一種葡萄糖淀粉酶的制作方法

一種葡萄糖淀粉酶的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的葡萄糖淀粉酶。本次發明首次公開了粉紅粘帚霉的葡萄糖淀粉酶基因，通過對重組菌進行搖瓶發酵實驗并測得發酵液酶活高達292U/ml。本發明所述葡萄糖淀粉酶能從糖鏈的非還原端高效分解α-1,4-糖苷鍵，水解出葡萄糖，也能緩慢水解a-1.6葡萄糖苷鍵，轉化為葡萄糖可廣泛應用于淀粉糖工業。
【專利說明】一種葡萄糖淀粉酶
【技術領域】:
[0001]本發明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種葡萄糖淀粉酶及其應用。
【背景技術】:
[0002]葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase, EC3.2.1.3),是水解淀粉的外切作用糖酶。它能把淀粉從非還原性未端水解α -1.4葡萄糖苷鍵產生葡萄糖，也能緩慢水解a-1.6葡萄糖苷鍵，轉化為葡萄糖。同時也能水解糊精，從糖原的非還原末端釋放β-D-葡萄糖。
[0003]多種細菌、真菌、酵母和植物都生產葡萄糖淀粉酶，并且工業上運用的葡萄糖淀粉酶大都來源于真菌。例如來自下列菌體:曲霉屬(Aspergillus) (Svenssonet al.,Carlsberg Res.Commun.48:529-544(1983) ;Boel et al.,Agric.Biol.Chem.53:923-929(1989);美國專利號 5，024，941;美國專利號 4，794，175 和W088/09795);藍狀菌屬(Talaromyces)(美國專利號 4，247，637;美國專利號 6，255，084;和美國專利號 6,620,924);根霉屬(Rhizopus) (Ashikari et al., Agric.Biol.Chem.50:957-964(1986);Ashikari et al., App.Microbi0.Biotech.32:129-133(1989)和美國專利號 4，863，864);以及毛霉屬(Mucor) (Houghton-Larsen et al., Appl.Microbiol.Biotechnol.62:210-217(2003)等等。
[0004]目前國 內外還沒有粉紅粘帚霉葡萄糖淀粉酶基因的研究報道，本發明運用分子克隆及基因工程技術手段從粉紅粘帚霉菌中克隆出葡萄糖淀粉酶基因，并將其轉入到黑曲霉Gl中得到了高效表達。

【發明內容】
:
[0005]本發明的目的是提供一種新型高產葡萄糖淀粉酶的菌株進而運用于工業生產。所述葡萄糖淀粉酶來源于粉紅粘帚霉菌，本發明采用基因工程技術手段將來源于粉紅粘帚霉菌的葡萄糖淀粉酶基因轉化到黑曲霉Gl中并且得到了高效表達。這種新型葡萄糖淀粉酶其特征在于:
[0006]I)其氨基酸序列為SEQ ID NO:1的葡萄糖淀粉酶；
[0007]2)在I)中的氨基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個氨基酸得到的，具有I)中葡萄糖淀粉酶活性的酶。
[0008]本發明另一方面提供了編碼上述葡萄糖淀粉酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQID N0:2。
[0009]本發明提供了一種用于表達氨基酸序列為SEQ ID NO:1的葡萄糖淀粉酶的重組表達載體。
[0010]本發明還提供了一種能特異性表達這種新型葡萄糖淀粉酶的重組菌。
[0011 ] 本發明所用的轉化宿主菌為黑曲霉Gl。
[0012]本發明的葡萄糖淀粉酶及上述的重組工程菌用于制備葡萄糖。
[0013]本次發明首次公開了粉紅粘帚霉的葡萄糖淀粉酶基因，通過對重組菌進行搖瓶發酵實驗并測得發酵液酶活高達292U/ml。本發明所述葡萄糖淀粉酶能從糖鏈的非還原端高效分解α -1, 4-糖苷鍵，水解出葡萄糖，也能緩慢水解a-1.6葡萄糖苷鍵，轉化為葡萄糖可廣泛應用于淀粉糖工業。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0014]圖1:構建的重組表達載體pGm-3440示意圖。
[0015]圖2:重組菌發酵液上清SDS-PAGE電泳圖，箭頭所指地方為56KD的葡萄糖淀粉酶。
[0016]圖3:葡萄糖淀粉酶活性隨溫度變化曲線。
[0017]圖4:葡萄糖淀粉酶活性隨pH變化曲線。
【具體實施方式】:
[0018]下面結合實例對本發明的方法做進一步說明。但實例僅限于說明，并不限于此。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。本領域相關的技術人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發明。但是，本發明的保護和權利要求范圍不限于所提供的案例。
