一種耐高溫淀粉酶的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種來源于地衣芽孢桿菌的耐高溫淀粉酶，并通過構建黑曲霉工程菌高效表達所述淀粉酶，發酵酶活達1650U/mL。重組淀粉酶的最適作用pH為6.5，最適作用溫度為55℃，為耐高溫淀粉酶，可廣泛用于食品添加劑領域，尤其是啤酒生產領域。
【專利說明】一種耐高溫淀粉酶
[0001]【技術領域】
本發明屬于微生物工程【技術領域】，具體涉及一種耐高溫淀粉酶及其重組表達工程菌。【背景技術】
[0002]淀粉酶是指能水解淀粉、糖原和有關多糖中的O-葡萄糖鍵的酶類總稱，根據作用的方式可分為α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶廣泛分布于動物、植物和微生物。微生物的酶幾乎都是分泌性的。α -淀粉酶既可以作用于直鏈淀粉，也可作用于支鏈淀粉，無差別的切斷α-1，4_鏈。因此其特征是引起底物溶液粘度的急劇下降和碘反應的消失，最終產物在分解直鏈淀粉時以麥芽糖為主，此外，還有少量麥芽三糖及少量葡萄糖。另一方面，在分解支鏈淀粉時，除麥芽糖、葡萄糖外，還生成分支部分具有α-1，6_鍵的α-極限糊精。β_淀粉酶與α-淀粉酶的不同點在于從非還原性末端逐次以麥芽糖為單位切斷α-1，
4-葡聚糖鏈。主要見于高等植物中，但也有報告在細菌、牛乳、霉菌中存在。對于像直鏈淀粉那樣沒有分支的底物能完全分解得到麥芽糖和少量的葡萄糖。作用于支鏈淀粉或葡聚糖的時候，切斷至α-1，6_鍵的前面反應就停止了，因此，生產分子量比較大的極限糊精。
[0003]淀粉酶可廣泛應用于麥芽糖、糖漿、糊精等的生產，在紡織工業中，淀粉酶可催化織物上的淀粉漿料，由于淀粉酶的高效性及專一性，酶退漿的退漿率高，退漿快，污染少，產品比酸法、堿法更柔軟，且不損傷纖維。在酒精生產和釀酒工業中使用霉菌淀粉酶能有效提高糖化率，酒精出率和酶母的生長。淀粉酶還可應用于出來淀粉生產過程中的廢水，減輕對環境的污染。因此現在對淀粉酶的研究成為熱點。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提·供一種耐高溫淀粉酶及其應用。本發明通過將來源于地衣芽孢桿菌Cfeci77w5.Iicheniformis)的淀粉酶基因轉化入黑曲霉niger)中，構建得到了高效重組表達淀粉酶的工程菌株，為實現淀粉酶的規模化生產奠定基礎。
[0005]本發明的一方面提供了一種淀粉酶，所述的淀粉酶為:
a)氨基酸序列為SEQID NO:1的淀粉酶；
b)在a)中的氨基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個氨基酸得到的，具有I)中淀粉酶活性的酶。
[0006]本發明一方面提供了編碼上述淀粉酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2。
[0007]本發明還涉及上述淀粉酶在啤酒生產領域的應用。
[0008]一種酶組合物,包含上述淀粉酶。
[0009]本發明通過將地衣芽孢桿菌的淀粉酶基因導入黑曲霉宿主細胞中，構建了重組表達該基因的黑曲霉工程菌。所述黑曲霉工程菌能高效表達淀粉酶，發酵酶活達1650U/mL。重組淀粉酶的最適作用PH為6.5，最適作用溫度為55°C，為耐高溫淀粉酶，可廣泛用于食品添加劑領域，尤其是啤酒生產領域。利用本發明所述淀粉酶進行糊化，比傳統的麥芽糊化方法更簡單，原料液化效果好，麥汁組成合理，啤酒理化指標和口感質量都得到明顯改善，尤其是麥汁得率大幅度提聞。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1為本發明所述淀粉酶作用PH-相對酶活曲線；
圖2為本發明所述淀粉酶作用溫度-相對酶活曲線。
【具體實施方式】
[0011]本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發明限定于所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。
[0012]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術術語和科學術語具有本發明所屬領域的普通計數人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale etal.，2003)為技術人員提供了本發明中所使用的許多術語的一般性解釋。
