馬鈴薯蛋白分離物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種使用特定的吸附劑獲得馬鈴薯蛋白部分的方法。具體的，本發明涉及經適當的配體官能化的載體材料，該載體材料包括特定的聚合物材料。通過使用根據本發明的官能化的支撐載體，可以以較高效率獲得馬鈴薯蛋白部分。
【專利說明】馬鈴薯蛋白分離物
【技術領域】
[0001] 本發明屬于食物蛋白的領域，具體涉及馬鈴薯蛋白部分的分離。
【背景技術】
[0002] 新鮮的馬鈴薯汁液是可溶材料和不溶材料的復雜混合物。它具有高蛋白含量，并 且進一步包括殘余的淀粉、礦物質、有毒的配糖生物堿，以及單體反應性酚類和聚合的反應 性酚類。它是馬鈴薯淀粉生產的副產物，并且通常被當作廢棄物。
[0003] 馬鈴薯汁液含有高達1. 5%重量的相對大量的蛋白。可以將馬鈴薯汁液分成三組： (i) 43kDa的高度同源的酸性糖蛋白的高分子量部分（HMW)(總馬鈴薯蛋白的40?50w%)， (ii) 5?25kDa的堿性低分子量部分（LMW)(總馬鈴薯蛋白的30?40w% )，該堿性低分 子量部分是糖蛋白；以及（iii)其它蛋白（總馬鈴薯蛋白的10?20w%)。馬鈴薯糖蛋白 (Patatin)屬于糖蛋白家族，具有酯酰水解酶和轉移酶活性，并且將主要是HMW部分的一部 分。LMW部分典型地包括蛋白酶抑制劑和通常具有低分子量的其它蛋白。
[0004] 盡管馬鈴薯汁液被當作廢棄物，但是馬鈴薯蛋白的營養質量高于酪蛋白的營養質 量，并且與整蛋（whole egg)的營養質量相當。馬鈴薯蛋白富含賴氨酸，并且在理論上是低 賴氨酸蛋白（諸如谷物蛋白）的優異的補充物。盡管馬鈴薯蛋白具有獨特的營養質量，但 是由于可用產物顯示出許多嚴重的缺點，馬鈴薯蛋白目前僅用作動物飼料。
[0005] 其中一個主要缺點是難以分離天然形式的馬鈴薯蛋白。通常在工業規模上，通過 熱凝結進行馬鈴薯蛋白從馬鈴薯淀粉制造廠的廢水中的回收，這樣產生的是變性的馬鈴薯 蛋白。處于變性形式的蛋白沒有它們期望的功能性質，諸如乳化能力、發泡能力、熱凝膠化 能力、結合水的能力等。甚至在食品工業中應用的最基本的要求（即在水中的溶解性）也 不能得到滿足。
[0006] 已經證實，之前通過更加溫和的方法（諸如膜過濾和沉淀技術）從馬鈴薯汁液中 分離蛋白的嘗試，在工業規模的生產環境中效率是非常低的。這是因為嚴重的膜污染，并且 伴隨著流量和分離能力的喪失。另外，這樣的方法不具有在馬鈴薯汁液中存在的各種蛋白 種類之間進行分離的能力。例如，膜過濾不能從聚合的酚化合物或多糖中分離高分子量的 蛋白產物，因為膜傾向于將它們都保留下來。
[0007] 之前，已經在工業上分離了天然的馬鈴薯蛋白。Codperatie Avebe U.A.的WO 2008/069650公開了分離天然馬鈴薯蛋白分離物的方法，該天然馬鈴薯蛋白分離物具有低 配糖生物堿含量。該方法包括絮凝及后續的膨脹床吸附，以使馬鈴薯蛋白吸附至吸附劑上， 然后洗脫天然的馬鈴薯蛋白分離物。但是該方法是昂貴的，并且在膨脹床吸附中使用的混 合式配體在馬鈴薯汁液中相對不穩定。
[0008] 名稱為先期色譜法的WO 2008/092450公開了使用配體和基于pH的分餾進行馬鈴 薯蛋白的大規模分餾和分離的方法。但是，發現配體對馬鈴薯汁液中的氧化過程敏感，并且 雖然添加亞硫酸鹽緩解了這一問題，但是仍然不能完全阻止這一問題的發生。配體相對快 速的氧化降解仍然是個問題。進一步地，沒有注意到孔隙度對吸附能力的影響，從而使得吸 附能力在不同的吸收劑之間變化很大。由于這一原因，在這一出版物中提到的很多配體根 本不適于以由成本效益的工業規模，通過穩定的操作來分離馬鈴薯蛋白的目的。
[0009] 因此，仍然需要一種分離天然馬鈴薯蛋白部分的改進的方法。本發明與以下發現 有關：在吸附材料中使用的配體的性質、配體與該吸附材料的連接的方式以及吸附材料的 孔隙度都對馬鈴薯蛋白的吸附效率有非常大的影響。因此，提供了一種分離天然馬鈴薯蛋 白部分的優化的方法。
【發明內容】
[0010] 本發明涉及一種分離天然馬鈴薯蛋白部分的方法。具體地，討論了一種通過等電 點分類馬鈴薯蛋白的方法，該方法允許分離兩種部分，即高分子量部分和低分子量部分。這 些部分能夠在沒有污染的情況下，并且進一步純化以去除不需要的有色化合物來獲得。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 圖1 :配體流線型直接（Streamline Direct) CSTl (CSTl)、4_疏基苯甲酸官能化的 Sepabead HFA(HFA MBA)和4-巰基苯甲酸官能化的S印abead EP (EP MBA)的結構式。支撐 載體由實心圓來表示。
[0012] 圖2 :在與不穩定的馬鈴薯果實汁液（不含亞硫酸鹽）一起孵育3x24h后，a)經酸 性配體1?12和b)經流線型直接（Streamline Direct)CSTl和具有4-MBA配體的Sepabead HFA官能化的支撐載體在加速污染測試中的著色。