[0019]實施例1:葡萄糖淀粉酶基因的篩選
[0020]通過比較蛋白質組學將本實驗室(蛋白質表達及分子生物學實驗室)預先建立的葡萄糖淀粉酶序列與粉紅粘帚霉全基因組預測蛋白質序列進行本地Blastp，從中獲得一些同源性較高的序列。將這些同源性較高的序列進行NCBI在線Blastp并將比對結果進行分析確定最有可能的葡萄糖淀粉酶序列。運用SignalP4.1Server對這些可能的序列進行分析，把含有信號肽的序列作為克隆的目的基因。
[0021]葡萄糖淀粉酶基因的克隆
[0022]以粉紅粘帚霉全基因組DNA為模板進行PCR擴增獲得目的基因，其中PCR過程所用到的引物分別為:
[0023]正向引物5' ~CCGCTCGAGAGGATGGTGAAGATAATTCCCACTGTGC~3/
[0024]反向引物5' ~TGCTCTAGATCATCGCCAGTTATCATTAGTCGAG~3/
[0025]其中下劃線處分別表示XholUXball兩限制酶切位點。
[0026]PCR擴增條件為:98°C 30S ；98°C IOs ；72°C lmin30 個循環；72°C lOmin，所用的 DNA聚合酶為Phusion DNA聚合酶；采用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物。
[0027]用Xholl和Xball兩種限制性內切酶分別對PCR產物以及載體pGm進行酶切。運用膠純化試劑盒對這兩種酶切產物進行純化并用T4DNA連接酶連接上述兩個酶切產物，制成重組表達載體pGm-3440 (圖1)。將連接后的產物轉化大腸桿菌DH5a用氨芐青霉素進行選擇。
[0028]為確保正確，對若干個轉化子進行菌落PCR并進行測序。測序結果通過軟件(DNAMAN)與原序列比對顯示:粉紅粘帚霉中葡萄糖淀粉酶的基因序列為SEQ ID N0:2;其cDNA的序列為SEQ ID NO: 3，編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:1 ;多個克隆的測序結果都一致。經NCBI的blast比對發現,其基因序列與來源于Leptosphaeria maculans的葡萄糖淀粉酶基因具有62%的同源性,與來源于Fusarium oxysporum的葡萄糖淀粉酶基因具有58%的同源性。因此證明本發明所篩選到的葡萄糖淀粉酶基因為新的，與已知葡萄糖淀粉酶來源不同的新的等位基因。
[0029]使用質粒中量制備試劑盒(Axygen)從測序結果正確的陽性克隆中提取質粒。
[0030]實施例2:重組質粒轉化黑曲霉Gl囷株及驗證
[0031]吸取黑曲霉Gl孢子懸浮液于CMA平板中心(9cm培養皿)，待菌落長滿整個培養皿，切1/4大小的培養基于200mL CMA液體培養基中，在30°C、200rpm的條件培養14~16h。 [0032]用無菌的Miracloth濾布收集菌體,并用solutionA沖洗一次,在無菌條件下用棉簽將其轉移到40ml的裂解液中，在30°C、200rpm條件下裂解兩個小時，用顯微鏡觀察原生質體的形成情況。
[0033]用無菌的Miracloth濾布過濾上述裂解液,用兩個50ml無菌離心管收集原生質體并用solutionB沖洗定容使每管大約25ml。在2000rpm條件下離心5min棄去上清,用20mlsolutionB對沉淀再清洗沉淀兩次。將沉淀重懸浮于IOmLsolution B中，并用血球計數板對原生質體計數。將原生質體再次離心并棄去上清液，根據血球計數板計數結果，加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質體數目在I X IO7個/mL左右。
[0034]在冰上向預先冷卻的15ml離心管中加入100 μ L上述原生質體、10 μ L質粒DNA、12.5μ L solutionC冰浴20min。與此同時將預先配制好的上層試管MMSA融化并置于55°C水浴中。
[0035]取出冰浴中的15ml離心管，向其加入Iml solutionC、2ml solutionB并混勻后作為混合液。
[0036]向3個融化的上層麗SA試管中的每一個中加入Iml上述混合液混勻并立即倒于MMSA平板中，將平板在30°C培養箱中培養7-10d直到長出轉化子為止。
[0037]將長出的轉化子菌株接入到二次篩選培養基中培養直至長出黑色菌落。用試劑盒所給方法提取其基因組DNA并用上述PCR反應條件進行PCR擴增。通過膠回收與測序驗證，驗證結果正確的菌株即為陽性轉化子，并命名為ZL-1。