[0013]除非另作說明，核酸是按5,至3,方向從左至右書寫；氨基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書寫。
[0014]如本文所用，術語“重組”當被用于指代細胞、核酸、蛋白或載體時，表示該細胞、核酸、蛋白或載體已通過導入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾。因此，例如，重組細胞是表達在天然(非重組)形式的該細胞中不曾發現的基因，或者表達天然基因。
[0015]術語“蛋白質”和“多肽”在本文中可以互換使用。本文使用氨基酸殘基的傳統的單字母或三字母代碼。
[0016]如本文所用，術語“基因”指參與生產多肽的DNA片段，包括編碼區之前和之后的區域，以及各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
[0017]術語“核酸”包括DNA、RNA,單鏈或雙鏈的，以及它們的化學修飾物。
[0018]術語“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互換使用。
[0019]術語“載體”指被設計用來將核酸導入一種或多種細胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭 載體、質粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。
[0020]術語“表達載體”表示包含DNA序列的DNA構建物，所述DNA序列被可操縱的連接于能夠影響該DNA在合適宿主中表達的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉錄的啟動子、可選的控制轉錄的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結合位點的序列、增強子以及控制轉錄和翻譯的終止的序列。
[0021]術語“啟動子”表示參與結合RNA聚合酶以啟動基因轉錄的的調控序列。啟動子可以是誘導型啟動子或組成型啟動子。
[0022]與另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比較這兩個序列時所述百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。[0023]由于遺傳密碼是簡并的，所以可以使用一種以上的密碼子來編碼特定的氨基酸，本發明包括編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0024]術語“宿主菌株”或“宿主細胞”是指表達載體或DNA構建物的合適宿主，所述表達載體或DNA構建物包含本發明的編碼脂肪酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優選地是絲狀真菌細胞。該宿主細胞可以是野生型絲狀真菌宿主細胞或者經遺傳修飾的宿主細胞。術語“宿主菌株”或“宿主細胞”指由絲狀真菌菌株細胞所產生的細胞核原生質體。
[0025]下面結合具體實施例對本發明進行詳細的描述。
[0026]實施例1淀粉酶基因的克隆
將地衣芽孢桿菌過夜培養，取1.5ml, 12000rpm離心I分鐘，除上清；加入200 μ I裂解緩沖液(配方為:60mM Tris-HCl，pH7.8，20mM Na-Ac, ImM EDTA, 1.5% SDS)，用移液器劇烈吹打；加入66 μ I 5Μ高氯酸鈉溶液混勻，12000rpm離心10分鐘，取上清；加入等體積苯酹抽提一次，12000rpm離心2分鐘,取上清；加入等體積異丙醇沉淀5分鐘，12000rpm離心5分鐘;70%乙醇洗滌兩次；最后將干燥的DNA溶于ddH20。
[0027]以上述提取的基因組總DNA為模板，利用引物進行PCR擴增。PCR擴增條件為95°C4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30個循環；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物。
[0028]將回收的擴增產物連接到pMD18T載體，得到的克隆載體命名為pMDT_Amy，送至北京華大基因研究中心進行測序分析，該擴增產物的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO: 2。通過NCBI Blast比對分析發現，該序列與地衣芽孢桿菌的淀粉酶序列相似性最高，為77%。
·[0029]實施例2表達載體的構建