【具體實施方式】
[0013] 本發明涉及一種從馬鈴薯汁液中分離天然的馬鈴薯蛋白部分的方法，該方法包 括：a)將馬鈴薯汁液的pH調節至4. 0?6. 5 ;b)使馬鈴薯汁液與具有孔隙的官能化的支撐 載體接觸，其中，至少90%的孔隙具有IOnm至200nm之間的孔徑，并且其中載體經疏水的混 合模式的配體官能化，該疏水的混合模式的配體具有2. 5?5、優選4?5的pKa，該配體通 過S原子或O原子、優選硫醚基團與載體相連；c)通過洗脫，使馬鈴薯蛋白部分從官能化的 支撐載體上解吸附；以及d)任選地，濃縮和/或干燥馬鈴薯蛋白部分。
[0014] 對于本發明，馬鈴薯汁液應理解為指任何種類的馬鈴薯來源的液體，其包含大量 天然馬鈴薯蛋白，并且包括通常作為淀粉生產的副產物獲得的馬鈴薯果實汁液（PFJ)，以及 已知為馬鈴薯果實水（PFW)的稀釋的PFJ。因此，能夠以以下形式使用，其中，馬鈴薯汁液通 常被認為是以稀釋或經部分加工的形式，例如來自馬鈴薯淀粉生產或來自消耗馬鈴薯的加 工的廢物流。
[0015] 馬鈴薯汁液還能夠被去除（deplete)馬鈴薯蛋白的特定部分，例如在應用根據本 發明的方法獲得的馬鈴薯汁液。例如，已經清除或部分清除了蛋白酶抑制劑部分（被稱為 低分子量（LMW)部分）的馬鈴薯汁液被稱為LMW去除或部分LMW去除的馬鈴薯汁液。另外， 已經清除或部分清除了馬鈴薯糖蛋白部分（被稱為高分子量（HMW)部分）的馬鈴薯汁液被 稱為HMW去除或部分HMW去除的馬鈴薯汁液。另外，這些被認為是用于根據本發明的方法 的馬鈴薯汁液。
[0016] 如本文所限定的，官能團是為分子帶來重要的化學反應性的基團，從而使在考慮 中的分子或基團產生改變。該化學反應性主要通過在還原性水環境（諸如在馬鈴薯汁液 中發現的還原性水環境）中的反應性來限定。正因如此，不將高穩定性的基團看作是本發 明范圍內的官能團，高穩定性的基團諸如是未經如下基團取代的芳香環（未經活化的芳香 環）：使芳香環活化，足以在這樣環境中使基團發生顯著改變。因此，不將苯環和雜環（諸 如未經活化的吡啶衍生物）看作是本發明范圍內的官能團。
[0017] 如在本文中使用的，連接基團是原子或多個原子的組，配體通過該原子或多個原 子的組與載體連接。已經通過化學反應形成了連接基團，從而使配體與間隔體（spacer)或 支撐載體相連接，或使間隔體與支撐載體相連接。
[0018] 如在本文中使用，骨架是多個原子的鏈（該多個原子使配體與支撐載體相連），包 括連接基團。更具體地，它是使配體與支撐載體直線連接的最短的原子鏈。
[0019] 馬鈴薯蛋白的高分子量（HMW)或富含馬鈴薯糖蛋白的部分具有最大的商業興趣， 因為該部分比低分子量（LMW)部分更難以以純的和天然的形式獲得，其中低分子量（LMW) 部分富含蛋白酶抑制劑。另外，它是馬鈴薯蛋白中同質性最高的部分。由于這一原因，本發 明的重點在于，以天然形式分離HMW部分中的蛋白，其中HMW部分主要包括熱和酸不穩定的 馬鈴薯糖蛋白。這是通過同時分離馬鈴薯蛋白的LMW部分來實現的。因為只要分離效率高， 純的和天然形式的兩種產物都是商業上感興趣的，因此應理解本發現還與馬鈴薯蛋白的分 離的LMW部分有關。
[0020] 粗制的馬鈴薯汁液是：還沒有經過任何純化并且本身能被使用的馬鈴薯汁液；或 者是首先進行無侵害性的預處理的馬鈴薯汁液，該無侵害性的預處理不影響包含在汁液中 的馬鈴薯蛋白的含量和性質。這樣的處理例如可以是通過諸如離心、過濾、絮凝和/或吸附 進行的PH調節、澄清（clarification)或脫色。具體地，存在用于對馬鈴薯汁液進行預清 潔的各種方法，其目的是去除例如不想要的污染物，例如配糖生物堿、（多）酚類、果膠、月旨 類、脂肪酸和/或原花青素和其有色的衍生物（諸如表兒茶酸和花青素）。在待定的申請 W02008/056977中記載了用于去除這些污染物中的一種或多種（具體是配糖生物堿）的方 法，其中記載了通過與分層的硅酸鹽接觸，從馬鈴薯汁液的加工流中吸附污染物。可選擇 地，WO 2008/069651記載了通過與活性炭接觸，從植物加工流的水性溶液中吸附污染物。在 使用包括絮凝法的預處理時，包括在應用本發明的方法之前預處理馬鈴薯汁液的方法可能 是特別有利的，其中絮凝法例如使用二價金屬離子（諸如鈣鹽或鎂鹽）。
[0021] 蛋白的等電點（IEP)是pH值，在該pH值時，存在于氨基酸上的正電荷與存在的負 電荷一樣多。因此，在IEP時，蛋白具有凈中性電荷（net neutral charge)。當使蛋白處于 低于它的IEP的pH時，該蛋白具有凈正電荷，并且當使蛋白處于高于它的IEP的pH時，蛋 白具有凈負電荷。可以通過標準步驟，諸如等電聚集法（IEF)，來確定IEP。