[0038]solutionA:2.5mLlM K2HPO4, 2.5mLlM KH2PO4,48.156g MgSO4,加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0039]solutionB:5mLlM Tris (ρΗ7.5)，2.77g CaCl2,109.32g 山梨醇，加入 dlH20 至終體積500mL，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0040]solutionC:250g PEG4000，2.77g CaCl2, 5mLlM Tris (pH7.5)，加入 dlH20至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0041]裂解液:將0.6g 裂解酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum, Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0042]MMSA 平板:0.59g 乙酰胺(Sigma) ,3.4g CsCl (Sigma) ,0.52g KCl，1.52gKH2P04,218.5g山梨醇，Iml微量元素(見下)，20g瓊脂，加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌后加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04。
[0043]MMSA 上層瓊脂試管:0.59g 乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl (Sigma)，0.52g KCl，1.52g KH2PO4, 218.5g山梨醇，Iml微量元素(見下)，IOg低熔點瓊脂糖，加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌后，在培養基未凝固時，加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04,之后立即分裝于無菌試管中，每管10mL。
[0044]微量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4.7Η20，8.8g ZnSO4.7Η20，0.4gCuSO4.5Η20，0.15g MnSO4.4Η20，0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20，0.2mL 濃 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0045]CMA平板:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白胨，15g瓊脂，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0046]CMA液體培養基:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白胨，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0047]二篩培養基:0.59g 乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl (Sigma)，0.52g KCl，1.52gKH2P04，Iml微量元素(見下)，20g瓊脂，加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌后加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04。
[0048]實施例3:陽性轉化子菌株的發酵驗證。
[0049]挑取上述的陽性轉化子菌株，接種于20mlTSB發酵培養基中在30°C，200rpm的條件下培養5d ;所得發酵液用8層紗布過濾，濾液在14000g條件下離心lOmin，收集上清液；將上清液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進行電泳。電泳圖如圖2。
[0050]TSB 發酵培養基:12g NaNO3,0.5g KCl, 1.5g KH2PO4, 2.05g MgSO4.7H20，3.5gNaH2PO4.H20，45g胰蛋白大豆肉湯，70g檸檬酸鈉，Ig吐溫80，ImL微量元素(見下)，加入dlH20至終體積700mL，高壓蒸氣滅菌后加入300mL用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的40%麥芽糖。