以質粒pMDT-Amy為模板，利用引物進行PCR擴增，PCR擴增條件是95°C 4min ；94°C30S ；55°C 40S,72°C 1.2min 30 個循環；72°C 7min。凝膠回收擴增產物；RI 和 Not I雙酶切。對表達質粒PPIC9K也進行RI和Not I雙酶切；用T4連接酶把上述雙酶切產物4°C連接過夜。最后，把連接產物導入大腸桿菌BL21。相應的陽性克隆表達質粒命名為pPIC-Amyο
[0030]實施例3黑曲霉工程菌的構建
將表達質粒pPIC-Amy用Sal I酶切電泳鑒定后，經乙醇沉淀濃縮，測定DNA濃度，以3 μ g/μ L濃度稀釋質粒片段保存備用。制備黑曲霉GSl 15電轉化感受態細胞，最后重懸于
ImL預冷的電泳緩沖液中(配方為:lmM MgCl2, IOmM HEPES, 250mM蔗糖，pH 7.8)。在80μ L感受態細胞中加入5μ L線性化重組質粒；電轉化(條件為1500V、200Q、25yF);最后涂布于麗平板(麗培養基組分:1.34%YNB, 4X 10-5%生物素，0.5%甲醇)，挑選一個重組菌% Aspergillus niger Amy-1。
[0031]實施例4發酵和酶學性質測定
將黑曲霉工程菌Amy-1接種于5ml BMGY (培養基配方為:1 %酵母提取物，2%蛋白陳，1.34 % YNB, 4X10_5%生物素，1%甘油)，30°C培養過夜，離心收集菌體，把菌體加入50ml BMMY誘導培養基(培養基配方為:I %酵母提取物，2%蛋白陳，1.34 % YNB, 4X10_5%生物素，0.5%甲醇)，每12小時補加50 μ L甲醇，誘導培養5天，200rpm，離心5分鐘，取發酵液上清液，進行酶學性質和耐受性分析。經測定發酵液上清的酶活為1650U/mL，說明本發明構建的黑曲霉工程菌能高效重組表達淀粉酶。
[0032]、最適pH分析
用 pH 值分別為 2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的緩沖液進行稀釋測定，在溫度55°C條件下測定酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做pH-相對酶活曲線。結果如圖1所示，本發明所述淀粉酶的最適作用PH值為6.5，且在pH5.5-7.0范圍內能保持80%以上的酶活性。
[0033]、最適溫度分析
分別在 30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、7(TC，ρΗ5.5 的條件下測定酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做溫度-相對酶活曲線。結果如圖2所示，本發明所述淀粉酶的最適作用溫度為55°C，且在55-67°C范圍內能保持70%以上的酶活性。
[0034]實施例5淀粉酶在啤酒生產中的應用
在啤酒生產工藝中，用本發明的耐高溫淀粉酶替代麥芽，用于啤酒輔料液化，具體工藝過程如下:
1)在原料中加入0.5%耐高溫淀粉酶進行糊化，具體條件:50°C IOs ；95°C 25s ； 100°C
IOs ；
2)然后進行糖化，具體條件:37°C20s ；50°C 60s ；68°C 60s ； ;78°C過濾，大米比例為30-40%，淀粉酶添加量為12U/g大米，糊化pH7.5，料水比6:1，平均糖化時間45min。
[0035]利用本發明所述淀粉酶進行糊化，比傳統的麥芽糊化方法更簡單，原料液化效果好，麥汁組成合理，啤酒理化指標和口感質量都得到明顯改善，尤其是麥汁得率大幅度提聞。
【權利要求】
1.一種淀粉酶，其特征在于，所述的淀粉酶為: a)氨基酸序列為SEQID NO:1的淀粉酶； b)在a)中的氨基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個氨基酸得到的，具有I)中淀粉酶活性的酶。
2.編碼權利要求1所述淀粉酶的基因，其一種編碼核苷酸序列為SEQID NO: 2。
3.權利要求1所述的淀粉酶在啤酒生產中的應用。
4.一種酶組合物，所·述的組合物包含有權利要求1所述的淀粉酶。
【文檔編號】C12N9/28GK103849608SQ201310671003
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2013年12月10日 優先權日:2013年12月10日
【發明者】李佩佩, 張慧丹, 王華明 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司