[0022] 在本文所描述的使用官能化的支撐載體的優選實施方式中，可以根據等電點，并 且同時根據分子量來對蛋白分級。這允許分離馬鈴薯蛋白部分，例如馬鈴薯糖蛋白部分或 蛋白酶抑制劑部分。本發明的具體方面是一種或多種馬鈴薯蛋白部分可以被連接到官能 化的支撐載體上，并且被分級以獲得一種或多種天然的馬鈴薯蛋白部分。馬鈴薯蛋白與本 文所提出的官能化的支撐載體上的配體連接，且沒有有色馬鈴薯汁液組分的過多的伴隨連 接，并且，官能化的支撐載體對于由馬鈴薯汁液組分引起的劣化和/或降解是穩定的。
[0023] 本發明的方法可以以兩種不同的方式來進行，這兩種不同的方式稱為選擇性吸附 和選擇性洗脫。因為本發明應用的兩種不同方式，本發明可以用于獲得馬鈴薯汁液中存在 的所有馬鈴薯蛋白，它們作為包括LMW部分和HMW部分的混合物。另外，本發明還可以用于 將來自馬鈴薯汁液的馬鈴薯蛋白分級成HMW部分和/或LMW部分。優選使用水性緩沖液進 行洗脫。
[0024] 在本發明的一種方式中，馬鈴薯蛋白部分通過選擇性吸附來獲得。在這種方式中， 在本發明的步驟a)中，將馬鈴薯汁液的pH調節到4.0至6.5之間，優選6.0。然后，在本 發明的步驟b)中，馬鈴薯汁液與官能化的支撐載體接觸，在該官能化的支撐載體中，至少 90%的孔隙具有IOnm至200nm之間的孔徑，并且其中載體經疏水的混合模式的配體官能 化，該疏水的混合模式的配體具有2. 5?5、優選4?5的pKa，該配體通過S原子或O原子， 優選硫醚基與載體相連。該方式的步驟b)發生馬鈴薯蛋白的LMW部分的選擇性吸附，并且 由此，與官能化的支撐載體接觸之后的馬鈴薯汁液被去除了馬鈴薯蛋白的LMW部分。這樣 得到LMW去除的馬鈴薯汁液。在該實施方式的步驟c)中，通過在pH小于3 (酸性洗脫）的 酸性洗脫或高于9的pH(堿性洗脫）下，使馬鈴薯蛋白的LMW部分從官能化的支撐載體上 解吸附。酸性洗脫最終得到在顏色、氣味和味道上質量較好的蛋白產物。
[0025] 在本發明的另一方式中，HMW馬鈴薯蛋白和LMW馬鈴薯蛋白（如果存在的話）都 首先作為包括馬鈴薯蛋白的HMW部分和LMW部分（如果存在的話）的蛋白混合物被吸附至 官能化的支撐載體。因此，該方法涉及總馬鈴薯蛋白部分的吸附。在這種方式中，馬鈴薯 汁液可以是如上所述的粗制的或經預處理的馬鈴薯汁液，在這種情況中，馬鈴薯蛋白的HMW 部分和LMW部分都被吸附。另外，可以方便地使用LMW去除的馬鈴薯汁液，諸如通過馬鈴薯 蛋白的LMW部分的選擇性吸附之后獲得的馬鈴薯汁液，在這種情況中，基本上僅存在馬鈴 薯蛋白的HMW部分。在這種情況中，該方式需要從LMW去除的馬鈴薯汁液中選擇性吸附馬 鈴薯蛋白的HMW部分。
[0026] 本發明的這種方式在步驟a)中包括pH-調節步驟，其中將馬鈴薯汁液的pH調節 到4. 0至6. 5之間，優選5. 2。然后，在步驟b)中，馬鈴薯汁液與官能化的支撐載體接觸，在 該官能化的支撐載體中，至少90%的孔隙具有IOnm至200nm之間的孔徑，并且其中載體經 疏水的混合模式的配體官能化，該疏水的混合模式的配體具有2. 5?5、優選4?5的pKa， 該配體通過S原子或O原子、優選硫醚基與載體相連。在這一實施方式中，步驟b)發生馬 鈴薯蛋白的HMW部分和LMW部分（如果存在的話）的同時吸附。在步驟c)中，通過pH < 3 或pH > 9的酸性洗脫或堿性洗脫，作為包括HMW部分和LMW部分的單個蛋白部分，洗脫存 在于馬鈴薯汁液中的馬鈴薯蛋白。另外，在這種情況中，酸性洗脫得到在顏色、氣味和味道 上質量優良的蛋白產物。
[0027] 對于本發明的這種方式，可選擇地，在步驟c)中可以進行選擇性洗脫。在這種情 況中，在步驟c)中，通過在pH5. 7?6. 3、優選pH6. 0時的馬鈴薯蛋白的HMW部分的第一選 擇性洗脫，進行使馬鈴薯蛋白部分從官能化的支撐載體上解吸附。然后，通過如上所述的PH 低于3的酸性洗脫，或pH高于9的堿性洗脫，可以發生馬鈴薯蛋白的LMW部分（如果存在 的話）的選擇性洗脫。當在該實施方式中使用LMW去除的馬鈴薯汁液時，可以使用較高的 洗脫pH，諸如pH 5. 7?8. 9、優選8. 0,較高的洗脫pH提高HMW部分的洗脫效率。
[0028] 通常，在本發明的步驟a)中，將馬鈴薯汁液的pH調節至4. 0?6. 5、優選5. 2,用 于使存在于馬鈴薯汁液中的所有馬鈴薯蛋白部分都吸附至官能化的支撐載體，然后洗脫馬 鈴薯蛋白部分。可選擇地，將馬鈴薯汁液的pH調節至4. O?6. 5、優選6. 0,用于進行馬鈴 薯蛋白的LMW部分的選擇性吸附。
[0029] 可以使用本領域已知的各種酸和/或堿，以濃縮或稀釋的形式或合并以形成緩沖 液，將馬鈴薯汁液的pH調節至4. 0?6. 5。因此，可以使用各種類型的強酸，諸如鹽酸、硫 酸、硝酸。另外，也可以使用弱酸，諸如磷酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、乳酸。另外，馬鈴薯汁液的 預處理可能具有需要調節至較高PH的結果。在這種情況中，優選的強堿例如是氫氧化鈉、 氫氧化鉀、氫氧化鈣。優選的弱堿例如是碳酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、亞硫酸（氫） 鹽的鈉鹽和鉀鹽。當使用緩沖液時，使用上述或本領域已知的其它弱酸和弱堿的組合，將馬 鈴薯汁液調節到所需的pH。