[0051]微量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4.7Η20，8.8g ZnSO4.7Η20，0.4gCuSO4.5Η20，0.15g MnSO4.4Η20，0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20，0.2mL 濃 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0052]實施例4:葡萄糖淀粉酶活測定
[0053]1、酶活測定的方法
[0054]甲、乙兩支50mL比色管，分別加入25mL的2%可溶性淀粉溶液和5mL的0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH4.6);于40±0.2°C的恒溫水浴中預熱5~lOmin。在甲管中加入酶制備液2.0mL搖勻并立即記時；反應Ih后，立即在甲、乙兩管各加0.2mL的20%氫氧化鈉溶液，立即搖勻并將兩管取出迅速用水冷卻；然后于乙管中補加酶制備液2.0mL(作為對照)。取兩管中上述反應液各5mL放入碘量瓶中，準確加入0.lmol/L碘液10mL，再加
0.lmol/L氫氧化鈉溶液15mL (邊加邊搖晃)，放置暗處15min,加入2mol/L硫酸2mL ;最后用0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至無色為終點。
[0055]酶活X = (A-B) XNX90.05Xn
[0056]其中:X-酶活力單位，μ /g (mL);
[0057]A—空白試驗消耗硫代硫酸鈉溶液的毫升數；
[0058]B—樣品消耗硫代硫酸鈉溶液的毫升數；
[0059]N—硫代硫酸鈉溶液的當量濃度；
[0060]η-稀釋倍數；
[0061]90.05—lmLlmol/L硫代硫酸鈉相當葡萄糖毫克數；
[0062]2、酶活測定[0063]依照上述方法，最終測得這種新型葡萄糖淀粉酶活高達292U/ml。
[0064]3、葡萄糖淀粉酶學特性測定
[0065]運用3，5_二硝基水楊酸(0吧)分光光度法在301:、401:、501:、601:、701:、801:條件下并以乙酸-乙酸鈉緩沖液在pH4.6條件下測得葡萄糖淀粉酶的活性。結果顯示這種新型葡萄糖淀粉酶最適溫 度在50°C左右(圖3)。
[0066]用同樣的方法在50°C條件下以磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖溶液在pH為3.0,4.0、
5.0,6.0,7.0,8.0條件下測得酶活。測量結果顯示這種新型葡萄糖淀粉酶的最適pH值為5左右(圖4)。
[0067]實施例5:葡萄糖淀粉酶轉糖實驗
[0068]取IOml液化淀粉，加入2ml上述搖瓶發酵的上清液，即葡萄糖淀粉酶，50°C，pH5條件下作用30分鐘后，測定反應液的DE值(還原性糖值)，達到85% ;作用I小時后，其DE值超過了 88%;作用2個小時后在進行測量發現DE值高達94%。實驗結果表明，本發明的葡萄糖淀粉酶能從糖鏈的非還原端高效分解α-1，4-糖苷鍵來水解出葡萄糖。因此，本發明篩選的葡萄糖淀粉酶，以及構建的重組表達工程菌可廣泛應用于淀粉糖工業。
【權利要求】
1.一種葡萄糖淀粉酶，其特征在于，所述的葡萄糖淀粉酶包含有: 1)氨基酸序列為SEQID NO:1的葡萄糖淀粉酶； 2)在I)中的氨基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個氨基酸得到的，具有I)中葡萄糖淀粉酶活性的酶。
2.一種基因，其特征在于，所述的基因用于編碼權利要求1所述的葡萄糖淀粉酶。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQID N0:2。
4.一種重組表達載體，其特征在于，所述的重組表達載體用于表達權利要求1所述的葡萄糖淀粉酶。
5.一種重組工程菌，其特征在于，所述的重組工程菌攜帶有權利要求4所述的重組表達載體。
6.如權利要求5的重組工程菌，其特征在于，所述的重組工程菌為黑曲霉。
7.權利要求1所述的葡萄糖淀粉酶在制備葡萄糖中的應用。
8.權利要求5所述的重組`工程菌在制備葡萄糖中的應用。
【文檔編號】C12R1/685GK103695389SQ201310718737
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月17日 優先權日:2013年12月17日
【發明者】王華明, 張亮 申請人:中國科學院天津工業生物技術研究所