷的硫酸溶液中保存。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述硫酸溶液的濃度均為0.0125mol/L。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，為了更好的提取蛋白，硫酸銨沉淀可反復進行。
7.如權利要求3所述的方法，其特征在于:所述親和層析快膠柱包括:DEAE-Sepharose2B FF, DEAE_Sepharose4B FF, DEAE_Sepharose6B FF, DEAE-SepharoseCL-2B FF，DEAE-Sepharose CL-4B FF，DEAE-Sepharose CL-6B FF。
8.如權利要求3所述的方法，其特征在于:所述一次親和層析條件為:平衡液選用.0.01-0.2mol/L, PH5-10的Tris-HCL緩沖液，流速控制在l_5mL/min左右，洗脫液選用.0.l-5mol/L 的 NaCL 溶液。
9.如權利要求3所述的方法，其特征在于:所述二次親和層析條件為:平衡液選用0.01-0.3mol/L, PH3-8的醋酸鹽緩沖液，流速控制在l_5mL/min左右，洗脫液選用含.0.l-3mol/L NaCl 的 0.01-0.3mol/L，PH3-8 的醋酸鹽緩沖液。
10.如權利要求1~6所述的方法， 其特征在于:所得激肽釋放酶原的收率為0.2%~.0.4%。
【文檔編號】C12N9/64GK103667224SQ201310659583
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月2日 優先權日:2013年12月2日
【發明者】劉乃山, 林曉磊, 劉振海, 劉翠珍 申請人:青島康原藥業有限公司