[0030] 通常，優選使用強酸和/或堿來調節pH，最優選使用鹽酸和/或氫氧化鈉。此外， 特別是當尋求較低的氯化物含量時，用來調節PH的非常優選的酸是甲酸。
[0031] 在本發明的步驟b)中，馬鈴薯汁液與官能化的支撐載體接觸。支撐載體可以具 有多種形式或形狀，只要它允許與馬鈴薯汁液發生足夠的接觸以允許發生吸附。支撐載 體可以采取任何形狀，諸如球形、豆形、液滴形或橢圓形，并且其中包括珠子、顆粒或網格 (grid)，但是本領域技術人員可以想到其它形狀。支撐載體優選基本是球形的，并且是以顆 粒的形式。優選的顆粒或珠子具有半徑為50?150 μπι的珠子尺寸。該珠子尺寸在吸附能 力（比較小的珠子尺寸高）和對方法參數（諸如壓力和成本）的敏感性之間提供了良好的 平衡。
[0032] 支撐載體的重要方面在于，它是多孔材料。但是孔隙可能會被水凝膠填充或覆蓋。 具體地，支撐載體應包含孔隙，該孔隙的至少90 %、優選95%、更優選98 %且最優選至少 99%具有IOnm的孔徑下限和200nm的孔徑上限。因此，應理解在IOnm至200nm之間的孔 徑指所有孔隙的至少90 %、優選95 %、更優選98 %且最優選至少99 %具有IOnm至200nm 之間的孔徑。優選地，孔隙具有20nm的孔徑下限和150nm、優選IOOnm的孔徑上限，并且甚 至更優選的，孔隙具有30nm的孔徑下限和lOOnm、優選75nm的孔徑上限。通過使用汞注入 的孔隙度測定法來便利地確定孔徑，使用汞注入的孔隙度測定法是技術人員公知的技術。
[0033] 另外，在此方面的多孔材料是孔隙度（被定義為直徑小于150nm的所有孔的總的 孔隙體積）在〇. 5ml/g至I. 5ml/g之間的材料。優選地，孔隙度是0. 7?I. lml/g。對于本 發明，也通過汞注入來確定孔隙度。
[0034] 對于本發明的范圍，支撐載體的孔徑和孔隙度非常重要。但是，支撐載體可以被安 裝在適當的核心上，以使支撐載體覆蓋核心的大部分或整個核心。可選擇的，支撐載體可以 用基本被多孔材料涂層覆蓋的核心材料來描述。由于多種原因，諸如為了降低所需的多孔 材料的量或為了改變顆粒的密度或重量，可以使用這樣的核心。核心可以為實現這些目標 的任何材料，包括聚合物材料或金屬性材料，以及無機材料（諸如金屬氧化物）。優選的，使 用碳化鎢（WC)、鐵或磁鐵礦作為核心材料。核心與支撐載體的比率可以是任何值，只要整個 顆粒滿足足夠的孔隙度的標準，并且保留有被如下所述的適當的配體官能化的可能性。根 據本發明的官能化的支撐載體通過使適當的配體與支撐載體反應來獲得，從而獲得在本發 明中使用的官能化的支撐載體。
[0035] 用于足以進行吸附的接觸的前體是使用孔徑為10?200nm、優選10?150nm、更 優選20?IOOnm且甚至更優選30?75nm的支撐載體。發現較小的孔徑會阻礙吸附，而較 大的孔隙產生較小的接觸表面，以致特別是對HMW部分具有低吸附能力。只要滿足了上述 特征，制成支撐載體的材料就是次要的。因此，該材料可以是在方法條件下穩定的任何聚合 物或生物材料，并且可以被制備成具有如上所述孔徑的孔隙，同時經PKa 2. 5?5的至少一 種疏水的混合模式的配體官能化，該疏水的混合模式的配體通過S原子或O原子、優選硫醚 基與載體相連。
[0036] 配體的支撐載體可以是多孔的合成聚合物、多孔的多糖、多孔的無機材料，或它們 的任意組合。優選的，支撐載體可以由多孔的聚合物來制成，多孔的聚合物諸如為聚甲基丙 烯酸甲酯（PMM)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯、多孔的多糖（如纖維素、葡聚 糖或瓊脂糖）和/或多孔的氧化硅、受控多孔玻璃或羥磷灰石。但是，最優選的，使用瓊脂 糖和/或PMMA作為支撐載體。
[0037] 還可以使用如下的支撐載體，該支撐載體包括多孔的固體材料（諸如多孔的無機 材料，諸如陶瓷）與多孔的水凝膠材料（其中例如為某些多孔的多糖，諸如瓊脂糖）的組 合。
[0038] 對于實現馬鈴薯蛋白至官能化的支撐載體的充分吸附，要附接至支撐載體的配體 非常重要。適當的配體是疏水的混合模式的配體。這意味著，它們的表現是基于靜電相互 作用和疏水相互作用的組合。配體的疏水性對于馬鈴薯蛋白的HMW部分的連接很重要。疏 水配體在本領域中是已知的，它們可以是任何非水溶性的基團，即非極性基團。發現了如下 所述的疏水基團允許本發明的實施。
[0039] 發現了馬鈴薯糖蛋白更喜歡稍微疏水的環境，并且因此吸附至具有一定程度的疏 水性的官能化的支撐載體。疏水配體在本領域中是已知的，并且可以包括芳香基或雜芳香 基，以及其它的疏水分子組分。但是，當僅使用沒有其它功能性的疏水配體時，觀察到HMW 部分的吸附，以及污染的有色物（其中有酚類）的吸附。這對馬鈴薯蛋白的HMW部分的分 離有負面影響。因此，還期望有其它的功能性來防止污染。
[0040] 還發現，在支撐載體上的配體的pKa在2. 5至5之間、優選在4至5之間，對于馬 鈴薯蛋白至官能化的支撐載體的恰當吸附是有利的。因此，優選在用于根據本發明的官能 化的支撐載體的配體中存在羧酸基，但可選擇的，可以使用PKa在此范圍中的其它配體和 間隔體。
[0041] 當使用pKai 2. 5至5之間的疏水配體時，馬鈴薯蛋白的LMW部分能夠吸附至官 能化的支撐載體。該口1(3范圍的優點在于使用弱酸溶液或緩沖液可以發生馬鈴薯蛋白部分 的洗脫。高PH的洗脫引起經分離的馬鈴薯蛋白部分的著色，這優選是要避免的。另外，pH 低于2. 5的洗脫可能需要存在強酸和/或大量的鹽，這會產生浪費的廢物流，并且可能影響 經分離的馬鈴薯蛋白分離物的質量。優選的，配體的口心在2. 5至5之間，因為在這些條件 下，在上述低PH和高pH下進行洗脫的缺點之間的平衡是最佳的，從而得到最佳的性能。
[0042] 進一步發現，pKa在2. 5至5之間的官能化的支撐載體的使用，諸如攜帶有酸基的 載體，大大降低了污染物至官能化的支撐載體的吸附。
[0043] 具有恰當的pKa范圍和恰當的疏水性的組合時，發現HMW和LMW部分可以吸附至 官能化的支撐載體，且不會發生污染物（諸如（聚合）酚類和其它有色物）的顯著吸附。這 與帶正電荷（混合模式）的陰離子交換和疏水作用的樹脂相比是顯著的改進。
[0044] 具體地，配體的pKa應優選在2. 5?5之間，更優選在4?5之間。配體可以是脂 肪族配體、經取代的脂肪族或芳香族配體（包括經取代的和/或雜芳香基），或它們的組合。 適當的芳香基例如是經取代的或未經取代的苯基、萘基、吡啶和嘧啶結構。
[0045] 因此，可以用于官能化支撐載體的配體是具有2. 5?5的pKa的疏水的混合模式 的配體。該配體應通過S原子或O原子、優選硫醚基與載體相連。
[0046] 優選的，這些配體選自經取代的吡啶、苯甲酸、水楊酸、煙酸或萘甲酸的組，其中一 種取代是在可用環位置處經（CH 2)n-XH基團取代，其中n = 0?4并且X = O或S。優選的， 這些配體選自經（CH2)n-SH取代的吡啶、苯甲酸、水楊酸和煙酸的組，其中η = 0?4。甚至更 優選的，這些配體選自經巰基取代的苯甲酸、水楊酸和煙酸的組（巰基相當于硫醇基）。但 是，最優選的配體是4-巰基苯甲酸和2-巰基煙酸（2-巰基吡啶-3-羧酸），目前認為4-巰 基苯甲酸是這兩種最優選的配體中最好的。
[0047] 配體應通過S原子或0原子與支撐載體相連，例如通過硫酯基、硫醚基、醚基或酯 基與支撐載體相連。這意味著配體通過在骨架中含S原子或0原子的連接基團與載體相連。
[0048] 優選的，使用含硫的連接基團，諸如硫醚連接基團或硫醋連接基團。優選的，硫醚 基（通過硫橋（sulphide bridge)，_S_)使配體與支撐載體相連。這是很重要的，因為發現 通過S原子或0原子的連接，但特別是通過使用硫醚基的S原子的連接，會產生對例如任何 類型的馬鈴薯汁液所引起的降解的抗性。相比之下，連接基團中存在氮雜原子，例如胺基或 氨基（"N-連接的")，會產生在馬鈴薯汁液存在下的官能化的支撐載體的較快降解。在使配 體和載體相連的基團中存在多個雜原子的情況中，優選雜原子的至少一半、更優選至少3/4 是S原子和/或0原子，并且最優選氮原子不存在于骨架中。雜原子包括S、0、P和N原子。
[0049] 通過含氧的基團（諸如酯或醚，且優選醚）連接的配體顯示出對降解（或氧化、修 飾、褪色等）的增強的抗性，但是盡管比胺或氨連接的配體慢，這樣的配體仍然會降解。
[0050] 但是，氧連接的配體，特別是醚，是不像硫連接的配體（優選硫醚）那么穩定的。硫 連接的配體，尤其是其中配體是通過硫醚基與支撐載體相連的那些配體，顯示出對由馬鈴 薯汁液引起的降解具有特別高的抗性，因此在通過吸附方法從馬鈴薯汁液中分離馬鈴薯蛋 白中使用是特別有利的。
[0051] 同時，氧連接的配體具有比硫連接的配體（尤其是硫醚）低的HMW連接能力。這 可能被解釋為硫具有與碳大約相等的負電性，以致于在支撐載體和配體之間的連接鍵僅具 有較小的極性，這對于使配體的疏水性最大化是很重要的。
[0052] 因為這些原因，配體至支撐載體的硫連接或氧連接是優選的，并且配體至支撐載 體的氮連接是不優選的。在硫連接和氧連接之間，硫連接是優選的。最優選的，配體至支撐 載體的硫醚連接比氧連接更優選。
[0053] 任選的，配體可以通過使用間隔體被附接至支撐載體。間隔體應適于通過O原子 或S原子與聚合的支撐載體共價連接，并且通過O原子或S原子與配體共價連接。用于使配 體與聚合的支撐載體相連的間隔體優選在骨架中不包括很多氮原子。在間隔體的骨架中存 在更多雜原子的情況中，雜原子的至少一半、優選至少3/4是S原子或O原子。最優選的， 用于使配體與聚合的支撐載體相連的間隔體在骨架中不包括氮原子。
[0054] 間隔體基團優選對酸性和堿性環境是足夠穩定的，并且對在通過添加亞硫酸鹽獲 得的馬鈴薯汁液中的還原性條件是有耐受性的。這樣的間隔體對通常包含在馬鈴薯汁液或 加工流中的組分是高度穩定的。可用于連接本發明的配體的間隔體包括：含環氧化物和環 硫乙烷的那些間隔體、鹵代乙酰基和烷基鹵化物衍生物、丙烯酰氧基衍生物和/或芳基化 劑。優選的，不包括許多附加極性的間隔體用于連接，諸如環氧化物和環硫乙烷。技術人員 能夠想到將在配體和聚合的支撐載體之間產生O連接或S連接的更多的間隔體，其中這些 連接中的至少一種受到硫醚基的影響，并且這樣的間隔體不會被排除在本發明之外。
[0055] 配體應以足夠的量被附接至支撐載體，以實現高蛋白連接能力。這意味著，通常適 當的配體以10?200meq/l，優選10?120meq/l，并且更優選30?80meq/l的量被附接至 支撐載體。這可以通過用于確定交換能力的公知的方法來確定，下面將描述其中的一個實 例。
[0056] 在本發明的又一方面，官能化的支撐載體吸附馬鈴薯蛋白的連接能力應足夠高， 以允許對馬鈴薯蛋白進行工業規模的分離。因此，官能化的支撐載體的吸附能力應為來自 PFJ的總蛋白至少為25g/l，優選至少30g/l。另外，官能化的支撐載體應能夠從LMW去除 的PFJ中吸附至少20g/l的HMW馬鈴薯蛋白，優選至少25g/l的HMW馬鈴薯蛋白。官能化 的支撐載體的連接能力通過交換能力的確定來確定。
[0057] 在本發明的步驟c)中，蛋白部分通過洗脫從官能化的支撐載體上解吸附。這優選 通過使用具有固定PH的水性緩沖液來進行，該具有固定pH的水性緩沖液可以基于蛋白的 等電點（IEP)來（任選地，選擇性）洗脫蛋白部分。在本發明中使用的緩沖液可以包括任 何弱酸或弱堿化合物，以及與強酸的組合。LMW馬鈴薯蛋白的酸性洗脫比堿性洗脫更優選， 以避免使蛋白發生褐變和脫酰胺化。進一步的，通過高鹽含量的緩沖液進行LMW馬鈴薯蛋 白的洗脫是不優選的，因為會有浪費水或緩沖液再循環的問題。優選的，用于HMW部分的洗 脫的緩沖液包括檸檬酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽或磷酸鹽緩沖液。用于LMW部分的洗脫的緩沖液 可以包括甲酸、乙酸、乳酸、馬來酸、丙二酸、蘋果酸、檸檬酸和/或磷酸，或弱酸緩沖液與強 酸（如鹽酸或硫酸）的組合。但是，優選的，使用磷酸緩沖液，或甲酸和鹽酸的混合物洗脫 LMW部分和HMW部分以及它們的組合。
[0058] 當在加工過程中需要調節馬鈴薯汁液的pH時，例如需要調節至較低pH或較高的 PH時，使用酸或堿調節pH。這樣的用于馬鈴薯汁液的pH調節的酸和堿可以有利地是弱酸， 例如是檸檬酸、乳酸、甲酸、乙酸或磷酸，或強酸，如硝酸、鹽酸和/或硫酸。另外，在馬鈴薯 汁液加工的過程中可能需要調節到較高的pH。在這種情況中，優選的強堿例如是氫氧化鈉、 氫氧化鉀或氫氧化鈣。優選的弱堿例如是碳酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和亞硫酸（氫） 鹽的鈉鹽和鉀鹽。當使用緩沖液時，使用上述或本領域已知的其它弱酸和弱堿的組合，將馬 鈴薯汁液調節到所需的pH。
[0059] 在本發明的步驟d)中，通過例如（超）過濾、離心、沉降、微孔過濾、沉淀和各種形 式的色譜法（例如交換色譜法、凝膠過濾、親和色譜法、疏水作用色譜法和反相色譜法），如 上所述的經洗脫的蛋白部分可以在下游進行進一步的純化。進一步的，可以使用不同的配 體實施吸附色譜法，以進一步純化獲得的蛋白部分。
[0060] 優選的，通過超過濾來濃縮天然的馬鈴薯蛋白部分。超過濾膜材料的選擇可以強 有力地影響選擇性。優選的，超過濾膜包括纖維素、聚醚砜（PES)和聚砜（PS)。可以使用 基于PES或PS的膜，濃縮蛋白酶抑制劑分離物，其中PES基或PS基的膜的分子截留為2? 20kDa并且在一定程度上為30kDa。可以使用基于PES或PS的膜或基于再生的纖維素的 膜，濃縮馬鈴薯糖蛋白分離物，其中基于PES或PS的膜的分子截留為5?30kDa，基于再生 的纖維素的膜的分子截留為5?30kDa。這些膜可以作為管狀、螺旋纏繞、中空的纖維、盤 和框架，或作為交叉轉動感應的剪切過濾裝置（cross-rotational induced shear filter unit)來實施。
[0061] 在pH值為4.0?8.0,優選pH為6.0?7. 5時，超過濾馬鈴薯糖蛋白分離物。對 于蛋白酶抑制劑分離物，使用的pH值為3?7,優選3. 2?4. 5。在去除雜質后，可以使pH 升高至pH 7?10,以能夠得到通過膜的高流量。優選在低pH 3. 0?5. 0下對蛋白酶抑制 劑進行加工。
[0062] 除了純化步驟之外，通過使用二氧化碳的蒸發、冷凍濃縮或等電點沉淀可以使通 過本發明的方法獲得的天然的馬鈴薯蛋白分離物濃縮至含高達超過20%的干物質。基于氮 的水平（凱氏氮含量倍數（Kjeldahl nitrogen content times) 6. 25)，這些濃縮物的干物 質可以含有超過85 %的蛋白，優選超過90 %的蛋白。經干燥的產物可以含有超過90 %，優 選超過92 %的蛋白，同時水分水平為4?9 %。
[0063] 在又一方面，本發明涉及通過本發明的方法可獲得的天然馬鈴薯蛋白部分。該天 然的馬鈴薯蛋白部分可以是總的天然馬鈴薯蛋白部分，天然馬鈴薯蛋白的馬鈴薯糖蛋白部 分，或天然馬鈴薯蛋白的蛋白酶抑制劑部分，或它們的任意組合或亞部分。這些馬鈴薯蛋白 部分的特征是它們的高純度和高穩定性。本發明的總天然馬鈴薯蛋白部分可以具有4. 5以 上的等電點，超過4kDa的分子量。馬鈴薯蛋白部分優選基本沒有馬鈴薯來源的有機酸和氨 基酸。
[0064] 本發明的天然馬鈴薯蛋白的馬鈴薯糖蛋白部分可以具有5. 8以下、優選4. 8?5. 5 的等電點，超過30kDa、優選超過35kDa的分子量。
[0065] 本發明的天然馬鈴薯蛋白的蛋白酶抑制劑部分可以具有5. 5以上、優選5. 8以上 的等電點，35kDa以下、優選4?30kDa的分子量。
[0066] 可以通過噴霧干燥、急驟干燥（flash drying)或冷凍干燥來獲得干燥的天然馬鈴 薯蛋白。馬鈴薯糖蛋白部分、蛋白酶抑制劑部分和總馬鈴薯蛋白部分被設定為適當的PH，以 確保有良好的水溶性。濃縮物的pH被設定為7.0?9.0,優選為7.0?8.0。可以使用低 pH值（3. 0?4. 0)以及高pH值（7. 0?9. 0)，來噴霧干燥蛋白酶抑制劑的濃縮物。由此獲 得的天然馬鈴薯蛋白在7. 0的pH及25°C的溫度下，具有超過90%，優選超過95 %的水溶 性。水溶性被表示為在對溶液進行離心之后，蛋白在上清液中的百分比。
[0067] 在優選的實施方式中，在超過濾濃縮之后獲得的天然馬鈴薯蛋白分離物具有干物 質含量超過75%的蛋白含量。在此，蛋白含量被限定為凱氏氮含量倍數6. 25。優選的，天然 馬鈴薯蛋白分離物中的蛋白含量超過80 %，更優選超過90 %，并且甚至更優選超過95 %。
[0068] 可以通過二維凝膠電泳分析，與使用MALDI-T0F質譜分析對分離物中的關鍵蛋白 的鑒定相組合，來描述本發明的天然馬鈴薯蛋白分離物的特征。可以在使用PH梯度為3至 8,并且分子量為5?IOOkDa的二維凝膠電泳中，分離蛋白。
[0069] 為了使用本發明，通過例如將官能化的支撐載體安裝在柱子、膠管或管狀物中固 定該官能化的支撐載體，同時馬鈴薯汁液流過或通過該官能化的支撐載體。在這樣的實施 方式中，吸附最可能通過連續或半連續的方法來實現，例如填充床色譜法、擴展床色譜法、 膜吸附器或磁性穩定的床色譜法。另外，官能化的支撐載體可以以網格形式被安裝在這種 管狀物中，馬鈴薯汁液流通過網格與官能化的支撐載體接觸。其它方式是本領域技術人員 容易想到的，也并不被排除在外。
[0070] 在本發明的另一方面中，通過將馬鈴薯汁液和支撐載體組合在單個容器中，使官 能化的支撐載體與馬鈴薯汁液接觸，在這種情況中，可以攪拌、搖動或其它物理地混合這樣 的混合物，以增加支撐載體和馬鈴薯汁液之間的接觸。在這樣的實施方式中，馬鈴薯蛋白的 吸附最可能是分批過程，這在使用高粘性的蛋白溶液時是有利的。
[0071] 但是，能夠實施使馬鈴薯汁液與官能化的支撐載體接觸的任何方式，前提是接觸 足夠強以使馬鈴薯蛋白能夠吸附至官能化的支撐載體，該支撐載體具有如上所述的孔隙度 并且允許附接至少一種PKa 2. 5?5的疏水的混合模式的配體，該疏水的混合模式的配體 通過S原子或O原子、優選硫醚基與載體相連。
[0072] 現在，將通過以下的非限制性實例來例示本發明。
[0073] 方法
[0074] 支撐載體的官能化
[0075] 原理
[0076] 在等于或高于8. 5的pH(依賴于連接基團），發生配體對經環氧化物活化的 Sepabead EP (或 HFA)支撐載體（獲自 Resindion, Binasco (比納斯科），Italy (意大利）） 的官能化。將用于支撐載體的官能化的配體溶液如下設定至固定的PH :巰基官能化的配體 溶液的pH被設定為8. 5,氨基官能化的配體溶液的pH被設定為9. 5,并且羥基官能化的配 體溶液的PH被設定為等于或高于11。如果配體在期望的pH下不溶解，則升高pH，直至配 體完全溶解。
[0077] 方法
[0078] 通過添加5M氫氧化鉀，直至達到期望的pH，使配體（1M, Sigma Aldrich (西格瑪奧 瑞奇），Zwijndrecht (茲韋恩德雷赫特），Netherlands (荷蘭））溶解在250mL除礦物質的 水中。使用IOOmM硼酸鹽，對巰基或氨基取代的配體溶液進行緩沖處理。在PH為11時，實 施羥基官能化配體的連接反應，不需要添加緩沖液。在配體的溶解過程中，調節PH并且添 加除礦物質的水，直至在期望的PH且體積為300mL時，配體完全溶解。允許在添加支撐載 體之前，使配體溶液達到室溫。
[0079] 在玻璃濾器中，使用除礦物質的水清洗經環氧化物活化的S印abead EP支撐載體 (100mL，Resindion,比納斯科，意大利），直至電導率低于10yS/cm，并且通過在真空條件 下運行支撐載體來去除過量的水。然后，將支撐載體轉移到具有配體溶液的500mL的燒瓶 中，使用磨口塞封閉燒瓶并且在175rpm下孵育過夜。在1小時后及第二天清晨檢驗pH。
[0080] 在使用IOOmM氫氧化鈉沖洗過量的配體后，通過使官能化的支撐載體在50°C的IM 氫氧化鈉中孵育2小時，使剩余的環氧基水解。將官能化的支撐載體儲存在4°C的50mM的 氫氧化鈉中。
[0081] 在實例2中使用的PMMA和瓊脂糖支撐載體經環氧活化，并且因此能夠根據上面的 Sepabead EP和HFA中所述的相同的原理和方法，使用4MBA對它們進行官能化。
[0082] 根據開發商的說明書（Sartorius Stedim Biotech(賽多利斯生物技術公 司），Goettingen(哥廷根），Germany (德國）），對Sartobind的經環氧活化的膜裝置進行官 能化。
[0083] 計算
[0084] 使用ChemAxon的MarvinSketch (2011) 5· 4. I. 1軟件計算經標記的配體的pKa，其 中pKa選項列在表1中。通過使用官能化的支撐載體的環氧基計算pKa，考慮到由標記（可 能影響陰離子基團的PKa)導致的電子分布的可能改變。
[0085] 表I :MarvinSketch中計算口1^的選定的pK a選項
[0086]
[0087] 總交換能力
【權利要求】
1. 一種用于從馬鈴馨汁液分離天然的馬鈴馨蛋白部分的方法，包括w下步驟： a)將所述馬鈴馨汁液的抑調節至4. 0?6. 5 ; b) 使所述馬鈴馨汁液與具有孔隙的官能化的支撐載體接觸，其中，至少90%的所述孔 隙具有lOnm至200nm之間的孔徑，并且其中，所述支撐載體經地a為2. 5?5的疏水的混 合模式的配體官能化，該配體通過S原子或0原子與所述支撐載體相連； C)通過洗脫，使所述馬鈴馨蛋白部分從官能化的所述支撐載體解吸附；W及 d)任選地濃縮和/或干燥所述馬鈴馨蛋白部分。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，洗脫在5. 7至8. 9之間的抑下進行。
3. 根據權利要求2所述的方法，其中，所述馬鈴馨蛋白部分是馬鈴馨糖蛋白部分。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，洗脫在9 W上或3 W下的抑下進行。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，所述馬鈴馨蛋白部分是蛋白酶抑制劑部分。
6. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，使用水性緩沖液進行洗脫。
7. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述混合模式的配體選自經取代的 苯甲酸、水楊酸、煙酸和蒙甲酸的組，其中取代是在可用的環位置處經（CH2)"-XH基團的取 代，（CH2)n-XH 中，n = 0 ?4 并且 X = S。
8. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述支撐載體是多孔的合成聚合物、 多孔的多糖、多孔的無機材料，或它們的任意組合。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述疏水的混合模式的配體通過間 隔體被附接至所述支撐載體，所述間隔體通過0原子或S原子與所述支撐載體連接，并且所 述間隔體不包括含氮的官能團。
10. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，使用酸和/或堿調節所述馬鈴馨汁 液的抑。
11. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述馬鈴馨汁液已經經過了預處 理，所述預處理包括將污染物吸附至分層的娃酸鹽和/或活性炭，和/或絮凝。
12. -種通過根據前述權利要求中任一項所述的方法獲得的天然的馬鈴馨蛋白部分。
【文檔編號】A23J1/00GK104470368SQ201380037257
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年7月10日 優先權日:2012年7月11日
【發明者】馬爾克·路易吉·費代里科·朱塞平, 馬克·克里斯蒂安·勞斯, 揚·斯赫伊浦爾 申請人:艾維貝合作公司